汤 勇，丁泓皓，蔡 俊
（湖北工业大学 发酵工程教育部重点实验室，工业微生物湖北省重点实验室，工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068）
黑曲霉是曲霉属真菌的一个常见种，是广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中的丝状子囊真菌[1]。黑曲霉是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等[2-3]。除此之外，黑曲霉具有强大的聚合物降解酶系，已有黑曲霉作为木聚糖降解酶系的强大生产者，可以在各种廉价的培养基，比如玉米粉、玉米芯粉、麸皮等上快速生长和发酵产酶[4-7]的相关报道。
我国是农业大国，每年都会产生大量可回收再利用的农业废弃物和农业副产品。据统计，我国收获玉米后的副产物——玉米芯量超过2 000万 t。如何更好地利用该宝贵的可再生资源已受到世界各国的高度重视。目前国内外采用微生物菌种液态发酵玉米芯粉的报道较少，且主要用于生产蛋白饲料，很少有关于产酶的报道[8-10]。玉米芯粉含有丰富的纤维素、半纤维素、木质素等，是一种优质的微生物发酵培养基碳源[11]。
木质纤维素由3 个主要组分组成：纤维素（30%～50%干质量）、半纤维素（20%～40%）、木质素（15%～25%）和灰分及其他成分（3%～10%）。虽然纤维素和半纤维素都可以水解成单个糖分子，但半纤维素的链短、分支少和非结晶性质使其比纤维素更适合水解[12]。硬木和许多农作物，如玉米芯粉的主要半纤维素是木聚糖，伴随少量阿拉伯聚糖、半乳聚糖和甘露聚糖，是木聚糖降解酶系的诱导碳源。木聚糖的完全降解需要木聚糖酶和木糖苷酶2 种关键酶，其中木聚糖酶破坏木聚糖骨架成更短的可溶性低聚木糖；木糖苷酶水解可溶性低聚木糖和木二糖的非还原末端释放木糖[13-14]。木糖苷酶在自然界中比较常见于丝状真菌[15-16]，如曲霉菌属（Aspergillus）、青霉菌属（Penicillium）、木霉菌属（Trichoderma）等。其中黑曲霉[17]是比较常见的可以利用玉米芯粉发酵产木糖苷酶的微生物。木糖苷酶在新能源、化学制药、食品和饮料、纤维饲料、造纸工业等方面都有非常重要的用途[18-22]，尤其是食品领域，比如木糖苷酶可以降低啤酒和果汁的黏度和浑浊度，提高产品质量[23-24]；木糖苷酶可以用于烘烤，不仅改善面团体积还可以延长其保质期[25]；木聚糖经过木糖苷酶处理后得到的木糖可用于生产木糖醇，作为食品甜味剂[26-28]，得到的低聚木糖作为益生元可以选择性促进益生菌生长，从而缓解便秘、促进消化[29-30]，所以提高微生物发酵产木糖苷酶的能力非常有必要。
微生物所产木糖苷酶可以将丰富、廉价、可再生资源生物转化为重要经济产品，其在食品领域具有较高的商业价值和市场潜力。但是自然界中野生型微生物产木糖苷酶的酶量低、成本高等问题极大限制了木糖苷酶的广泛应用，因此本研究拟通过单因素试验、Plackett-Burman试验设计、中心组合试验设计优化野生型菌株黑曲霉CAN产木糖苷酶的发酵工艺和发酵培养基，以期为木糖苷酶的工业化生产和应用提供重要的参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
玉米芯粉 武汉新华扬股份有限公司；黑曲霉CAN保藏于湖北工业大学教育部重点实验室工业发酵湖北省协同创新中心A610实验室。
蔗糖、木糖、淀粉、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、酵母膏、硝酸钾、硝酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、碳酸钠、柠檬酸、柠檬酸三钠、对硝基苯酚 国药集团化学试剂有限公司；对硝基苯基吡喃木糖苷 上海源叶生物科技有限公司。
菌种种子培养采用土豆培养基，配制过程：称取土豆200 g，去皮切成丁，加适量蒸馏水，充分煮沸，用4 层纱布过滤，滤液加入20 g葡萄糖，补足水至1 000 mL，高压灭菌，备用。活化时于以活化的黑曲霉斜面接种，28 ℃、180 r/min振荡培养40 h。
1.2 仪器与设备
Sorvall LYNK 6000超速离心机 美国Thermo公司；立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1D型单人净化工作台 苏州净化设备有限公司；ZSD-12全自动生化培养箱 上海智城分析仪器有限公司；ZQZY-CF8系列三层恒温培养振荡器 上海知楚仪器有限公司；SYNERGY2酶标仪 基因有限公司。
1.3 方法
1.3.1 木糖苷酶活力的测定
取0.1 mL稀释适当倍数后的发酵上清液加入0.9 mL 0.5 mg/mL的对硝基苯基吡喃木糖苷溶液（pH 4.5），在70 ℃水浴中以应30 min后，立即加入0.5 mL 2 mol/L碳酸钠溶液终止以应，混和均匀后在410 nm波长处测溶液的吸光度。通过测定在410 nm波长处释放出的对硝基苯酚吸光度计算酶活力。1 个木糖苷酶的酶活力单位（U/mL）定义为每分钟生成1 μmol对硝基苯酚所需的酶量[31]。
1.3.2 黑曲霉CAN产木糖苷酶发酵条件的优化
采用单因素法研究发酵周期、发酵温度、接种量、初始pH值、装液量、摇瓶转速对CAN发酵产木糖苷酶的影响。产木糖苷酶初始发酵培养基：玉米芯粉20 g/L，硝酸钠2.5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，氯化钙2.5 g/L；初始发酵条件：接种量5%，装液量100 mL/300 mL，温度28 ℃，摇瓶转速160 r/min，pH值自然。
发酵时间：在上述初始发酵培养基和培养条件下进行黑曲霉发酵产酶实验，每隔12 h测定一次发酵液中木糖苷酶活力；发酵温度：以上述实验最佳结果为前提，分别在25、28、31、34、37、40、43 ℃条件下发酵培养后测定木糖苷酶活力；摇瓶接种量：以上述实验最佳结果为前提，改变接种量分别为1%、3%、5%、7%、9%（V/V），发酵培养后测定木糖苷酶活力；发酵初始pH值：以上述实验最佳结果为前提，调整初始pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，发酵培养后测定木糖苷酶活力；摇瓶装液量：以上述实验最佳结果为前提，采用300 mL摇瓶装液，摇瓶装液量分别为30、50、70、90、110 mL，发酵培养后测定木糖苷酶活力；摇瓶转速：以上述实验最佳结果为前提，摇瓶转速分别为120、140、160、180、200、220 r/min，发酵培养后测定木糖苷酶活力。
1.3.3 黑曲霉CAN产木糖苷酶发酵培养基的优化
1.3.3.1 发酵培养基碳源的优选及添加量的优化
发酵培养基碳源选择蔗糖、麸皮、木糖、淀粉、玉米粉、玉米芯粉、低聚木糖、葡萄糖，碳源添加量为20 g/L，培养基其他成分保持不变，发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。
选择酶活力最高的碳源为最佳碳源，改变其添加量分别为5、10、15、20、25、30、35、40 g/L，培养基其他成分保持不变，发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。
1.3.3.2 发酵培养基氮源的优选及添加量的优化
以上述实验最佳结果为前提，发酵培养基氮源选择硫酸铵、玉米浆、氯化铵、硝酸钾、酵母膏、硝酸钠、大豆粉、麸皮、尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉，氮源添加量为10 g/L，培养基其他成分保持不变，发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。
选取较优的几种氮源做复合氮源实验，培养基其他成分保持不变，发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。以最优复合氮源为研究对象，培养基其他成分保持不变，总添加量分别为5、10、15、20、25、30 g/L，发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。
1.3.3.3 发酵培养基无机盐的优化
以上述实验最佳结果为前提，发酵培养基中无机盐只添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁和氯化钙中的一种，其添加量为0.5 g/L，发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。
1.3.3.4 Plackett-Burman设计
在工艺优化中，采用Plackett-Burman设计可以通过较少的试验次数从众多因素中快速筛选出对目的指标影响最大的显着性因素，以供进一步研究[32]。根据上述实验结果，用Design-Expert软件进行Plackett-Burman设计，筛选出对菌株产木糖苷酶影响比较显着的因素。发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。
1.3.3.5 最低添加量试验
以Plackett-Burman试验筛选出的不显着性因素为基础，以培养基最经济为目的，研究对黑曲霉CAN产木糖苷酶影响不显着因素的最低添加量。发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。
1.3.3.6 最陡爬坡试验
以Plackett-Burman试验筛选出的显着性因素为基础，为进一步确定最佳培养基组成，通过最陡爬坡试验确定这些显着因素的最佳区域。依据显着性因素正负效应，设计合理的步长，增加试验的密集度，逼近效果最好的区域[33]。发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。
1.3.3.7 中心组合试验设计
响应面试验通过合理地选取试验点和迭代策略，克服了传统方法的缺点，在对微生物培养条件和培养基成分选择的优化中均取得了显着的成效。根据上述试验结果，采用Design-Expert软件设计，对试验结果进行方差分析，依据回归方程绘制响应面三维立体分析图，并预测发酵培养基的最佳组成。发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。
1.4 数据统计分析
应用Design-Expert 8.0.6进行数据处理和分析，包括回归分析、二次多项式回归方程、方差分析和响应面图。所有实验重复3 次，数据表示为±s。
2 结果与分析
2.1 黑曲霉CAN产木糖苷酶发酵条件的优化
图1 发酵条件对CAN产木糖苷酶的影响Fig. 1 Effect of fermentation conditions on xylosidase activity of A. niger
由图1A可知，在发酵前期培养基中的营养物质主要用于菌株的生长繁殖。随着发酵时间的延长，产酶量逐步增加，当发酵时间到达144 h时酶活力达到最高。当发酵时间继续延长，随着发酵培养基中营养物质的消耗和有毒物质的积累导致发酵液中酶活力有所下降，故选择发酵周期为144 h[34]。
由图1B可知，当温度在25～34 ℃之间时，随着温度的升高，菌株产木糖苷酶活力随着升高，在温度34 ℃时，酶活力最高，当温度高于40 ℃时，木糖苷酶活力开始降低。由于微生物的生长和产物的合成需要在适宜的温度下进行，一般温度升高，生长代谢加快，但温度过高，会导致菌体提前衰老，产酶减少。同时温度还会影响微生物合成产物的方向。故选择发酵温度为34 ℃。
由图1C可知，当接种量从1%增加到7%时，发酵液中木糖苷酶活力最高，当接种量继续增大时，木糖苷酶活力开始下降。因为较大的接种量导致菌株生长过快，培养基黏度增加，溶氧不足，不利于菌株发酵产木糖苷酶，故选择最佳接种量为7%。
由图1D可知，当发酵液初始pH值为3.0，木糖苷酶活力最高。因为pH值会影响各种酶活力、菌对基质的利用速率和细胞的结构，从而影响菌的生长和产物的合成，同时已知大多数木糖苷酶在酸性条件下较稳定[27]，故选择发酵液初始pH值为3.0。
由图1E可知，当装液量为110 mL（300 mL三角瓶）时，木糖苷酶活力最高，此时的发酵液中的溶氧量最适合菌株发酵产木糖苷酶，故选择装液量为110 mL。
由图1F可知，当转速为180 r/min时，木糖苷酶活力最高，随着转速的增大，产生的剪切力会影响菌丝体的生长，导致菌株产木糖苷酶能力降低，故选择最适转速为180 r/min。
2.2 黑曲霉CAN产木糖苷酶发酵培养基的优化
2.2.1 发酵培养基碳源及碳源添加量的优选
图2 碳源种类（A）及碳源添加量（B）对CAN产木糖苷酶的影响Fig. 2 Effect of the type (A) and concentration (B) of carbon source on xylosidase activity of A. niger
由图2A可知，当发酵培养基碳源为玉米芯粉时，产木糖苷酶活力最高，麸皮次之。玉米芯粉和麸皮中木聚糖含量较高，能够诱导菌株产木糖苷酶[35]。其他可以被直接利用的碳源不能诱导菌株产酶或者对菌株产酶具有抑制作用[36-37]，故选择玉米芯粉为最佳碳源。
由图2B可知，当碳源添加量为25 g/L时，木糖苷酶活力最高，当碳源添加量过低时，营养物质供应不足，造成木糖苷酶活力较低。当碳源添加量过高时，培养基黏度增大，发酵过程中的传质和溶氧会受到影响，导致木糖苷酶活力较低，故选择碳源添加量为25 g/L。
2.2.2 发酵培养基氮源及氮源添加量的优选
图3 氮源种类（A）和氮源总添加量（B）对CAN产木糖苷酶的影响Fig. 3 Effect of the type (A) and concentration (B) of nitrogen source on xylosidase activity of A. niger
表1 复合氮源对CAN产木糖苷酶的影响Fig. 1 Effect of combinations of nitrogen sources on xylosidase activity of A. niger
细菌、霉菌和酵母都要利用氮元素合成酶，因此氮源的选择和添加量对微生物产酶至关重要。由图3A可知，菌株利用不同氮源产木糖苷酶活力差别较大，一般情况下，有机氮源比无机氮源对微生物内酶的合成与分泌具有更明显的促进作用[26,38]。因此选择蛋白胨、牛肉膏、酵母粉和硝酸钾做复合氮源实验。由表1可知，利用几种较优的单一氮源复合后，菌株产酶能力大都有所提高。因此选择最优的复合有机氮源配比，即蛋白胨-酵母粉1∶2。
由图3B可知，随着氮源总添加量的逐渐增加，菌株利用氮源合成木糖苷酶的量逐渐增加，氮源总添加量在10 g/L时，木糖苷酶活力最高，氮源总添加量超过10 g/L时，酶活力开始逐渐降低，故选择氮源添加量为10 g/L。
2.2.3 发酵培养基无机盐的优选试验
图4 无机盐种类对CAN产木糖苷酶的影响Fig. 4 Effect of different inorganic salts on xylosidase activity of A. niger
由图4可知，单一无机盐对菌株产酶的影响中，磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钾较优，故选择磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁、氯化钙进行后续Plackett-Burman试验。
2.2.4 Plackett-Burman试验结果
通过对单因素试验结果进行分析，可以基本确定Plackett-Burman设计所需的培养基组分，然后通过Plackett-Burman试验筛选得到培养基对菌株产酶有显着性影响的组分，以便对培养基的组分进行进一步优化。按照Design-Expert软件设计，次数20 次，每组3 个平行，试验设计与结果见表2。
表2 Plackett-Burman试验设计与结果Table 2 Plackett-Burman design with experimental results
由表3可知，回归模型的P值小于0.05，表明该模型显着。玉米芯粉、蛋白胨、硫酸镁的P值在95%的置信区间内小于0.05，即说明玉米芯粉、蛋白胨、硫酸镁这3 种培养基组成成分是影响CAN菌株产木糖苷酶的显着性因素，其中玉米芯粉、蛋白胨为正效应，硫酸镁为负效应。由方差分析可知，决定系数R2为0.873 1，表明87.31%的数据都能用此模型解释。
表3 Plackett-Burman设计回归模型方差及主效应分析Table 3 ANOVA of the mathematical model established based on Plackett-Burman design and significance test
2.2.5 最低添加量试验结果
根据Plackett-Burman设计试验得到的影响菌株产木糖苷酶的不显着因素，即酵母粉、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钙，做最低添加量试验，结果见表4。
表4 不显着因素的最低添加量试验Table 4 Results of lowest addition experiments on medium ingredients without significant influence on xylosidase activity of A. niger
由表4可知，本着降低生产成本和简化培养基组分的原则，选择各因素下酶活力达到峰值时所对应的添加量为其最低添加量，即磷酸氢二钾0 g/L、磷酸二氢钾0 g/L、氯化钠1.0 g/L、氯化钙1.5 g/L、酵母粉8.0 g/L。
2.2.6 最陡爬坡试验结果
根据Plackett-Burman设计回归分析和方差分析，显着性因素中玉米芯粉和蛋白胨为正效应，硫酸镁为负效应，按照各因素的正负效应设定最陡爬坡试验。其他成分为酵母粉8.00 g/L、氯化钠 1.00 g/L、氯化钙1.50 g/L。
表5 最陡爬坡试验设计与结果Table 5 Steepest ascent design with experimental results
由表5可知，当玉米芯粉、蛋白胨和硫酸镁添加量分别为30、4.0 g/L和0.8 g/L时，菌株产木糖苷酶活力最高，将其作为中心组合试验的中心点，进一步优化组分的添加量。
2.2.7 中心组合试验设计
表6 响应面二次式模型的方差分析Table 6 ANOVA of response surface quadratic model
通过最陡爬坡试验得到的玉米芯粉30.00 g/L、蛋白胨4.00 g/L、硫酸镁0.80 g/L为中心点，以木糖苷酶活力为响应值进行3因素5水平中心组合设计试验，其他发酵培养基成分为：酵母粉8.00 g/L、氯化钠1.00 g/L、氯化钙1.50 g/L。以酶活力作为响应值，利用软件构建二次式模型，模型方程为Ŷ=14.35+1.13A+0.95B-0.66C-0.48AB+0.69AC+0.12BC-0.70A2-0.49B2-0.36C2。由响应面二次式模型的方差分析可知，方程中A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2各项的P值均小于0.05，说明以上各项对产酶有显着性影响。同时失拟项检验P值大于0.05，则说明模型能与数据准确拟合。经回归方程方差分析结果验证表明，模型的P值小于0.05，方程具有统计学上的显着性，说明该模型与实验值拟合较好，适用于产酶的理论预测。
由表6可知，玉米芯粉和蛋白胨、玉米芯粉和硫酸镁之间存在着显着的交互作用，通过软件对回归方程中的AB、AC交互项绘制响应面分析图，如图5所示。
图5 玉米芯粉分别和蛋白胨添加量（a）、硫酸镁添加量（b）的交互作用对CAN产木糖苷酶的影响响应面图Fig. 5 Response surface plots showing the effects of interactions between corncob and peptone (a) as well as MgSO4 (b) on xylosidase activity of A. niger
由模型和软件分析可知得到极大值点所对应的各因素的编码值分别为0.31、0.74、-0.48，换算成实际值，分别是玉米芯粉31.55 g/L、蛋白胨5.48 g/L、硫酸镁0.70 g/L。在此预测最优培养基组分下木糖苷酶活力可以达到15.04 U/mL。用得到最佳培养基组成玉米芯粉31.55 g/L、酵母粉8.00 g/L、蛋白胨5.48 g/L、硫酸镁0.70 g/L、氯化钠1.00 g/L、氯化钙1.50 g/L，3 次重复实验平均酶活力为14.87 U/mL。实测值与回归方程预测值（15.04 U/mL）吻合良好。
3 结 论
采用单因素试验，确定黑曲霉发酵产木糖苷酶的最适发酵时间、发酵温度、接种量、初始pH值、装液量和摇瓶转速。然后在上述最佳发酵条件的基础上，结合Plackett-Burman、最低添加量、最陡爬坡试验和响应面法中心组合方法建立了黑曲霉发酵玉米芯粉产木糖苷酶工艺中木糖苷酶活力响应模型。经回归方程的方差分析表明，模型的P值小于0.05，方程具有统计学上的显着性，说明该模型与实验值拟合较好，适用于产酶的理论预测。用上述模型得到的最佳培养基组成为玉米芯粉31.55 g/L、酵母粉8.00 g/L、蛋白胨5.48 g/L、硫酸镁0.70 g/L、氯化钠1.00 g/L、氯化钙1.50 g/L，做3 次重复验证实验，平均酶活力为14.87 U/mL。实测值与回归方程预测值（15.04 U/mL）吻合良好。经过上述优化后菌株产木糖苷酶的活力是优化前的8.89 倍。
