清酱香型白酒陶坛发酵细菌群落结构多样性分析

胡小霞，黄永光,,*，蒋 想，朱家合，金 磊

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州岩博酒业有限公司，贵州 盘州 553523；3.无锡市振太酒业有限公司，江苏 无锡 214092）

中国白酒是世界上最古老的蒸馏酒之一[1]，在其发展进程中，基于酿酒原料、酿造工艺、自然环境、糖化发酵剂等因素的差异，逐渐形成了各具特色、风格典型的酱香、浓香、清香等12 种香型白酒[2]。随着消费需求发展，白酒酿造工艺和科技也随之进步，白酒香型不断创新，清酱香型白酒正是香型创新的代表产物，目前在全国已获得广大消费者认可和青睐。清酱香型人民小酒采用本地产糯高粱为原料，高温水泡粮煮粮，小曲糖化培菌、大曲堆积发酵生香，陶坛发酵或窖池长期发酵，分级取酒，分类贮存，陈酿勾兑而成。其酿造工艺有机融合了清香型、酱香型白酒酿造之精华，酒体风格“清亮透明，清酱协调，香气幽雅，醇厚丰满，细腻柔顺，回味悠长，空杯留香”，既满足了清香型白酒的幽雅、净爽，又富有酱香白酒的醇厚、细腻、回味悠长风格[3]。

众所周知，白酒酿造的产质量与酿造过程微生物菌群结构及其代谢密不可分，清酱香型白酒风格之所以不同于典型的清香型和酱香型白酒，除在酿造工艺上的创新和不同外，更根本原因在于其酿酒微生物结构的差异和酿造环境的独特。目前研究普遍认为，在白酒酿造微生物体系中，细菌有产酶和产香的能力[4]，通过代谢产生丰富的风味物质决定白酒的香型和品质[5-6]。白酒酿造过程中细菌群落结构也一直是白酒界的研究热点[7-9]。

清酱香白酒作为创新香型白酒，还处于发展起步阶段，酿造过程的细菌群落结构体系尚不明确，这在一定程度上制约了它的发展。因此，为揭示酿酒微生态、功能微生物多样性结构对清酱香型人民小酒酿造及其酒体风格影响的机理以及清酱香型白酒酿造过程中重要发酵微生物的调节机制，本研究通过高通量测序策略并结合数理统计系统，分析清酱香型白酒陶坛发酵过程中的细菌群落结构，并进一步研究其主要细菌群落在发酵过程中的变化规律及调控机制，以期推动清酱香型白酒的创新发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

样品采集自贵州省YB酒业有限公司2 个陶坛发酵生产车间（分别记为YB1和YB2，其入坛发酵时间和发酵工艺一致）2018年6—7月生产发酵酒醅，发酵期为21 d。每个车间同一天有50 坛酒醅入坛发酵，从中随机抽取10 坛进行跟踪取样，由于陶坛质地、糟醅入坛温度、水分、酸度、糟醅疏松度等相关因素影响，酒醅上层、中层、下层及内层、外层微生物分布存在一定差异，因此，每次采集酒醅上、中、下3 个发酵酒醅层次的发酵酒醅样品，每个发酵酒醅层采集中间和边缘位置（图1），然后将6 个点样品均匀混合为一个样品以消除取样误差，混合后取200 g存于无菌自封袋中。再将从10 个发酵坛中采集的样品各取20 g混合为综合样。每次采集酒醅样品样均采用专业的取样器定时定位取样，取样器消毒灭菌后，瞬间打开封坛盖膜，取样器刺穿到糟醅层面，迅速、严格进行取样操作，因取样器直径很小，只会留下1 个小孔，且取样时间很短，取样完毕后则立即将小孔密封，封坛。根据前期基础研究和生产实际，由于发酵10 d后，发酵进入稳定阶段，因此取样时间定为发酵第1、5、10、20天。综合样分别记为YB1的1F 1 d、1F 5 d、1F 10 d、1F 20 d和YB2的2F 1 d、2F 5 d、2F 10 d、2F 20 d。样品采集完毕则即时进行DNA提取。

图 1 陶坛发酵酒醅取样图Fig. 1 Schematic of sampling positions of fermented grains from the pottery jar during fermentation

1.1.2 试剂

DNA Marker 宝生物工程（大连）有限公司；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）、引物合成上海生物工程股份有限公司；E.Z.N.A. Soil DNA Kit美国Omega BioTek公司；异丙醇（分析纯）、TAE（Tris acetate-EDTA）缓冲液 北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖 南京生兴生物技术有限公司；Goldview染料 上海赛百盛有限公司；rTaqDNA聚合酶试剂盒北京全式金生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Zealway G154DW高压蒸汽灭菌锅 致徽（厦门）仪器有限公司；台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司；GeneAmp®9700型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国ABI公司；DYY-8C型电泳仪北京六一仪器厂；JS-680C凝胶成像仪 上海培清科技有限公司；MiSeq测序仪 美国Illumina公司；QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统 美国Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理[6,10-11]及DNA提取

分别取1.1.1节最后混匀的8 个综合样各16 g于100 mL离心管中，用30 mL灭菌后的0.1 mol/L PBS悬浮，加入3～5 颗玻璃珠，旋涡振荡7 min，400 r/min离心5 min，取上清液。沉淀用PBS洗涤，旋涡振荡4 min，400 r/min离心5 min，收集上清液。将沉淀用PBS洗涤，旋涡振荡2 min，400 r/min离心5 min，收集上清液。全部上清液于12 000 r/min离心5 min，弃上清液，收集细胞沉淀。预处理结束后，根据E.Z.N.A.®soil DNA Kit的操作说明提取各样品中的微生物总DNA。

1.3.2 16S rRNA基因扩增及Illumina MiSeq测序

应用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）扩增V3和V4高变区。PCR体系及反应条件见黄蕴利等[12]的方法；每个样本做3 个重复。将同一样品的PCR产物混合后用1.1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱；1.1%琼脂糖电泳检测。

参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统进行检测并定量，再按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。连接“Y”字形接头，使用磁珠筛选去除接头自连片段，利用PCR扩增进行文库模板富集，氢氧化钠变性，产生单链DNA片段，制备MiSeq PE文库。再在Illumina MiSeq（PE300）平台上机测序。

1.4 数据及图像处理

采用Microsoft Office Excel 2016进行数据计算，IBM SPSS Statistics进行显着性分析，R语言绘制气泡图和群落差异分析图，Cytoscape绘制共线性网络分析图和相关性网络图。

2 结果与分析

2.1 陶坛发酵过程细菌群落结构分析

对两组样品细菌的高通量测序结果进行统计分析，图2为清酱香型白酒陶坛发酵过程的细菌群落结构气泡图。

图 2 发酵过程细菌群落结构多样性在属水平上的分布图（相对丰度＞1%）Fig. 2 Distribution of microbial community at the genus level(relative abundance ＞ 1%)

从YB1中检出11 个门，从YB2中检出9 个门，YB1和YB2酒醅样品中共检出Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria、Deinococcus-Thermus、p_unclassified_k__norank、Fusobacteria、Saccharibacteria、Planctomycetes、Acidobacteria 11 个门，其中优势细菌门（平均相对丰度＞10%）为Firmicutes（67.09%）和Proteobacteria（31.42%），这与清香型[11,13]和酱香型[7,14]白酒发酵过程的优势细菌门一致。Firmicutes在清酱香型白酒发酵酒醅中占绝对主导地位，在清香型和酱香型白酒发酵酒醅中同样如此，但丰度占比有所差异[7,11]。

从YB1中检出166 个属，从YB2中检出146 个属，YB1和YB2酒醅样品中共检出178 个属。如图2所示，有21 个属相对丰度至少在一个样品中超过1%，分别是：Weissella、Staphylococcus、Lactobacillus、Oceanobacillus、Bacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Leuconostoc、g_unclassified_o_Bacillales、Gluconobacter、Pseudomonas、Acetobacter、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Kozakia、Pantoea、Psychrobacter和g_unclassified_c_Alphaproteobacteria、Chryseobacterium。

上述21 个细菌属中，Weissella、Leuconostoc、Lactobacillus和Pediococcus属于乳酸菌。乳酸菌在发酵过程可通过产乳酸、乙酸等有机酸，直接影响酒体风味。同时，乳酸和乙酸是白酒中重要风味成分乳酸乙酯和乙酸乙酯的前体。乳酸菌还可通过代谢有机酸、竞争营养成分、产生抗菌素等抑制其他微生物的生长，从而调节发酵过程的微生物群落结构，间接影响酒体的品质。此外，乳酸菌还能为酵母发酵过程的酯化作用提供前体物质，具有促进酿酒发酵和美拉德反应及维持酿酒微生态环境等作用[15-17]。Gluconobacter、Acetobacter、Komagataeibacter和Kozakia属于醋酸菌[18]。醋酸菌是一类严格好氧的革兰氏阴性细菌，能氧化葡萄糖或乙醇生成乙酸，是乙酸代谢的主要来源。乙酸是白酒中主要风味成分之一。少量的乙酸对改善白酒风味、促进酒体清香有重要作用[6]。Weissella和Leuconostoc可启动发酵，Leuconostoc还可利用葡萄糖进行异型乳酸发酵产生D-型乳酸和乙酸[19]。Gluconobacter能产生乙酸[20]。Acetobacter能产细菌纤维素[21]，具有氧化乙醇生成乙酸并进一步氧化乙酸的能力[22]。Fan Guangsen等[20]在清香型大曲中检测到一种Acetobacter orientalis，该细菌将葡萄糖发酵成乙醇，将乙醇转化成乙酸，通过生产乙酸异戊酯和2-苯基乙酸乙酯等酯类对酒体风味有积极作用。Komagataeibacter的部分菌株可产生细胞纤维素，可以由甘油产生二羟基丙酮，可以氧化葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、乙醇产生有机酸等[22]，Komagataeibacter在葡萄酒和有机苹果酒浸泡醋生产中，被确定为葡萄酒醋和苹果醋发酵中的主要微生物[23]，但尚未在白酒发酵中见到报道。Kozakia能利用蔗糖或D-果糖生产类似果聚糖的黏性物质，也能氧化乙酸盐和乳酸盐，利用乙醇生产食醋[18]。Oceanobacillus是大曲中的主要微生物[24]，具有产乳酸的功能[25]。Bacillus是酱香型白酒生产中的主要功能菌，能在55 ℃及以上高温下生长，促进以葡萄糖、甘氨酸和氯化钠为原料的美拉德反应迅速发生，生成乙酸、乙酸乙酯、乙醛、乙缩醛、丁二醇等风味物质，是重要的产酸和产香菌，促进浓郁的酱香风味形成；并且Bacillus还能代谢酶水解淀粉、蛋白质等，产生丁酸和己酸等，还有助于双乙酰等芳香物质和吡嗪、醛类、酮类、醇类等挥发性化合物形成[6]。Enterobacter存在于大曲和小曲中[26]。Wang Peng等[27]发现在大曲发酵8 d后，Enterobacter便成为优势微生物。黄莹娜等[28]认为Enterobacter是白云边窖泥中特有的优势菌属，对其浓酱兼香风格的形成有重要贡献。且Enterobacter中的某些菌可产纤维素酶和乳酸[29-31]。Acinetobacter是具有呼吸和发酵代谢作用的细菌[31]，以葡萄糖和其他碳水化合物代谢产酸，是酱香型[31]和清香型[32]白酒酒醅中的主要微生物。酸类物质具有平衡酒味、协调香气的作用。同时酸类物质也是形成酯类化合物的前体物质，而酯类化合物是构成清酱香型人民小酒挥发性香气的重要物质[3]。综上表明，上述微生物具有促进清酱香白酒风味物质富集的作用。

Pseudomonas是清香型白酒酒醅中的主要微生物[28]。Liu Xiu等[33]在大曲发酵的风干阶段检测到Pseudomonas。Staphylococcus为酱香型酒曲和部分堆积前、中期酒醅中的优势菌群，文献报道[17]部分Staphylococcus在香肠、火腿等发酵食品生产过程可产生独特的风味物质。Pantoea、Kroppenstedtia和Lentibacillus都是大曲中的主要微生物[26,34]。清酱香型白酒采用大小曲共同发酵，发酵工艺和酒体风格融合了清、酱香型白酒二者之优势。因此，清香型或酱香型白酒发酵过程中的主要微生物，如果在清酱香型白酒中的相对丰度较高（相对丰度＞1%），对清酱香型白酒发酵也有一定影响作用。

高通量测序结果表明，Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter和Komagataeibacter在酒醅中的平均相对丰度大于1%，Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea在发酵结束阶段平均相对丰度大于1%。以上微生物在清酱香型白酒陶坛发酵过程中的相对丰度及其功能作用表明，Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobcter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea共17 种属是清酱香型白酒发酵过程的主要细菌属。其中优势细菌属（平均相对丰度＞10%）为Weissella（20.61%）、Staphylococcus（14.19%）、Lactobacillus（12.08%）和Gluconobacter（14.17%）。而前人研究表明，清香型白酒中的主要细菌属是Lactobacillus、Streptpcoccus、Pediococcus、Aerococcus、Bacillus、Acetobacter、Pseudomonas、Kroppenstedtia、Weissella、Acinetobacter和Leuconostoc[6,11,32,35]。如图3所示，Weissella、Lactobacillu、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Acinetobacter和Leuconostoc是清香型和清酱香型白酒酒醅共有的主要细菌属，Streptpcoccus和Aerococcus在清香型白酒酿造中是主要细菌属，但Streptpcoccus在清酱香型白酒发酵过程中未检出，Aerococcus在清酱香型白酒发酵过程中含量很低（在各样品中相对丰度均低于0.01%）。酱香型白酒酒醅中的主要细菌属为Acidithiobacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Acetobacter、Pediococcus、Bacillus、Pantoea、Weissella、Thermoactinomyces、Enterobacter、Pseudomonas、Stenotrophomonas、Phyllobacterium、Shewanella、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Clostridium、Sensu stricto1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter、Acinetobacter、Lactococcus、Staphylococcus、Enhydrobacter、Burkholderia、Desmospor[10,14,31,36-37]。其中Weissella、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Enterobacter、Acinetobacter、Pantoe是酱香型和清酱香型白酒酒醅共有的主要细菌属，Acidithiobacillus、Thermoactinomyces、Stenotrophomonas、Phyllobacterium、Shewanella、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Clostridium、Sensu stricto1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter、Lactococcus、Enhydrobacter、Burkholderia、Desmospora、Serpens是酱香型白酒酒醅中的主要细菌属，但Acidithiobacillus、Phyllobacterium、Shewanella、Clostridium、Sensu stricto1、Actinobacillus、Peptoclostridium、Citrobacter、Burkholderia、Desmospora和Serpens在清酱香型白酒发酵过程中未检出，Thermoactinomyces、Stenotrophomonas、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Lactococcus和Enhydrobacter在清酱香型白酒发酵过程中含量很低（在各样品中平均相对丰度介于0%～0.35%）。与清香型和酱香型白酒相比，Gluconobacter、Oceanobacillus、Lentibacillus、Komagataeibacter、Kozakia是清酱香型白酒酒醅中特有的主要细菌属。正是由于发酵菌群结构的差异，其发酵动力和风味动力上也会存在差异，从而导致了酱香、清香、清酱香白酒发酵产率及其酒体风格特征上的差异。

图 3 不同香型白酒主要细菌属水平分布Venn图Fig. 3 Venn map of main bacterial genera in Chinese liquors of different flavors

上述结果表明，在门水平，清酱香、清香、酱香型白酒酿造微生物差异不大，都是Firmicutes和Proteobacteria为优势细菌门，且Firmicutes占主导地位。在属水平，清酱香型白酒酿造过程主要细菌属与清香型、酱香型白酒堆积发酵过程的主要细菌属有很大重合，但又有各自特有的主要细菌属。说明清酱香型白酒酿造过程的细菌群落结构与清香型白酒、酱香型白酒酿造均有一定的相似性，但又不同于清香型白酒和酱香型白酒酿造细菌群落结构，具有其自身独特性。清酱香型白酒酿造过程的主要细菌群落结构兼具了清香和酱香白酒酿造主要细菌的群落结构特点。

2.2 发酵起始和结束阶段细菌群落结构

2.2.1 发酵起始和结束阶段酒醅样品与物种共线性分析

为获得细菌在发酵起始和结束阶段的表型差异和共存在关系，必须对清酱香型白酒陶坛发酵过程细菌群落结构进行解析，进一步认识其调控作用，对两车间发酵1 d和发酵20 d酒醅样品的细菌进行相关性分析，结果见图4。

图 4 发酵1 d和20 d酒醅样品与物种共线性网络分析图Fig. 4 Collinearity analysis of bacterial genera in 1 d and 20 d fermented grains

对比YB1发酵起始（1F 1 d）和发酵结束（1F 20 d）时的酒醅，从图4a可看出，有Candidatus_Saccharimonas等6 个属只出现在发酵1 d酒醅中，发酵结束时未检出，说明这6 个属受发酵条件调控明显。这6 个属在发酵1 d时相对丰度和占0.03%，在发酵过程所占菌群结构比例很小。此外，有56 个属在发酵1 d未检出，但在发酵结束阶段检出（相对丰度和占0.48%），这些属与发酵工艺变化存在协同性，并富集于发酵过程。值得注意的是，有79 个属同时出现在发酵开始和结束阶段，其中有73 个属同时出现在YB1的4 个采样阶段，在各阶段的丰度和分别占99.96%、98.91%、99.38%和98.05%，表明这些属在发酵过程起主导性作用。对比YB2酒醅在发酵开始（2F 1 d）和发酵结束（2F 20 d）阶段的菌群结构（图4b）可知，有26 个属只出现在发酵1 d，发酵结束时未检出，这部分属在发酵1 d的相对丰度和占0.20%。此外，有33 个属在于发酵1 d未检出，但在发酵结束时有检出，其相对丰度和占0.20%。同时出现在发酵开始和结束阶段的有79 个属，其中有66 个属同时出现在YB2样品的4 个采样阶段，这66 个属在各阶段的丰度和分别占99.68%、99.54%、99.60%和97.83%，同样表明这些属在发酵过程具有重要作用。

在YB1酒醅样品中，共检出166 个属，有43.96%的属存在于发酵起始阶段并稳定迁移、维持至发酵结束阶段，这些属在各阶段的相对丰度和高达98%以上。另外，有33.73%的属在发酵起始阶段未检出，在发酵进程中富集，但在发酵结束时相对丰度和仅占0.48%。在YB2酒醅中共检出146 个属，有45.21%的属从发酵起始阶段一直稳定至发酵结束，其在各阶段的相对丰度和高达97.83%以上。另外，有22.60%的属在发酵起始阶段未检出，但在发酵过程得到富集，到发酵结束时相对丰度和为0.20%。上述结果表明，在清酱香型白酒（人民小酒）发酵过程中，YB1、YB2平均有10.71%的细菌发生消亡，同时平均有28.17%的新物种得到富集，但其相对丰度和均不超过1.9%，所起的调控和发酵作用不明显，起主导作用的微生物菌群从发酵起始阶段就存在并稳定维持至发酵结束。虽然两个车间的微生物存在一定差异，但调控发酵的主要微生物结构相似度高，且稳定性较好，部分微生物存在差异主要来源于随发酵时间延长，发酵工艺参数变化和微生物结构变化之间的相互影响和调控。

2.2.2 发酵起始和结束阶段主要细菌群落差异分析

根据上述主要细菌菌群丰度数据，运用统计学方法，对发酵1 d和发酵20 d酒醅的主要细菌属进行假设检验，评估物种丰度差异的显着性水平，获得发酵起始和结束阶段样品的显着性差异物种及主要细菌属变化结果，以进一步解析发酵过程主要细菌属的调控作用，结果如图5所示。

上述17 个主要细菌属，在YB1（图5a）中相对丰度高度显着（P＜0.001）下降的有Weissella、Gluconobacter和Pseudomonas3 个属，其余14 个属全部呈高度显着（P＜0.001）上升。在YB2（图5b）中相对丰度下降的有Weissella、Gluconobacter、Staphylococcus、Bacillus和Lentibacillus5 个属，其余12 个属相对丰度呈现上升。其中，Weissella、Gluconobacter、Staphylococcus和Lentibacillus4 个属相对丰度呈现高度显着（P＜0.001）下降，Lactobacillus、Pseudomonas、Acetobacter、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc和Pantoea11 个属相对丰度呈现高度显着（P＜0.001）上升，Bacillus和Kozakia无显着性变化（P＞0.01）。

图 5 发酵起始和结束阶段主要细菌群落差异分析Fig. 5 Analysis of differences in major bacterial community at the initial and final stages of fermentation

同时也可看出，在发酵阶段，主要细菌属的相对丰度存在变化。两个车间平均73.53%的主要细菌属呈现高度显着（P＜0.001）上升，平均20.59%的主要细菌属呈现高度显着（P＜0.001）下降，仅有2 个属无显着性变化。发酵结束阶段，细菌群落组成结构相对比较稳定，没有占绝对优势的微生物。在YB1中仅有Gluconobacter和Staphylococcus两个属是优势细菌属，相对丰度分别是18.20%和20.46%；在YB2也只有Weissella和Lactobacillus两个属是优势细菌属，相对丰度分别为12.03%和25.97%。

综上，发酵阶段会发生主要细菌群落结构的内部调控机制，平均73.53%的主要细菌属相对丰度呈高度显着（P＜0.001）上升，20.59%的主要细菌属相对丰度呈高度显着（P＜0.001）下降。细菌在发酵过程的含量变化主要受发酵过程发酵酒醅理化指标变化和微生物群落结构的双向调控。到发酵结束阶段，因酒醅理化指标所导致的发酵环境相对稳定，所以该阶段的主要细菌组成结构呈现相对稳定，其相对丰度均小于25.97%。

2.3 主要细菌群落之间相关性

上述结果表明发酵过程的主要细菌群落结构之间通过共生、竞争及拮抗等关系形成复杂的相互调控机制，进而形成一个相对稳定的发酵微生物群落。为深入挖掘主要细菌群落之间的相关性及其变化规律，采用网络分析方法对17 个主要细菌属进行了相关性分析，结果如图6所示。

图 6 酒醅样品中的主要细菌群落相关性网络图（属水平）Fig. 6 Correlation network of major bacterial genera in fermented grain samples

从图6可看出，发酵过程平均81.12%的细菌菌属之间呈显着正相关（P＜0.05）。在YB1中，正相关性占总相关性的85.19%，负相关性占总相关性的14.81%。在YB2中，正相关性占总相关性的77.05%，负相关性占总相关性的22.95%。表明这些微生物菌群在发酵过程存在一定程度上相似生态位。

Hubs种类及多少在一定程度上可反映特定环境中微生物菌群结构的稳定性。从YB1的同现性网络图谱（图6a）中共发现Komagataeibacter、Pantoea、Lentibacillus、Enterobacter、Oceanobacillus、Pediococcus、Staphylococcus和Bacillus8 个Hubs（这里指至少与其他4 个属的微生物存在正相关的节点）。Komagataeibacter是Proteobacteria门下的醋酸菌，与Bacillus、Kozakia、Acetobacter、Pantoea、Pediococcus和Enterobacter显着正相关（P＜0.05）。Pantoea与Leuconostoc显着正相关（P＜0.05）。Lentibacillus与Oceanobacillus、Staphylococcus和Kroppenstedtia显着正相关（P＜0.05）。Bacillus与Pantoea显着正相关（P＜0.05）。Staphylococcus与Oceanobacillu和Kroppenstedtia显着正相关（P＜0.05）。Pediococcus与Bacillus、Leuconostoc和Pantoea显着正相关（P＜0.05）。Lentibacillus与Oceanobacillu、Staphylococcus和Kroppenstedtia显着正相关（P＜0.05）。Enterobacter与Bacillus、Staphylococcus、Oceanobacillu和Lentibacillus显着正相关（P＜0.05）。从YB1的负相关网络（图6b）可发现Pseudomonas1 个负相关Hub（这里指至少与其他3 个属的微生物存在负相关的节点）。Pseudomonas与Gluconobacter、Acetobacter和Kozakia显着负相关（P＜0.05），此外乳酸菌Weissella和醋酸菌Acinetobacter显着负相关（P＜0.05）。

从YB2的共现性网络图谱（图6c）中共发现10 个Hubs，分别是Firmicutes下的Pediococcus、Lactobacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus和Leuconostoc；Proteobacteria下的Komagataeibacter、Acetobacter、Enterobacter、Acinetobacter和Pantoea。这些微生物中，除Leuconostoc与Acinetobacter，Kroppenstedtia与Oceanobacillus、Pediococcus之间相关性不显着外（P＞0.05），其余全部两两显着正相关（P＜0.05）。从YB2的负相关网络（图6d）发现Staphylococcus和Pseudomonas两个Hubs。Staphylococcus与Acetobacter、Leuconostoc、Pantoea、Enterobacter、Komagataeibacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus和Acinetobacter显着负相关（P＜0.05），这几个微生物属全都是正相关Hubs。而在YB1中，Staphylococcus与Lentibacillus、Enterobacter、Oceanobacillus和Kroppenstedtia显着正相关（P＜0.05）。该结果与Staphylococcus在两个车间的含量不同有关。在YB1中，Staphylococcus总体呈上升趋势，相对丰度从起发阶段的9.07%上升至发酵结束时的20.46%。而在YB2，Staphylococcus的相对丰度从起酵时的28.03%下降至发酵结束时为0.95%。在YB2中，Pseudomonas和Lentibacillus、Bacillus、Kozakia显着负相关（P＜0.05），Pseudomonas在YB1中也与3 个属的微生物存在显着负相关（P＜0.05）。

从主要细菌群落在两个车间酒醅的相关性分析结果发现，其发酵过程平均81.12%的主要细菌菌属之间呈显着正相关（P＜0.05），18.88%的主要细菌菌属之间呈显着负相关（P＜0.05）。Komagataeibacter、Pantoea、Enterobacter、Oceanobacillus和Pediococcus是清酱香型白酒（人民小酒）两个车间发酵体系中共有的正相关Hubs，对维持发酵体系的正常、稳态发展和酒体风味的形成起到非常重要的作用。Pseudomonas是两个车间发酵体系中共有的负相关Hub。

3 结 论

清酱香型白酒发酵过程的优势细菌门与清香型、酱香型白酒相同，均为Firmicutes和Proteobacteria，主要细菌属为Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea，优势细菌属为Weissella、Staphylococcus、Lactobacillus和Gluconobacter。Streptpcoccus在清香型白酒酿造过程中是主要细菌属，Acidithiobacillus、Phyllobacterium、Shewanella、Clostridium、Sensu stricto1、Actinobacillus、Peptoclostridium、Citrobacter、Burkholderia、Desmospora和Serpens在酱香型白酒酒醅中是主要细菌属，但在清酱香型白酒发酵过程中均未检出。与清香型、酱香型白酒酿造过程微生物对比，清酱香型白酒酿造过程的细菌群落结构与清香型白酒、酱香型白酒酿造均有一定的相似性，但又不同于典型的清香型和酱香型白酒酿造过程的细菌群落结构，具有其自身独特性，本研究对清酱香型白酒酿造微生物群落结构差异分析，为探究清酱香型白酒风味形成的微生物成因（菌系基础）和风味特征凝练和品质创新奠定了必要基础。

发酵过程平均有10.71%的细菌发生消亡，平均28.17%的物种得到富集，但其相对丰度都很低，相对丰度和均小于1.9%；主要细菌属的群落组成结构发生了变化，平均73.53%的主要细菌属呈高度显着上升，20.59%的菌属呈高度显着下降。在发酵结束阶段，主要细菌群落组成结构相对稳定，相对丰度均不超过25.97%；发酵过程，平均81.12%的主要细菌菌属之间呈显着正相关，18.88%的主要细菌菌属之间呈显着负相关。Komagataeibacter、Pantoea、Enterobacter、Oceanobacillus和Pediococcus是清酱香型白酒（人民小酒）发酵体系中共有的正相关Hubs，对维持清酱香白酒发酵体系的正常、稳态发展和酒体风味的形成起了非常重要的作用。