藏羊肉宰后成熟过程中热休克蛋白27对肌原纤维蛋白及细胞凋亡酶的影响

孙金龙，师希雄*，黄 峰，韩 玲，陈 骋，岳建伟

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

藏羊是我国原始绵羊品种之一，分布广泛，在家畜中所占比重较大[1]。欧拉藏羊是藏羊的主要品种之一，主要生长在甘肃、青海、西藏等青藏高原的高海拔地区，特殊的生长环境造就了欧拉藏羊耐高寒、个体高大和生长较快速的特点[2]。并且欧拉藏羊肉味道鲜美、风味独特，具有良好的营养和食用品质[3]。但粗放的饲养方式同时也导致欧拉藏羊肉的纤维较粗，使得其肉嫩度较差，严重制约了肉品加工领域对欧拉藏羊肉的开发和利用。因此，改善欧拉藏羊肉嫩度、提高其食用品质，对欧拉藏羊肉的生产加工具有重要意义。

成熟是肌肉在宰后发生的重要生理性变化，在此过程中，肌肉的嫩度、色泽、保水性和风味均会得到改善[4]。其中，成熟过程对肌肉嫩度的影响最大。国内外研究报道指出，宰后成熟嫩化主要归因于内源性蛋白酶对肌原纤维蛋白的有限降解[5-7]。肉中肌原纤维蛋白的降解破坏了肌纤维结构，在很大程度上改善了肉的嫩度，进而提高了肌肉的食用品质[8]。但是，目前肉的成熟嫩化机理尚未明确。动物屠宰后，缺血、缺氧的应激状态不仅打破了肌肉的生理平衡，同时也刺激了小分子热休克蛋白的表达。热休克蛋白27（heat shock protein 27，Hsp27）是小分子热休克蛋白的一种，经常被用于小分子热休克蛋白对细胞凋亡的相关研究。

至今，哺乳动物中鉴别出数十种小分子热休克蛋白，它们普遍存在且在特殊组织内表达[9]。Hsp20、Hsp27和αβ-结晶蛋白等小分子热休克蛋白的表达水平均高于骨骼肌中其他蛋白质，被认为是心肌肌肉嫩化的潜在因素[10]。

Morzel等报道Hsp27可维持肌原纤维的稳定性，其表达量与牛肉的韧性呈负相关[11]。安格斯牛背最长肌中Hsp27表达量的下降有利于肌球蛋白和肌动蛋白的水解，进而提高了肌肉嫩度；且Hsp27在较嫩的肉样中含量较低[12]。然而，蛋白质组学的研究结果中Hsp27和嫩度的关系并不一致。Contreras-Castillo等指出，肌原纤维结合的小分子热休克蛋白可以作为μ-钙激活酶替代基质，并导致了肉的嫩化[13]。Hsp27与Caspase-3氨基末端的肽相互作用，为细胞凋亡效应酶提供了一种新的调控机制[14]。以上研究指出，Hsp27可能通过影响μ-钙激活酶和Caspase-3在心肌成熟过程中降低肌原纤维蛋白的稳定性，但其具体机制仍需进一步探究。

总之，Hsp27对肌原纤维蛋白和细胞凋亡酶的影响研究结果不一致。目前，关于欧拉藏羊肉宰后成熟过程中Hsp27的作用鲜有报道。因此，本实验利用Hsp27的抑制剂（KRIBB3）对欧拉藏羊背最长肌进行处理，在相应时间点取样，并对肌原纤维蛋白的降解特性和细胞凋亡酶活力进行测定，探讨Hsp27对肌原纤维蛋白降解及细胞凋亡酶活力的影响，以阐明Hsp27对羊肉的调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3～4 岁的欧拉藏羊6 只，体质量相近，生理成熟度等指标基本相似，采自甘南安多畜牧有限公司。参考国内外对动物福利的相关要求，屠宰方式严格按照国内标准操作进行，宰前保证藏羊健康状况良好，宰后热应激波动幅度较小，跟腱吊挂，从半胴体上取下整条背最长肌作为实验材料。

Caspase-3、Caspase-9酶活力试剂盒 北京麦瑞博生物科技有限公司；Hsp27抑制剂（KRIBB3）、Csapase-3重组蛋白、μ-钙激活酶（活力6 000 U）英国Abcam公司；蛋白Marker、Hsp27标准品、蛋白一抗、二抗 北京索莱宝科技有限公司；ECL发光试剂盒美国Thermo公司。

1.2 仪器与设备

TGL-16M高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；FA2004B电子天平 上海佑科仪器有限公司；HHS型数显式电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；iMark全自动酶标仪 美国Bio-Rad公司；XHF-D内切式匀浆机 宁波新芝生物科技股份有限公司；WH-600-LCD型电泳仪 北京市六一仪器厂；脱色摇床 海门其林贝尔仪器制造公司；凝胶成像系统美国UVP公司；-80 ℃低温冰箱 日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备

在屠宰后0.5 h内取下背最长肌，剔除脂肪和结缔组织膜，将0 d和体外模拟实验的样品切成5 g大小，用锡箔纸包裹迅速装入液氮中运回实验室，转入-80 ℃冰箱保存。实验组样品切成0.5 cm厚、大小均匀的薄片装入自封袋，按固液比1∶2注入提前准备好的30 mmol/L KRIBB3溶液，4 ℃下快速运回实验室并在4 ℃冰箱成熟，分别在成熟0.5、1、3、5 d时取样，并转移到-80 ℃冰箱保存。对照组样品切成0.5 cm厚、大小均匀的薄片装入自封袋中，存放在干冰中快速运回实验室转移到4 ℃冰箱成熟，分别在成熟0.5、1、3、5 d时取样，并测定Caspase-3、Caspase-9的活力以及免疫印迹等指标，待测样品转移到-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 体外实验

参考Ding Zhenjiang等的方法，略有改动[15]。取提取纯化后的肌原纤维蛋白（0.5 g）7 份，编号为1～7，以加入10 μg蒸馏水的1号样作为空白对照，2号样加入10 μg Caspase-3处理，3号样加入10 μg Caspase-3和6 μg Hsp27处理，4号样加入10 μg μ-钙激活酶处理，5号样加入10 μg μ-钙激活酶和6 μg Hsp27处理，6号样用6 μg Hsp27处理，7号样用10 μL 0.01 mol/L钙离子处理，1～7号样均在30 ℃下孵育2 h。对肌原纤维蛋白特性进行免疫印迹分析。

1.3.3 Caspase-3、Caspase-9活力测定

参考孙志昶等测定细胞凋亡酶活力的方法[16]。采用试剂盒测定Caspase-3、Caspase-9活力。准确称取待测肉样10 mg，加入150 μL裂解液，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆30 次。然后把匀浆液转移到1.5 mL离心管中，冰浴5 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，把上清液转移到预冷好的离心管中，在冰中保存待用。分别取Caspase-3、Caspase-9的检测缓冲液40 μL、待测样品50 μL，适当混匀后，分别加入Caspase-3、Caspase-9底物Ac-DEVD-pNA、Ac-LEHD-pNA 10 μL，混匀后，在37 ℃下孵育2 h。待颜色发生明显变化后测定其A405nm，通过标准曲线计算活力。

1.3.4 MFI测定

肌原纤维小片化指数（myofibrillar fragmentation index，MFI）测定参考贾青的方法并稍作改进[17]。准确称取待测肉样1 g，放入离心管中，加入10 mL MFI缓冲液（100 mmol/L KCl、1 mmol/L NaN3、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二胺四乙酸、20 mmol/L K3PO4），用匀浆机100 000 r/min冰浴匀浆30 s，1 000hg离心15 min。弃去上清液，加入8 mL MFI缓冲液，100 000 r/min冰浴匀浆15 s，1 000hg离心15 min。弃去上清液，再加入10 mL MFI缓冲液，置于均质机上振荡，将上述溶液倒入200 目筛，过滤沉淀，利用双缩脲法测定肌原纤维提取液内蛋白质量浓度，再用MFI缓冲液调整肌原纤维提取液蛋白质量浓度至0.5 mg/mL，在540 nm波长处测定吸光度，每个样品重复3 次。将平均值代入公式（1）计算MFI。

1.3.5 肌原纤维蛋白提取及质量浓度的测定

肌原纤维蛋白的提取采用Xia Xiufang等的方法并加以改进[18]。准确称取1 g肉样，加入10 倍体积920 mmol/L磷酸钾缓冲液（0.1 mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、2 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 6.80），13 000 r/min匀浆10 s，4 ℃、1 000hg离心10 min，弃上清液，沉淀用8 倍体积920 mmol/L磷酸钾缓冲液溶解后，4 ℃、1 000hg离心10 min，弃上清液，重复两次。沉淀用8 倍体积100 mmol/L KCl溶液溶解后，4 ℃、1 000hg离心10 min，弃上清液，重复两次。沉淀中加4 mL 25 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 6.25），用双缩脉法测定肌原纤维蛋白质量浓度，用牛血清白蛋白做标准曲线。

1.3.6 肌原纤维蛋白溶解性测定

肌原纤维蛋白溶解性的测定参考Agyare等的方法并加以改进[19]。按1.3.5节方法提取肌原纤维蛋白并测定其质量浓度。准确称取肌原纤维蛋白1 g，溶于50 mL质量分数为0.75%的氯化钠溶液中，用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液或0.1 mol/L的盐酸溶液调节至pH 5.5，并在60 ℃水浴锅中水浴加热30 min，4 ℃、6 000 r/min离心15 min，取上清液，采用双缩脲法测定离心前后上清液中肌原纤维蛋白质量浓度，按式（2）计算肌原纤维蛋白溶解性。

1.3.7 聚丙烯酰胺变性凝胶电泳和免疫印迹分析

参考黄峰[20]的方法，聚丙烯酰胺变性凝胶电泳使用质量分数4%浓缩胶，肌间线蛋白分离胶质量分数为10%，肌钙蛋白-T分离胶质量分数为12.5%。采用湿法转印将胶上的蛋白转到膜上，转印液含有20 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、体积分数15%甲醇溶液。转印条件为恒流200 mA，时间90 min。转印后的聚偏二佛乙烯膜膜用含质量分数5%脱脂奶粉的TBST溶液（500 mmol/L NaCl、质量分数0.05% Tween 20、30 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）室温封闭1 h。与一抗在4 ℃下反应过夜，然后用TBST溶液漂洗3 次，每次10 min，以去除未结合的一抗。然后把膜放入二抗中在室温、避光条件下反应60 min。在TBST溶液中漂洗3 次，每次10 min。使用ECL发光试剂盒在暗室中压片、曝光。

1.4 数据统计与分析

本实验的材料均进行3 组平行处理，用Origin 8.5软件绘制柱状图，并用SPSS Statistics 20.0软件进行误差分析，用Duncan’s法进行多重比较，P＜0.05为差异显着。

2 结果与分析

2.1 藏羊肉宰后成熟过程中Caspase-3、Caspase-9活力变化

图 1 Hsp27抑制剂对Caspase-3（A）、Caspase-9（B）活力的影响Fig. 1 Effect of Hsp27 inhibitor on caspase-3 (A) and caspase-9 (B) activity

由图1A可知，对照组中Caspase-3活力随着成熟时间的延长，整体呈现先上升后下降的趋势。0～0.5 d时，Caspase-3活力显着升高（P＜0.05）；在0.5 d时其活力达到最大值；0.5 d后其活力迅速降低。同时，在0.5～3 d内，实验组Caspase-3活力极显着高于对照组（P＜0.01）。本研究结果表明，Hsp27抑制剂处理后，藏羊肉中Caspase-3的活力显着升高，可能由于Hsp27通过调节细胞色素c的释放，能间接抑制Caspase-3的激活。此外，Voss等的研究发现Hsp27可以与Caspase-3的部分区域相互作用，并抑制Caspase-3激活所必需的部分位点[14]。由图1B可知，Caspase-9活力随着成熟时间的延长，整体呈现先上升后下降的趋势。0～0.5 d时，Caspase-9活力显着升高（P＜0.05）；在0.5 d时，其活力达到最大值；0.5 d后其活力缓慢降低。同时，在0.5～3 d内，对照组Caspase-9活力极显着低于实验组（P＜0.01）。Kemp等在宰后猪肉背肌中检测到了Caspase-3的原激活片段，并发现其活力约在宰后2 h达到最大值[21]；Samejima等研究发现，宰后猪肉在成熟过程中Caspase-3出现酶活力值高峰[22]；贾青研究发现，宰后12 h，牛背最长肌Caspase-3活力达到最高之后出现显着下降[17]。以上研究结果与本研究发现Caspase-3活力在0.5 d时达到最大值的结果基本一致。Huang Ming等研究发现，Caspase-3在肌肉蛋白降解中有积极作用[23]。本研究结果表明，Hsp27抑制剂能够明显抑制Caspase-3、Caspase-9活力，进而抑制肌原纤维蛋白降解，提示Hsp27能够通过抑制蛋白质降解从而达到维持蛋白质结构稳定性的作用。这与Ding Zhenjiang等[15]发现Hsp27重组蛋白能够抑制Caspase-3活力及肌原纤维蛋白降解，以及郭有锋等[24]发现热耐受后Hsp27的聚集可显着减轻缺血损害导致的细胞凋亡的结果一致。Rane研究发现Hsp27可通过调控Caspase-9活力抑制细胞凋亡[25]，这也与本研究中Hsp27抑制剂促进Caspase-9活力的结果一致。

2.2 藏羊肉宰后成熟过程中MFI的变化

图 2 Hsp27抑制剂对MFI的影响Fig. 2 Effect of Hsp27 inhibitor on myofibrillar fragmentation index

Huff-Lonergan等发现宰后肌原纤维蛋白降解与肌纤维小片化是成熟嫩化的重要因素[26]。由图2可知，MFI随着成熟时间的延长整体呈上升趋势。0～0.5 d时MFI变化较小；0.5 d时，实验组和对照组存在显着差异（P＜0.05）；0.5 d后，实验组和对照组差异极显着（P＜0.01）。表明Hsp27抑制剂能够促进成熟过程中蛋白的降解，促使MFI增加。同时，反映出Hsp27可以抑制肌原纤维小片化的发生。这与Noguchi等随着细胞凋亡程度的加深，肌原纤维小片化程度加剧的研究结果基本一致[27]。

2.3 藏羊肉宰后成熟过程中肌原纤维蛋白溶解性的变化

图 3 Hsp27抑制剂对肌原纤维蛋白溶解性的影响Fig. 3 Effect of Hsp27 inhibitor on myofibrillar protein solubility

由图3可知，随着成熟时间的延长肌原纤维蛋白溶解性增加。但在成熟0.5 d和1 d时，实验组样品的肌原纤维蛋白溶解性差异不显着；0 d和0.5 d时，对照组样品肌原纤维蛋白溶解性差异不显着。实验组样品在成熟0.5 d后肌原纤维蛋白溶解性极显着高于对照组（P＜0.01），这可能是由于Hsp27抑制剂促进了Caspase-3、Caspase-9的活力，进而加速了细胞凋亡，侧面反映出Hsp27能够维持肌原纤维蛋白的稳定性，抑制细胞凋亡发生。

2.4 藏羊肉宰后成熟过程中肌原纤维蛋白变化

图 4 Hsp27抑制剂对肌原纤维蛋白降解的影响Fig. 4 Effect of Hsp27 inhibitor on myofibrillar protein degradation

由图4可知，随着成熟时间的延长，肌原纤维蛋白中的肌间线蛋白和肌钙蛋白-T免疫印迹条带明显变浅，表明Hsp27抑制剂的添加促进了肌间线蛋白和肌钙蛋白-T的降解，提示Hsp27能够抑制肌间线蛋白和肌钙蛋白-T的降解。这与Ding Zhenjiang等[15]的研究结果一致；同时，也与Lomiwes等[10]发现热休克蛋白能够在外源αβ-晶状体蛋白与μ-钙激活酶作用下维持肌原纤维蛋白稳定性的结果基本一致。肌原纤维的降解在宏观表现为肉嫩度改善、汁液增多、风味改善等，Bernard等研究发现Hsp27在夏洛莱牛胸部肌肉中表达量的下调能够改善肉的嫩度、多汁性和风味[28]。Balan等[29]在宰后牛肉中发现Hsp27降解，且与肌间线蛋白和肌钙蛋白-T的降解显着相关，并推测降解后的Hsp27丧失了其对肌原纤维蛋白的保护功能，从而提高肌原纤维蛋白的水解，这与本实验结果一致。

2.5 Hsp27对肌原纤维蛋白的体外降解

由图5可知，2、4号样品条带明显比1号样品淡，表明Caspase-3和μ-钙激活酶均能使肌钙蛋白-T和肌间线蛋白降解；比较2号样品与3号样品，发现Hsp27能够抑制Caspase-3对肌钙蛋白-T和肌间线蛋白的降解；比较4号样品与5号样品，发现Hsp27能够抑制μ-钙激活酶对肌钙蛋白-T和肌间线蛋白的降解；比较1号样品与5号样品，发现Hsp27能够维持肌间线蛋白和肌钙蛋白-T的稳定性；比较1号样品与7号样品，发现Ca2+能够促进肌钙蛋白-T和肌间线蛋白的降解；与1号样品比较，6号样品条带更宽、颜色更深，表明Hsp27能够抑制肌间线蛋白和肌钙蛋白-T的降解。综上所述，Hsp27的添加抑制了Caspase-3和μ-钙激活酶对肌钙蛋白-T和肌间线蛋白的降解。这与Lomiwes等发现Hsp27在肉中表达量的下降有利于肌动蛋白与肌球蛋白的水解，进而导致肉嫩度增加，且Hsp27在较嫩的肉样中含量较低的研究结果一致[10]。Morzel[11]和Ding Zhenjiang[15]等研究发现，Hsp27可维持肌原纤维蛋白的稳定性，抑制其降解，并且其表达量与牛肉的韧性呈负相关；Della等[30]研究表明，小分子热休克蛋白可以保护肌钙蛋白-T免受降解，其表达与嫩度呈负相关。这与本实验研究中Hsp27抑制Caspase-3和μ-钙激活酶对肌间线蛋白和肌钙蛋白-T降解的结果一致。

图 5 体外肌原纤维蛋白降解变化Fig. 5 In vitro changes in myofibrillar protein degradation

3 结 论

Hsp27能够抑制Caspase-3和μ-钙激活酶对肌间线蛋白和肌钙蛋白-T的降解；同时，Hsp27通过影响Caspase-3和Caspase-9的活力来参与宰后成熟过程。Hsp27能够通过抑制Caspase-3和Caspase-9的活力来抑制肌原纤维小片化的发生以及肌间线蛋白和肌钙蛋白-T的降解，从而保持了肌原纤维的完整性，抑制了肌肉在宰后成熟过程中的嫩化。