汤陈鹏，吕 峰*，王蓉琳
（福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002）
孔石莼（Ulva pertusa）又称海菠菜、海条等，是一种隶属于石莼科的大型绿藻；其风味鲜美、营养丰富，具有清热解毒、软坚散结等功效[1]。孔石莼多糖是孔石莼中的主要生物活性物质[2]，有关研究表明，孔石莼多糖具有降血糖[3]、抗氧化[4]、降血脂[5]、抗肿瘤[6]等多种生物活性。
锌是人体必需的微量元素之一[7]，在体内酶和受体功能的调节中起着重要的作用[8]。缺锌可导致人体营养不良、皮肤炎症、免疫力低下等一系列症状。近年来，国内外研究表明，将天然多糖与锌进行络合改性制备得到多糖锌络合物，与常见的无机补锌剂相比，其生物利用率高、副作用小，且同时兼具多糖与锌的生理功能，具有广阔的应用前景[9]。目前已见报道的多糖锌有酵母多糖锌[10]、夏枯草多糖锌[11]、竹荪多糖锌[12]、大米胚芽多糖锌[13]、金针菇多糖锌[14]等。
本研究以实验室自制的孔石莼多糖为参照，对孔石莼多糖锌络合物的结构与体外降血糖活性进行表征与探究，以期为孔石莼资源的高值化利用和新型多糖补锌剂的开发提供一定的理论参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
孔石莼多糖、孔石莼多糖锌（锌质量分数10.24%），均为福建农林大学食品科学学院保鲜基地实验室自制[15]。
α-葡萄糖苷酶（比活力50 U/mg）、α-淀粉酶（猪胰腺，比活力10 U/mg）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）上海源叶生物科技有限公司；硫酸、刚果红、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、可溶性淀粉、苯酚、氢氧化钠、亚硫酸氢钠、酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）均为分析纯。
1.2 仪器与设备
BSA223S分析天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；PHB-3 pH计 上海三信仪表厂；SYNERGY酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；HP-INNOWAX毛细管色谱柱、5500原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）、7890A气相色谱仪 美国Agilent公司；OHpak SB-806M HQ凝胶色谱柱 日本Shodex公司；DAWN HELEOS-II多角度激光光散射检测器、OPtilab rex示差折光检测器 美国Wyatt技术公司；UV2600紫外-可见分光光度计 日本岛津仪器设备公司；Nicolet IS50傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Fisher科技公司；X’ pert3 and Empyrean X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）仪 荷兰Panalytical公司；Nova NanoSEM 230场发射扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM） 美国FEI公司。
1.3 方法
1.3.1 孔石莼多糖及其锌络合物的理化性质及结构表征
1.3.1.1 孔石莼多糖的单糖组成分析
采用气相色谱-质谱联用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）仪对孔石莼多糖的单糖组成进行分析，样品的酸解糖腈乙酰化衍生反应参考吕明霞[16]的研究。色谱条件为色谱柱：HP-INNOWAX（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；载气：N2；程序升温：起始温度190 ℃，2 ℃/min升至240 ℃后保持8 min，再以10 ℃/min升至260 ℃，保持2 min。质谱条件为：电子轰击电离（70 eV），离子源温度200 ℃，接口温度250 ℃，扫描范围：m/z 30～600。
1.3.1.2 总糖质量分数测定
孔石莼多糖及其锌络合物总糖含量的测定参考冯学珍等[17]的苯酚-硫酸法，并略作修改。绘制葡萄糖的标准曲线，并计算得到回归方程，y＝0.005 9x+0.025 5（R2＝0.992 8），其中x为葡萄糖含量，y为溶液吸光度。
分别量取孔石莼多糖及其锌络合物样液2.0 mL，加入质量分数6%的苯酚溶液1.0 mL、浓硫酸5.0 mL，充分混匀，静置冷却30 min后，于490 nm波长处测定溶液的吸光度，根据葡萄糖标准曲线与吸光度计算得到两者的总糖含量。
1.3.1.3 凝胶渗透色谱-多角度激光光散射-示差检测器联用法分析
采用凝胶渗透色谱-多角度激光光散射-示差检测器体系（gel permeation chromatography-multi-angle laser light scattering-refractive index，GPC-MALLS-RI）对孔石莼多糖及其锌络合物的分子特征参数进行检测[18-19]。色谱条件为色谱柱：OHpak SB-806M HQ；流动相：0.1 mol/L NaCl；流速：0.5 mL/min；进样量：200 μL；样品质量浓度：1 mg/mL。
1.3.1.4 刚果红实验
采用刚果红实验分析孔石莼多糖及其锌络合物的螺旋构象[20]。将孔石莼多糖及其锌络合物分别配制成质量浓度为1 mg/mL的待测样液，分别与等体积的80 μmol/L刚果红溶液混匀后，加入1 mol/L NaOH溶液，梯度调节混合溶液中NaOH的浓度为0～0.50 mol/L，浓度梯度为0.05 mol/L，并测定各个NaOH浓度下混合溶液的最大吸收波长；空白对照以相同体积的蒸馏水取代待测样液，配制同样浓度NaOH的刚果红溶液，并测定其最大吸收波长。
1.3.1.5 紫外-可见光谱分析
分别称取适量孔石莼多糖及其锌络合物样品粉末，均配制成1 mg/mL的溶液，采用紫外-可见分光光度计进行扫描，对两者的结构特征进行初步表征，扫描范围为200～800 nm[21]。
1.3.1.6 傅里叶变换红外光谱分析
分别称取2 mg孔石莼多糖及其锌络合物样品粉末，与适量溴化钾粉末混合、研磨并压制成薄片，使用傅里叶变换红外光谱仪在400～4 000 cm－1范围内进行扫描[22]，探究孔石莼多糖及其锌络合物的官能团特征。
1.3.1.7 XRD分析
采用XRD仪研究孔石莼多糖及其锌络合物的结构状态[23]。XRD条件为：管压45 kV，管流40 mA，阳极为Cu靶，最小步长0.001°，发散狭缝0.76 mm，扫描速率5°/min。
1.3.1.8 SEM观察
分别称取一定量的孔石莼多糖及其锌络合物样品粉末，粘着于样品台上，置于真空喷镀仪内镀导电膜，使用SEM对孔石莼多糖及其锌络合物的表面形貌进行观察[24]。
1.3.1.9 AFM观察
分别配制质量浓度为10 μg/mL的孔石莼多糖及其锌络合物溶液，各取5 μL样液滴于新剥离的云母片表面，静置，待其风干后采用AFM通过轻敲模式对两者分子的微观形貌进行观测[25]。
1.3.2 孔石莼多糖锌体外降血糖活性测定
1.3.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制能力测定
参考陈浩[26]的实验方法，稍作修改。取孔石莼多糖及其锌络合物分别配制成质量浓度依次为5、10、15、20、25 mg/mL的待测样液；采用100 mmol/L、pH 6.8的磷酸钠缓冲液分别配制5 mmol/L的PNPG溶液与0.1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液。分别移取50 μL待测样液于96 孔板孔中，各加入50 μL PNPG溶液，于37 ℃下温孵10 min，各加入50 μL α-葡萄糖苷酶溶液，置于酶标仪中37 ℃反应30 min后，于405 nm波长处测定其吸光度A1。以等体积蒸馏水取代待测溶液，测定其吸光度A0；以等体积磷酸钠缓冲液取代α-葡萄糖苷酶溶液，测定其吸光度A2，以等体积蒸馏水和磷酸钠缓冲液分别取代待测溶液和α-葡萄糖苷酶溶液，测定其吸光度A3。用式（1）计算抑制率。
1.3.2.2 α-淀粉酶抑制能力测定
采用DNS比色法[27]进行检测，并略作修改。将孔石莼多糖及其锌络合物分别配制成质量浓度为5、10、15、20、25 mg/mL的待测样液；采用25 mmol/L、pH 6.9的磷酸盐缓冲液分别配制10 U/mL的α-淀粉酶溶液和质量分数1%的可溶性淀粉溶液。向各试管中分别加入300 μL不同质量浓度的待测溶液及300 μL的α-淀粉酶溶液，混合均匀，于37 ℃下温孵15 min，再分别加入300 μL可溶性淀粉溶液开始反应，15 min后再各加入500 μL DNS试剂显色，并立即煮沸灭酶10 min终止反应；将混合体系定容至10 mL，于540 nm波长处测定其吸光度A1。以等体积蒸馏水取代待测溶液，测定其吸光度A0；以等体积磷酸盐缓冲液取代α-淀粉酶溶液，测定其吸光度A2，以等体积蒸馏水和磷酸盐缓冲液分别取代待测溶液和α-淀粉酶溶液，测定其吸光度A3。用式（2）计算抑制率。
1.4 数据处理与统计分析
采用DPS V7.05软件对实验数据进行方差分析，各数据之间的多重比较使用最小显着性差异法，其中，以P＞0.05为差异不显着，P＜0.05为显着，P＜0.01为极显着。使用Microsoft Excel 2007软件绘图。
2 结果与分析
2.1 孔石莼多糖及其锌络合物的理化性质及结构表征
2.1.1 孔石莼多糖的单糖组成分析结果
采用GC-MS分析孔石莼多糖的单糖组成（图1），通过与单糖标准品保留时间与离子碎片进行对比，确定孔石莼多糖是由鼠李糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖，其构成单糖基的物质的量比为1.00∶0.06∶0.93∶0.45∶2.29∶0.07。
图1 标准单糖（a）与孔石莼多糖（b）的色谱图Fig. 1 Chromatograms of monosaccharide standards (a) and Ulva pertusa polysaccharides (b)
2.1.2 总糖质量分数测定结果
苯酚-硫酸法测定孔石莼多糖及其锌络合物的总糖含量。经计算，孔石莼多糖和孔石莼多糖锌中总糖质量分数分别为53.35%和49.40%，可以看出经过络合锌改性，孔石莼多糖中的总糖含量有所下降。
2.1.3 GPC-MALLS-RI分析结果
表1 孔石莼多糖及其锌络合物的分子特征参数Table 1 Molecular parameters of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex
表1数据显示，孔石莼多糖锌的重均分子质量（Mw）为1.319×105g/mol，重均均方根旋转半径（Rw）为28.6 nm，均明显低于孔石莼多糖的Mw（4.903×105g/mol）和Rw（35.6 nm），而多分散指数（Mw/Mn）为2.120，明显高于孔石莼多糖的（1.607）。该结果说明经过络合锌反应，孔石莼多糖锌的分子质量、分子尺寸明显减小，而分子质量分布则较原多糖变宽，与Wei Dongfeng等[28]在制备红芪多糖硒络合物时得到的结果相似，推测可能是制备时反应体系使用稀盐酸调节pH值，由于盐酸为强酸，故导致络合反应过程中部分多糖发生了降解。
图2 孔石莼多糖（a）及其锌络合物（b）的空间构象Fig. 2 Spatial conformation of Ulva pertusa polysaccharides (a) and polysaccharides-zinc complex (b)
图2 为孔石莼多糖及其锌络合物的分子质量与均方根旋转半径之间的关系曲线图，可显示样品的多糖链构象[29]。从图2中可看出，孔石莼多糖及其锌络合物的谱图线性关系均较差，两者均呈类似U型的曲线，提示两者的分子构象均为高支化度结构，该现象与曾红亮[30]对金柑多糖的GPC-MALLS-RI分析结果类似。
2.1.4 刚果红实验结果
图3 孔石莼多糖及其锌络合物与刚果红反应体系的最大吸收波长Fig. 3 Congo-red reactions of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex
刚果红能够与具有三螺旋结构的多糖发生络合反应，与刚果红溶液相比，络合物的最大吸收波长发生红移，并在一定的NaOH浓度范围内呈现亚稳性[31]。从图3中可看出，刚果红与孔石莼多糖混合后，其最大吸收波长发生了明显的红移，且在NaOH浓度0.15～0.50 mol/L范围内无明显变化，出现了亚稳区，而刚果红与孔石莼多糖锌混合溶液的最大吸收波长则没有出现这种特征的明显变化。由此可推测孔石莼多糖具有三螺旋结构，而其锌络合物中的孔石莼多糖的三螺旋结构基本被破坏。
2.1.5 紫外-可见光谱分析结果
图4 孔石莼多糖及其锌络合物的紫外-可见光谱图Fig. 4 UV-VIS spectra of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex
由图4可知，两条曲线在260、280 nm波长处均无吸收峰，且孔石莼多糖锌在紫外区的吸收强度明显小于孔石莼多糖，说明孔石莼多糖及其锌络合物均基本不含有核酸和蛋白质，且络合物中的生色基或助色基与Zn2+发生络合反应[32]，形成了化学键束缚，从而导致紫外吸收强度有所减弱。
2.1.6 傅里叶变换红外光谱分析结果
由图5可知，孔石莼多糖在2 981.46 cm－1处的峰为甲基（—CH3）中C—H非对称伸缩振动的吸收峰，1 621.20 cm－1处的峰为羧基（—COO－）中C＝O非对称伸缩振动的吸收峰，1 230.86 cm－1处的峰为硫酸基（—OSO3－）中S＝O的伸缩振动峰；经过络合锌反应，这3 处峰分别移动至2 992.55 、1 632.91、1 215.40 cm－1处，提示络合锌改性对孔石莼多糖的这些基团造成了一定的影响；此外，图4还显示，孔石莼多糖锌在1 391.89 cm－1与997.03 cm－1处较其原多糖多出两个特征峰。综上可知，孔石莼多糖络合锌的反应主要体现在其糖链上的—COO－、—CH3、—OSO3－等基团与Zn2+发生反应，而非简单的物理混合。
图5 孔石莼多糖及其锌络合物的傅里叶变换红外光谱Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex
2.1.7 XRD分析结果
图6 孔石莼多糖及其锌络合物的XRD图Fig. 6 X-ray diffraction patterns of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex
从图6中可看出，孔石莼多糖及其锌络合物均只在20°左右存在一不明显的包峰，且多糖锌的包峰强度高于原多糖的，但并未发现硫酸锌的特征衍射峰，提示二者均为无定形结构，同时再次证明孔石莼多糖与Zn2+确实发生了络合作用，推测Zn2+可能均匀地分散在孔石莼多糖的糖链上，生成络合物。
2.1.8 SEM观察结果
从图7a1、b1中可发现孔石莼多糖与其锌络合物均呈层叠堆积的片状，表面较为平整，但两者的形貌均无规整性，参考相关文献的研究结果，推测该现象可能是由于分子链之间互相交联聚集形成的[33-34]，提示两样品的分子间均存在很强的相互作用，且均呈无定形结构，与XRD分析中得到的结果相符；此外，两者均含多孔的蜂巢状结构，这可能是冻干过程中冰晶升华而形成。通过对比图7a2与b2，可发现孔石莼多糖表面较为光滑、紧密，而其锌络合物则较为粗糙，存在许多龟裂，两者表面均存在一些较小的碎屑状颗粒，但孔石莼多糖锌表面的颗粒物明显多于孔石莼多糖，由此亦可推断，孔石莼多糖除了与Zn2+之间发生络合反应外，还可能存在物理吸附现象。
图7 孔石莼多糖（a）及其锌络合物（b）在不同放大倍数下的SEM图Fig. 7 SEM images of Ulva pertusa polysaccharides (a) and polysaccharides-zinc complex (b)
2.1.9 AFM分析结果
图8 孔石莼多糖（a）及其锌络合物（b）在AFM下的照片Fig. 8 Atomic force microscopic images of Ulva pertusa polysaccharides (a)and polysaccharides-zinc complex (b)
由图8可知，孔石莼多糖及其锌络合物分子链的大小、形状均不均等，呈山峰状、链状颗粒，两样品的分子链宽度在几十至几百纳米不等，明显大于天然多糖分子链的宽度（0.1～1 nm），证明两样品的分子均是由多股糖链互相交联缠结形成的聚集体，该现象与Wang Kaiping等[35]的研究结果相似；对比两者的谱图还可看出，孔石莼多糖分子聚集体整体分布相对较为均匀，高度约为1～2 nm左右，体积较小；而孔石莼多糖锌分子聚集体明显较原多糖的大，且整体分布参差不齐，聚集体高度分布在2～7 nm范围，体积较大，此现象与黄靖等[23]在观察肉苁蓉多糖锌络合物时得到的相似，提示经过络合改性，孔石莼多糖分子的团聚性增强。
2.2 孔石莼多糖及其锌络合物的体外降血糖活性
2.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制能力测定结果
图9 孔石莼多糖及其锌络合物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig. 9 Inhibitory effects of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex on α-glucosidase
如图9所示，孔石莼多糖及其锌络合物样液均在质量浓度大于5 mg/mL时才体现对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，且两者的抑制率均随质量浓度的增加而极显着增大（P＜0.01）。相同质量浓度下，孔石莼多糖锌的抑制率显着或极显着大于原多糖（P＜0.05或P＜0.01）。当质量浓度为25 mg/mL时，孔石莼多糖及其锌络合物样液对α-葡萄糖苷酶抑制率均达到最大值，分别为（26.64±0.95）%、（54.66±1.20）%。经计算，两者抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分别为42.87、23.63 mg/mL；IC50越小，抑制能力越强，可知同条件下，孔石莼多糖锌样液对α-葡萄糖苷酶的抑制能力是孔石莼多糖样液的1.81 倍。
2.2.2 α-淀粉酶抑制能力测定结果
图10 孔石莼多糖及其锌络合物对α-淀粉酶的抑制效果Fig. 10 Inhibitory effects of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex on α-amylase
从图10中可以看出，相同质量浓度下，孔石莼多糖锌的抑制率极显着大于原多糖（P＜0.01）。孔石莼多糖及其锌络合物样液对α-淀粉酶的抑制率均在质量浓度为25 mg/mL时达到最大值，分别为（46.34±1.20）%、（76.94±0.73）%。经计算，两者抑制α-淀粉酶的IC50分别为27.22、10.66 mg/mL，可知同条件下，孔石莼多糖锌样液对α-淀粉酶的抑制能力达到孔石莼多糖样液的2.55 倍。
3 结 论
本研究以实验室自制的孔石莼多糖为试材，制备孔石莼多糖锌络合物，采用GS-MS、GPC-MALLS-RI、刚果红实验、紫外-可见光谱、傅里叶变换红外光谱、XRD、SEM、AFM等对孔石莼多糖及其锌络合物进行结构表征，并通过α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制实验比较两者的体外降血糖活性，探究络合锌改性对孔石莼多糖结构与重要生物活性的影响，主要结论如下：1）孔石莼多糖是由鼠李糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖，其中各单糖基的物质的量比为1.00∶0.06∶0.93∶0.45∶2.29∶0.07；经过络合锌反应，产物中孔石莼多糖的总糖质量分数有原来的53.35%下降至49.40%。2）GPC-MALLS-RI分析结果显示，孔石莼多糖锌的分子质量、分子尺寸较原多糖明显减小，但分子质量分布范围明显变宽，两者的构象均为高支化度结构；刚果红实验结果显示，经过络合锌改性，产物中孔石莼多糖的三螺旋结构基本消失。3）结合紫外-可见光谱与红外光谱检测结果推测，孔石莼多糖中的—COO－、—CH3、—OSO3－等基团与Zn2+发生了反应；XRD检测结果表明，孔石莼多糖及其锌络合物均为无定形结构，且Zn2+高度分散在后者的糖链上。4）SEM观察结果提示，孔石莼多糖及其锌络合物的表面形貌产生明显差异，孔石莼多糖与Zn2+除了发生络合反应外，还可能存在物理吸附现象；AFM结果显示，孔石莼多糖锌的分子形貌较原多糖的发生了明显变化，其分子团聚性显着增强，分子聚集体尺寸明显增大，且整体分布差别变大。5）孔石莼多糖及其锌络合物在实验的质量浓度范围内均具有一定的体外降血糖活性，且存在量效关系；相同质量浓度下，孔石莼多糖锌对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制率均显着或极显着（P＜0.05或P＜0.01）高于孔石莼多糖，前者的抑制能力分别是后者的1.81、2.55 倍。推测可能是经过络合反应，孔石莼多糖的活性基团与Zn2+产生了协同作用，从而增强了其体外降血糖活性。此外，在络合过程中多糖发生了部分降解，使得更多的活性基团得到暴露，亦可能是孔石莼多糖锌体外降血糖活性强于原多糖的原因之一。
综上，络合锌改性使孔石莼多糖锌的分子结构特征较原多糖发生明显改变，体外降血糖活性显着增强，其作为一种新型的多糖补锌剂，具有广阔的开发前景。
