叶冬青，郑笑天，李 莹，段长青,，刘延琳,
（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，农业部葡萄酒加工重点实验室，北京 100083）
挥发性硫化物（volatile sulfur compounds，VSCs）具有强挥发性、高活性和低阈值的特点。目前已报道的葡萄酒中存在的VSCs多达四十多种，从化合物的结构可分为硫醇、硫醚、多硫化物、硫酯和含硫杂环化合物五大类[1]。VSCs对葡萄酒风味的影响具有多样性。硫化氢、甲硫醇、乙硫醇等极易挥发的硫醇类物质，被认为是形成还原味（臭鸡蛋味）的主要来源物质，其对存在还原缺陷的葡萄酒起决定性的作用[2-4]。部分VSCs对葡萄酒香气的影响取决于其浓度，如二甲硫醚（dimethylsulfide，DMS）是葡萄酒中被广泛关注的硫醚类物质，低浓度时常带来芦笋、玉米和糖蜜的气味[5]；而高浓度时，DMS则可破坏葡萄酒的香气，如在一些被描述为具有“绿橄榄”气味的葡萄酒中，DMS质量浓度一般高于 100 μg/L[6]，另外如果葡萄酒陈酿过程中存在较高质量浓度的DMS，则还容易出现金属或者温桲等异味[2]。
葡萄酒酿造过程中的各个阶段都会产生VSCs[7-9]，相比于发酵阶段存在的CO2排放或倒罐等通气方式可以适当去除硫化氢引起的早期感官缺陷，陈酿过程中VSCs会形成更稳定的含巯基、酯类[10]或非游离态含硫化合物[11]，从而使通气[3]或硫酸铜处理[12]失效，且曝气处理可能造成其他香气物质的损失[13]，因而关注陈酿过程中VSCs的影响因素具有重要现实意义。Nguyen等[14]在研究聚乙烯罐微氧陈酿的过程中发现DMS和硫酯类物质含量不受氧气的影响。McCord[15]的研究表明在不锈钢罐中陈酿的酒添加橡木制品能显着降低DMS含量。Ferreira等[2]则对比了不同溶氧量、游离SO2、pH值及温度等工艺条件对波特酒中VSCs的影响，发现温度和溶氧是影响VSCs最大的因素。以上研究探讨了不同陈酿条件下，葡萄酒中VSCs含量的变化，为深入研究不同酿造工艺条件对葡萄酒质量的影响积累了有效信息，然而由于葡萄酒基质较为复杂，VSCs陈酿过程中的变化机理仍然难以证实。
近年来，随着我国葡萄酒市场规模不断扩大、产业升级的需求，橡木桶被越来越多地运用到陈酿中。简单而言，橡木桶产地即板材的来源，由于不同树种结构和成分的不同，每一种橡木赋予葡萄酒的风味也不一样。目前广泛用使用的3 个橡木品种分别为：主要来源于法国等中欧地区的岩生栎（Quercus petraea）和夏栎（Quercus robur），俗称法国橡木；来源于美洲的白栎（Quercus alba），即美国橡木[5]。它们的主要区别在于含有的重要浸出物如总酚、鞣花单宁及橡木内酯等物质含量及氧通透率不同[16]。橡木桶的烘烤度指对板材进行烘烤以达到弯曲定型，同时改善木材风味的目的。烘烤的时间和温度结合板材自身的化学组成决定了既定的橡木桶风格[17]。目前不同类型的橡木桶对葡萄酒中挥发性物质影响的研究多集中于橡木内酯、酚醛树脂、呋喃等物质[18-19]。尽管普遍认为橡木桶的微氧环境可以抑制VSCs的形成[5]，然而目前尚鲜见橡木桶陈酿对VSCs影响的研究报道。
VSCs作为葡萄酒缺陷中还原味的主要贡献者，对葡萄酒风味的影响已成为当今的研究热点。虽然随着近年来分析仪器及相关分子技术的快速升级，研究者在VSCs的产生途径及基因调控等方面的研究均取得了较大进展，但仍缺乏橡木桶陈酿与葡萄酒中VSCs形成的相关性研究，特别是除硫化氢之外的其他VSCs，几乎未被关注到。另外也鲜见针对我国葡萄酒中含硫风味物质的相关研究，导致缺乏对葡萄酒酿造各个过程中还原味缺陷形成原因的深入了解，而使企业生产的葡萄酒中经常出现硫异味的现象，制约我国葡萄酒行业的发展。
本实验以我国新疆产区的赤霞珠原酒为材料，研究3 个产地（美国、匈牙利及法国）及两种烘烤度（轻度和中度）的橡木桶陈酿对葡萄酒中VSCs的影响，获得葡萄酒在不同橡木桶陈酿过程中VSCs的变化规律，以期为酿酒师的陈酿工艺提供参考，同时对预测葡萄酒潜在的还原味风险及制定瓶贮期的管理措施有重要的参考意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
赤霞珠原酒来自2012年新疆玛纳斯产区（44°18’ N，86°24’ E），按照酒厂传统工艺完成了乙醇发酵和苹乳发酵。其基本理化指标如下：还原糖2.84 g/L（以葡萄糖计），可滴定酸5.94 g/L（以酒石酸计），pH 3.5，乙醇体积分数13.5%。
硫化物的标样分别购自美国Sigma-Aldrich公司、瑞士Fluka公司及北京百灵威科技公司，各化合物的纯度均大于98%。硫化物的相关名称及缩写见表1。
所有橡木桶均由烟台戴普瑞斯公司提供。
表 1 葡萄酒陈酿过程中VSCs的变化范围Table 1 Ranges of volatile sulfur compounds contents in wines during aging
1.2 仪器与设备
7890A气相色谱（gas chromatography，GC）仪结合H9261火焰光度检测器（flame photometric detector，FPD） 美国Agilent Technologies公司；HP-INNOWAX毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国J&W Scientific公司；顶空固相微萃取（headspace-solidphase micro-extraction，HS-SPME）（装置包括操作平台、磁力搅拌器、SPME进样手柄、SPME萃取纤维） 美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 葡萄酒的陈酿
原酒分别灌入6 种类型的橡木桶进行陈酿（通过恒温恒湿空调机控制酒窖的温度为14～16 ℃，相对湿度70%～80%）。225 L全新橡木桶来自3 个产地： 1）美国密苏里Missouri（USA），橡木品种为白栎，树龄150～200 a；2）匈牙利（HU），橡木品种为夏栎，树龄150～200 a；3）法国中部（FR），橡木品种为岩生栎，树龄约160 a。每个产地橡木桶均有2 种烘烤度，分别为中度烘烤（MT，175 ℃烘烤15 min）和轻度烘烤（LT，150 ℃烘烤15 min）。所有橡木桶纹理均为细纹理，即橡木板材纹理间的平均间距为1～3 mm。分别以MT_USA、LT_USA、MT_HU、LT_HU、MT_FR及LT_FR表示这6 种类型的橡木桶。以100 L不锈钢贮酒罐（SST）作为对照组，每种处理设置2 个重复，陈酿时长1 a。陈酿过程中每2 个月添酒以补充因挥发而造成的不满桶现象，并监测游离SO2的质量浓度，并补充至 30 mg/L。原酒入桶后每3 个月取样1 次，每桶（罐）取两瓶330 mL样品于-20 ℃冻存待分析。
1.3.2 VSCs的测定
陈酿样品中16 种VSCs的测定采用本实验开发的SPME-GC/FPD方法[20]。在15 mL的棕色样品瓶中加入5.00 mL样品、1.25 g MgSO4·7H2O和磁力转子后，迅速用带有聚四氟乙烯隔垫的样品瓶盖拧紧后置于磁力搅拌加热台上，恒温40 ℃，转速500 r/min，平衡10 min后插入已活化的萃取纤维（50/30 μm×2 cm DVB/CAR/PDMS），顶空萃取50 min，然后将已吸附挥发性物质的萃取头插入GC的进样口，250 ℃热解吸8 min。色谱分离升温程序为：初温40 ℃，保持5 min，然后以8 ℃/min 升温至150 ℃，再以2℃/min升温至180 ℃，最后以 15 ℃/min升温至220 ℃，保持5 min。载气为高纯氮气，采用不分流模式进样。检测器温度为250 ℃；氢气流速为50 mL/min；空气流速为60 mL/min。根据标准品的保留时间进行VSCs的定性。定量采用外标法。
1.4 数据处理
采用Microsoft Office Excel 2010进行数据统计，Origin 8.5进行绘图。使用SPSS 20.0进行单因素方差分析（ANOVA），Duncan新复极差法进行差异显着性分析。采用MetaboAnalyst 3.0进行聚类分析[21]。
2 结果与分析
2.1 橡木桶陈酿过程检测物质筛选
如表1所示，在本实验检测的16 种目标物中，DMTh、DEDS、ME、PMTE、ETP、MTB及BT共7 种物质在所有的样品中均未检出，MTPA和MMTP在部分样品中检出但未达到定量限。另外7 种物质（DMS、MTA、ETA、MTE、2MTHF、EMTP、MTP）则存在于陈酿的各个阶段，将重点论述这7 种物质在橡木桶陈酿过程中的变化。
2.2 DMS含量的变化
图 1 不同处理酒样陈酿过程中DMS的变化Fig. 1 Evolution of DMS content in wines during maturation in different oak barrels versus in stainless steel tanks
如图1所示，随着陈酿的进行，DMS逐渐累积。和原酒相比，在经过12 个月的陈酿后，所有酒样中DMS的增幅在61%～112%之间，这与研究者的报道一致[2,22-23]。陈酿过程中，葡萄酒中非挥发性的前体物（如S-甲基甲硫氨酸）会通过化学作用逐渐转化为DMS，所以随着陈酿的进行，DMS会不断累积[24]。
从整体上看，本实验中DMS含量在不同橡木桶中的变化趋势较为一致，而在不锈钢罐中的波动范围较大。方差分析结果表明不同处理之间，DMS含量在陈酿3 个月时的差异最明显（P＜0.001），其中匈牙利橡木桶酒样中DMS含量显着低于其他产地的橡木桶及不锈钢罐，然而这种差异并没有在后续的陈酿中继续维持。陈酿6 个月时，各处理之间的差异不显着（P=0.06）。当陈酿进行了9 个月后，各个类型橡木桶陈酿中DMS含量均显着低于不锈钢罐的陈酿，说明橡木桶陈酿不利于DMS的积累。
尽管有研究认为，DMS在微氧陈酿[14-15]或者瓶贮时[27]并不受氧气含量的影响，但是橡木桶中陈酿的葡萄酒除接触通过微孔进来的氧气之外，也和板材中的物质相互作用，可能会通过物理或者化学反应形成一些新的物质[18]， 而这些物质可能会抑制DMS前体向DMS的转化，或者促进了DMS的裂解，相关机理仍需进一步研究。在McCord[15]的研究中，和无添加的赤霞珠葡萄酒的微氧陈酿相比，所有添加了橡木成分的葡萄酒中DMS含量均显着降低，这与本实验的结果较为一致。
2.3 硫醚醇（酮）类化合物含量的变化
MTP、2MTHF和MTE是葡萄酒中报道较多的硫醚醇（酮）类物质，它们的形成与发酵过程中微生物对甲硫氨酸的代谢密切相关[25]，通常会给葡萄酒带来花椰菜、煮卷心菜、金属或者法国豆等气味。
图 2 不同处理酒样陈酿过程中MTP（A）、2MTHF（B）和 MTE（C）的变化Fig. 2 Evolution of MTA (A), 2MTHF (B) and MTE (C) content in wines during maturation in different oak barrels versus in stainless steel tanks
MTP作为葡萄酒中含量最丰富的VSCs，被认为是由酵母引起的葡萄酒还原缺陷的主要物质[28]，其在葡萄酒中的阈值为500 μg/L，某些具有硫异味的酒样中，MTP质量浓度可高达5 mg/L[29]。如图2A所示，本实验所用原酒的MTP含量已超过其阈值，但是在陈酿过程中，MTP含量变化整体呈下降的趋势，在9 个月达到最低值后略有回升。不同橡木桶陈酿葡萄酒中MTP的变化模式基本一致。在3 个月时，不锈钢罐葡萄酒中MTP含量略有上升，且显着高于橡木桶中（轻烘烤的法国桶除外）含量。在6 个月时，美国桶和匈牙利桶葡萄酒中的MTP含量显着低于轻烘烤法国桶。9 个月时，只有不锈钢罐葡萄酒中MTP含量显着低于中烘烤匈牙利桶，其他处理之间差异不显着；而陈酿12 个月时，所有橡木桶陈酿葡萄酒中MTP含量均显着低于不锈钢罐，且其在匈牙利和法国的橡木桶中含量最低，说明经过1 a的陈酿，橡木桶可以有效降低葡萄酒中MTP含量。
2MTHF在葡萄酒中的阈值为250 μg/L，经常被描述为具有金属或者天然气的气味[26]。本实验中，所有样品中2MTHF含量均远低于其阈值。随着陈酿的进行，2MTHF含量逐渐降低，各橡木桶中的变化趋势较为一致，而在不锈钢罐陈酿中下降的幅度较小，且在各个时间点均显着高于橡木桶陈酿中含量。不同陈酿时间下，各处理的差异显着性分析如图2B所示。在3 个月时，匈牙利橡木桶葡萄酒中2MTHF含量显着低于其他橡木桶。值得注意的是在该时间点，各产地轻度烘烤处理的橡木桶中2MTHF含量都低于中度烘烤的橡木桶。然而这种差异在后续的陈酿中并没有保持。在陈酿12 个月时，中度烘烤美国桶及轻度烘烤匈牙利桶葡萄酒中2MTHF含量要显着低于其他处理。
从图2C可知，随着陈酿的进行，MTE先逐渐上升，在3 个月或6 个月时达到最大值，然后下降。在3 个月时，中度烘烤橡木桶陈酿的葡萄酒中MTE含量显着低于轻度烘烤的橡木桶陈酿，3 个产地橡木桶的规律一致。而在6 个月时，匈牙利橡木桶陈酿酒表现为轻度低于中度的，但是另外2 个产地的处理依然保持。陈酿结束后，匈牙利桶葡萄酒中MTE含量相对更高。
2.4 硫酯类化合物含量的变化
如图3A所示，MTA含量随着陈酿的进行，整体呈下降的趋势。陈酿3 个月时，匈牙利橡木桶中葡萄酒的MTA含量显着低于其他处理，随后有一定幅度的上升，而其他处理样品中MTA含量在陈酿3 个月时最高。经过12 个月的陈酿，所有橡木桶陈酿酒中MTA含量均显着低于不锈钢罐陈酿酒。
如图3B所示，ETA含量随着陈酿的进行，整体呈上升的趋势。陈酿12 个月时，轻烘烤法国橡木桶中葡萄酒的ETA质量浓度更低。
EMTP含量在陈酿的过程中表现为先上升后下降的趋势（图3C）。与MTA含量的变化较为相似，且在3 个月时，匈牙利橡木桶中陈酿酒的MTA含量显着低于其他处理条件。陈酿12 个月后，除了不锈钢罐陈酿酒中MTA含量显着高于原酒（增幅达19.93%）外，其他橡木桶陈酿酒中MTA含量变化不大。
图 3 不同处理酒样陈酿过程中MTA（A）、ETA（B）和 EMTP（C）的变化Fig. 3 Evolution of MTA (A), ETA (B) and EMTP (C) contents in wines during maturation in different oak barrels versus in stainless steel tanks
MTA、ETA及EMTP均为硫酯类化合物，其中MTA和ETA可能是发酵过程中由硫醇与乙酰辅酶A反应生成的[25]。 在本实验所有样品中，以上3 种化合物的质量浓度均在10 μg/L之下，远低于它们各自的阈值（在50～180 μg/L之间）[1]。虽然含量不高，但酯类物质会在陈酿过程中因化学平衡因素而发生水解，生成乙酸和相应的硫醇类化合物[23]。而一般情况下，硫醇的阈值较低，特别是甲硫醇和乙硫醇，其在葡萄酒中的阈值仅分别为0.3 μg/L和1.1 μg/L[30]。这也是有些葡萄酒在罐装时并没有不良风味，但是在开瓶时却会出现异味的原因。因而关注硫酯类化合物在陈酿过程中的变化具有重要的现实意义。
2.5 影响陈酿过程中VSCs变化的因素
本实验研究了赤霞珠葡萄酒中VSCs在6 种类型橡木桶及不锈钢罐陈酿中含量的变化规律。对存在于所有样品中的7 种VSCs进行多因素方差分析，考察陈酿时间、橡木桶产地及烘烤度3 个因素及其两两交互的影响，结果如表2所示。陈酿时间对7 种VSCs都有极显着影响，说明在一定程度上可以通过控制桶贮时间调控VSCs含量。橡木桶产地对MTA、2MTHF、MTP和EMTP存在显着性影响，烘烤度仅对MTE有显着影响。
表 2 不同因素对陈酿过程中VSCs影响的方差分析Table 2 Multi-way ANOVA of the effect of different variables on VSCs during wine aging
图 4 不同处理酒样陈酿过程中VSCs的聚类分析Fig. 4 Hierarchical clustering of VSCs in wines during maturation in different oak barrels versus in stainless steel tanks
为更加直观和清晰地反映不同橡木桶陈酿对葡萄酒中VSCs的影响，采用MetaboAnalysis 3.0进行层次聚类分析，结果如图4所示。各类处理基本按照陈酿时间分成了两大类，3～6 个月中大部分VSCs含量更高，而9～12 个月中大部分物质含量下降，说明陈酿时间是影响VSCs含量变化的最大因素。在化合物的聚类上，DMS和ETA聚为一类，其他化合物则聚在一起。从整体上看，来自匈牙利桶酒样之间的距离更短，这些样本中VSCs含量也更低，特别是在陈酿3 个月和6 个月时。因此，如果就VSCs方面考虑，在进行短期陈酿的葡萄酒中，可以使用匈牙利橡木桶。
3 结 论
本实验研究了不同类型橡木桶（产地、烘烤度）陈酿工艺对葡萄酒中VSCs形成的影响，发现在葡萄酒的陈酿过程中，时间是影响VSCs含量的最显着因素，所有检测到的VSCs均受到影响。橡木桶产地对MTA和2MTHF有极显着的影响；烘烤度仅对MTE有影响，最大的差异出现在陈酿3 个月时，中度烘烤橡木桶中葡萄酒的MTE含量显着低于轻度烘烤。在短期（3～6 个月之内）的陈酿中，匈牙利橡木桶陈酿的葡萄酒中VSCs含量更低。不同VSCs在陈酿中的变化规律不同：DMS和ETA随着陈酿的进行逐渐累积，在陈酿12 个月后，增幅分别达61%～112%和43%～82%，而其他VSCs均表现为下降或变化不大的趋势。1 a的陈酿结束时，橡木桶陈酿酒中大部分VSCs（DMS、MTA、2MTHF、MTP、EMTP）含量都显着低于不锈钢罐，说明橡木桶的陈酿环境有利于VSCs的降低。本研究结果评估了不同类型橡木桶陈酿对葡萄酒潜在还原味的影响程度，为全面评价其在酿酒工业中的运用提供了理论基础，同时也为企业决策者和酿酒师的工艺选择提供参考。
