芋艿采后主要病原菌分离鉴定及桧木醇抑菌效果

赵璐藐，郜海燕，刘瑞玲，丁玉庭，韩延超，陈杭君,*

（1.浙江工业大学食品科学与工程学院，浙江 杭州 310014；2.浙江省农业科学院食品科学研究所，农业农村部果品产后处理重点实验室，中国轻工业果蔬保鲜与加工重点实验室，浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，浙江 杭州 310021）

芋艿（Colocasia esculenta L. Schott）属天南星科，是多年生单子叶草本植物，其肉质球茎，富含淀粉，食用价值高，原产于中国、印度等热带沼泽地区[1-3]。浙江奉化是我国最早栽培芋艿的地区之一，奉化芋艿肉质细腻，个大皮薄，品质极佳，深受大众喜爱[4-5]。但新鲜芋艿水分高，采后易发生腐烂褐变[6]而失去商品价值，其采后病害问题已成为浙江芋艿产业发展的主要问题。

近年来，对芋艿的研究主要集中于田间病虫害及采后褐变。据文献报道，芋艿田间病害主要有芋疫病、炭疽病等[7-8]，均由真菌引起，病原真菌侵染是引起果蔬采后病腐的主要原因[9]，而目前关于芋艿采后病害问题鲜见报道。因此，分离鉴定芋艿采后主要病原菌，并针对性采取有效措施对减少芋艿采后贮藏损失及延长贮藏期具有重大意义。为了延长芋艿的保鲜期，前人研究以低温保鲜[10]为主，但低温不能有效阻止病原菌侵染，而植物提取物是存在于植物体内通过化学或物理方法提取出的具有有效抑菌作用的物质[11]。桧木醇是从扁柏树中提取的一种单萜类天然化合物[12]，具有抗菌、抗氧化以及抗肿瘤功效，是高安全性的植物提取成分[13-14]。有研究表明，桧木醇可控制桃子和茄子等采后病害[15]，且能维持采后龙眼品质[14]，而其在芋艿采后病原菌控制方面还鲜见研究。

本研究采用传统菌种分离法对浙江奉化芋艿采后常温贮藏过程中的病原菌进行分离纯化，并对其进行形态学及rDNA-ITS序列分子学鉴定，旨在明确主要病原菌的种类；同时研究桧木醇溶液处理对芋艿采后主要病原菌的抑菌效果，以期为后续采取针对性的研发绿色防腐保鲜技术提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芋艿采自浙江宁波奉化芋艿基地，选择大小均一、无明显病虫害的健康芋艿，于室温下贮藏。贮藏期间，定期观察发病情况并将其病原菌分离进行后续实验。

桧木醇（纯度＞99%） 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）、马铃薯葡萄糖肉汤培养基（potato dextrose broth，PDB） 上海盛思生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

MLS-3781L-PC高压蒸汽灭菌器 松下健康医疗器械株式会社；MJX-160B-Z霉菌培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；超净工作台 江苏苏净集团有限公司；H7650透射电子显微镜 日本Hitachi公司；UV9000紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；HZQ-F160全温振荡培养箱 太仓市实验设备厂；axio-vert倒置荧光显微镜 卡尔·蔡司股份公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌分离纯化

参照文献[16]，将贮藏过程中自然发病的芋艿按不同病症分组，采用常规组织分离法对病原菌进行分离纯化，反复纯化出现单菌落后转接斜面培养，菌种编号并低温保存，用于菌落形态观察及鉴定。

1.3.2 病原菌致病性检测

选用健康无伤的芋艿，采用针刺法将纯化后的丝状真菌块回接至芋艿刺伤部分，以不接真菌块为对照，于室温贮藏，定期观察芋艿发病症状，显出病症后再次对其进行分离鉴定，观察菌株是否与接种菌一致，以便判断主要致病菌。每个病原菌处理3 个重复。

1.3.3 病原菌形态观察

将保存的纯病原菌活化，并接种于PDA培养基中，25 ℃恒温箱培养至产孢，于荧光显微镜下观察菌丝体及孢子形态并拍照。

1.3.4 病原菌rDNA-ITS序列与系统发育分析

采用CTAB法提取和纯化基因组DNA[17]。利用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）对病原菌的基因组DNA进行PCR扩增，引物合成委托杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。扩增程序：98 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，35 个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

上述扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的片段进行回收，由杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。将测序结果提交到GenBank数据库，并利用NCBI网站进行BLAST比对分析，寻找同源性较高的已知序列。利用Neighbor-Joining法[18]构建菌株亲缘关系较近的系统发育树，结合菌株形态，确定菌株种属。

1.3.5 体外抑菌

将一定量已配制好的桧木醇溶液加入已灭菌的PDA培养基中，制成桧木醇质量浓度为0、10、20、30、40、50、60、80、100 mg/L的平板。用无菌打孔器在病原菌平板上取直径6 mm的菌块，放入PDA平板中央，在25 ℃条件下培养，定期观察菌落，用游标卡尺测量菌落直径并记录，实验重复3 次求平均值。

1.3.6 孢子萌发率测定

参考Li Jiangkuo[19]和周灵灵[20]等方法，稍作修改。在无菌条件下，将病原菌孢子悬浮液分别混合于不同质量浓度桧木醇的葡萄糖溶液中，分别取不同质量浓度的终液50 µL滴入双凹载玻片，将载玻片放置在培养皿中（直径200 mm），于25 ℃培养箱中保湿培养，在第6、12、18小时于显微镜下观察孢子萌发情况，每处理镜检孢子数不少于100 个，以芽管长度超过孢子直径一半计为孢子萌发。实验重复3 次，孢子萌发率计算公式如下：

1.3.7 丙二醛浓度测定

病原菌细胞膜脂质过氧化程度可用丙二醛（malondialdehyde，MDA）浓度作为指标进行测定。参考Li Jiangkuo等[19]的方法，稍作修改。称取2.5 g（湿质量）的菌丝体加入含有合适浓度的桧木醇溶液的PDB液体培养基中，摇床（25 ℃，140 r/min）培养0、3、6、9、12、24 h后，分别取2 mL上清液采用硫代巴比妥酸法测定吸光度，实验重复3 次。

1.3.8 透射电镜观察

菌丝固定采用戊二醛、锇酸双重固定法。称1 g菌丝（湿质量）浸泡于3%戊二醛室温下固定过夜，用pH 6.8的磷酸盐缓冲液反复冲洗15 min后用1%的锇酸固定2 h（4 ℃），再经乙醇梯度脱水、包埋、聚合。聚合后进行切片处理，超薄切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，于透射电镜下观察菌丝体并拍照。

1.4 数据处理与分析

实验数据用Microsoft Office Excel 2010软件整理，采用SPSS Statistics 23软件进行差异显着性分析（P＜0.05，差异显着），图片绘制采用Origin 2017以及Photoshop CS4。

2 结果与分析

2.1 芋艿采后病原菌的分离鉴定

2.1.1 病原菌分离纯化及致病性检测结果

根据科赫法则，从芋艿的自然发病部位分离出3 株真菌，编号为CE-1、CE-2、CE-3，回接致病（图1d、h）和再分离纯化后确定芋艿采后致病菌为CE-1和CE-2，此2 种菌株能不同程度地导致芋艿发病腐烂，初期均从采摘受损处发病。CE-1菌使芋艿表皮出现白色绒状物病斑，而后长出白色菌丝使其腐烂，CE-2菌使表皮出现褐变进而软化，直至长出灰黑色疏松菌丝。

CE-1菌在PDA培养基上25 ℃培养5 d后菌落形态如图1b所示，CE-1菌落圆形，菌丝为白色或浅灰色，形如羊绒，菌落背面略带黄色。菌丝有隔，分生孢子两端较尖，呈镰刀型或纺锤形，孢体稍弯曲（图1c）。CE-2菌在PDA培养基上25 ℃培养3 d后菌落形态如图1f所示，CE-2菌落圆形，绒状菌丝丛，初期白色，后期转为炭黑色，且随培养时间的延长，产生少许菌核。菌丝有隔，分枝，分生孢子黑褐色，卵圆形，基部平截，端部钝圆，壁厚（图1g）。

图1 芋艿贮藏期发病果实病害症状、分离菌株菌落形态特征及其回接症状Fig. 1 Symptoms of postharvest diseases on taro, and morphology and pathogenicity of pathogens

2.1.2 病原菌rDNA-ITS序列和系统发育树分析

以病原菌基因组DNA为模板，采用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，2 个病原菌菌株均获得1 条500 bp左右的扩增条带。将其序列在NCBI中进行BLAST比对发现，菌株CE-1与镰刀菌属序列相似度达99%以上，菌株CE-2与可可毛色二孢菌序列相似度达99%以上，可信度较高。选取同源性高低不同的菌株进行多重序列比较和系统发育树构建（图2），结果表明：菌株CE-1与茄病镰刀菌（Fusarium solani，登录号：KF938479.1）亲缘关系较近，与禾谷镰刀菌（F. graminearum，登录号：KT318586.1）及层生镰刀菌（F. proliferatum，登录号：KU984710）等镰刀菌亲缘关系较远。菌株CE-2与可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae，登录号：MH454030.1）聚为一类。因此，结合2 种病原菌的形态特征鉴定，rDNA-ITS序列分析以及系统发育树构建，确定引起芋艿采后病害的主要病原菌为Fusarium sp.和L. theobromae。

图2 基于ITS基因序列构建的系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree based on ITS sequences

2.2 桧木醇对芋艿采后病原菌的抑菌活性

2.2.1 桧木醇体外抑菌效果

2 种病原菌菌落生长速度不同，CE-1长满培养皿需5 d时间，而CE-2则在2 d长满。从图3可以看出，桧木醇溶液对芋艿采后2 种病原菌均有一定的抑菌效果，且随质量浓度的升高抑制能力增强，相对来说，桧木醇对CE-2的抑制能力要弱于CE-1。质量浓度为10 mg/L的桧木醇溶液对CE-1菌丝生长有明显的抑菌效果，在培养3 d后不同质量浓度处理间菌丝生长有显着差异（P＜0.05），且质量浓度为50 mg/L的桧木醇溶液完全抑制了CE-1的生长。对于CE-2，桧木醇质量浓度为40 mg/L时对菌丝生长有明显抑制作用，在培养2 d后不同质量浓度处理间菌丝生长有显着差异（P＜0.05），且质量浓度为100 mg/L时完全抑制CE-2的生长。

图3 桧木醇处理对CE-1和CE-2菌丝生长的影响Fig. 3 Inhibitory effects of hinokitiol at different concentrations against mycellial growth of the two pathogens

2.2.2 桧木醇对病原菌孢子萌发率的影响

图4 桧木醇处理对CE-1病原菌孢子萌发的抑制效果Fig. 4 Inhibitory effects of hinokitiol at different concentrations on spore germination of the pathogens

为研究桧木醇对病原菌孢子萌发的抑制效果，进一步分析了桧木醇溶液对CE-1在培养第6、12、18小时的孢子萌发率。由图4可以看出，随着桧木醇质量浓度的增加，CE-1孢子萌发率显着降低（P＜0.05），18 h对照组孢子萌发率达到91.33%，而40 mg/L和80 mg/L桧木醇处理组孢子萌发率仅分别为32%和9.67%，其中孢子萌发抑制率分别约为66%和90%。在进行CE-2孢子萌发实验时，采用普通培养基培养，发现产孢子困难，这与Saha等[21]研究结果一致。进一步采用燕麦培养基及连续光照等方法进行优化培养，培养26 d后产孢量依然很少，不具备统计学意义。因此，在一定质量浓度范围内，桧木醇能显着抑制CE-1病原菌孢子的萌发，也由此抑制其菌丝生长。

2.2.3 桧木醇对菌丝膜脂过氧化的影响

MDA是膜脂过氧化的主要产物，是衡量膜系统氧化损伤的重要指标之一[22]。为能明显看出抑菌效果，选取抑菌率为60%以上的桧木醇处理菌种，即以40 mg/L质量浓度处理CE-1和80 mg/L质量浓度处理CE-2。从图5a可以看出，质量浓度为40 mg/L桧木醇溶液处理CE-1，在处理6 h后MDA浓度开始超过对照组并始终保持上升，于第24小时达到最高水平。从图5b可以看出，质量浓度为80 mg/L桧木醇溶液处理CE-2，其MDA浓度始终高于对照组。由此可见，桧木醇能够诱导芋艿采后两种病原菌菌丝膜脂质过氧化，加剧膜的损伤，促进MDA的大量积累。MDA可与真菌的蛋白质及核酸发生相应反应，从而改变其结构，破坏其生物学功能，致使真菌死亡。

图5 桧木醇处理对2 种病原菌菌丝脂质过氧化影响Fig. 5 Effects of hinokitiol on membrane lipid peroxidation of the two pathogens

2.2.4 桧木醇对菌丝体亚细胞结构的影响

由图6可知，桧木醇处理对CE-1和CE-2的亚细胞结构有明显破坏的影响，对照组的2 种菌菌丝体细胞壁层次清楚，有明确界限的质膜，厚度均匀且细胞器完整未受损伤。而经桧木醇处理后的CE-1细胞膜部分模糊，厚度不均匀，菌丝体内部分细胞质解体出现空腔（图6A、B）。CE-2菌丝体膜有溶解迹象，且菌丝体内细胞器液泡化（图6C、D）。2 种病原菌细胞完整性均遭到破坏，表明桧木醇对镰刀菌属和可可毛色二孢菌菌丝体有一定的破坏作用，促使膜脂质过氧化而造成膜损伤，改变膜通透性，从而达到抑菌效果。

图6 桧木醇处理对2 种病原菌菌丝体亚细胞结构的影响Fig. 6 Transmission electron micrographs of the two pathogens treated and not treated with hinokitiol

3 讨论与结论

本研究通过形态学观察、分子生物学鉴定以及致病性检测方法，初步确定引起芋艿采后腐烂变质的主要病原菌为镰刀菌属（Fusarium sp.）和可可毛色二孢菌（L. theobromae）。此2 种菌均能对芋艿采后造成不同程度的病变，其中可可毛色二孢菌引起的芋艿果实采后病害为国内首次报道。可可毛色二孢菌可引起龙眼焦腐病[23]、橡胶树叶斑病[24]、桑树根腐病[25]以及枇杷采后病害[26]，具有一定的致病力。守川俊幸等[27]研究发现茄病镰刀菌可引起低温贮藏的富山县芋头发病，这与本研究分离出镰刀菌属菌株有相同之处。可能各地区不同品种芋艿采后病害不尽相同，而是否均能致病且有无存在复合侵染还有待进一步研究。

我国植物资源丰富，其产生的次生代谢产物有40多万 种，不同植物有不同的抑菌活性成分，其结构类型涉及醇类、萜类、生物碱类、精油类等化合物均有抑菌、杀菌或抗菌的功效[28]。研究表明，芳樟醇和柠檬醛[29]、香茅醇[30]、肉桂精油[31]、黄帚橐吾[32]等植物提取物分别对柑橘褐色蒂腐病菌、镰刀菌属、蓝莓采后致病菌以及辣椒疫霉菌有较好的抑菌作用。Zhou Ting等[33]研究发现癸烷精油能够显着抑制青霉菌（Penicillium expansum）的菌丝生长和孢子萌发，从而发挥抑制青霉病的作用。刘瑞玲等[34]采用体外直接接触法和体外熏蒸法，研究了香芹酚精油、肉桂精油和百里香精油对火龙果采后主要病原菌层生镰刀菌（F. proliferatum）和平头炭疽菌（Colletotrichum fructicola）的抑制效果，发现香芹酚精油表现出较强的抑菌性，可作为火龙果贮藏前的熏蒸剂。桧木醇从柏科树木中提取，天然安全，具有良好的抗真菌活性，研究发现其能抑制灰霉病菌，是良好的食品防腐剂和发芽抑制剂[35]，有持久的抗菌效果，然而，目前关于桧木醇对果蔬采后病原菌的抑制作用及可能的作用机理鲜有报道。

本研究通过体外平板抑菌实验，明确了桧木醇溶液对芋艿采后两种主要病原菌的抑制作用，50 mg/L的桧木醇溶液能完全抑制镰刀菌属真菌的生长，这与Morita等[36]研究结果一致。同时，100 mg/L桧木醇溶液可完全抑制可可毛色二孢菌的生长。有文献报道，桧木醇可抑制各类腐霉菌的体外菌丝生长[15]，这给本研究结果提供了理论依据，且研究发现桧木醇溶液浓度越大对病原菌的抑制率越大。进一步通过其对病原菌孢子萌发、菌丝体脂质过氧化以及亚细胞结构的影响判断对病原菌的破坏程度，初探其作用机理。镰刀菌属孢子萌发受桧木醇在一定程度上的抑制，采用40 mg/L和80 mg/L桧木醇溶液分别处理镰刀菌属和可可毛色二孢2 种病原菌，发现均能使菌的MDA浓度比对照组的高，表明膜脂过氧化严重，可能膜系统结构遭到破坏，从而促使细胞死亡，抑制菌丝的生长。透射电镜的观察发现桧木醇破坏菌丝的亚细胞结构，推测其作用于真菌细胞膜导致通透性增加，直接接触线粒体等亚细胞器，造成其损伤，引起细胞能量代谢障碍，最终导致真菌细胞死亡，也进一步证实以上结论。

近几年对桧木醇的研究主要集中于人体医学和营养学方面的应用，而在食品保鲜领域较少报道。本实验分离鉴定出芋艿采后主要病原菌，并对桧木醇处理此两种病原菌的抑制效果进行了初步研究，对进一步开发绿色、安全、高效的芋艿防腐保鲜技术提供了理论参考价值，而至于桧木醇的抑菌机理尚未清晰，还需后续实验更进一步阐明。