铁皮石斛多糖提取及对羟自由基诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的抑制作用

张雅丹,赵梦倩,杨煜佼,徐友志,王梓郡,王焱君,许迪雅,张 琳,*,周彬彬,2,*

(1.特医食品加工湖南省重点实验室,稻谷及副产物深加工国家工程实验室,中南林业科技大学食品科学与工程学院,湖南 长沙 410004;2.湖南省食品质量监督检验研究院,湖南 长沙 410117)

阿尔兹海默症,俗称老年痴呆,是一种神经退行性疾病。随着我国人口老龄化问题的加剧,老年痴呆患者的人数也在不断增加,2050年我国老年痴呆病患者将会达到2 700万甚至更多[1]。目前对于老年痴呆发病机制的认识主要集中于β淀粉样蛋白的沉积[2]、tau蛋白的过度磷酸化[3]以及氧化应激损伤[4]等。以Cu2+作为催化剂,催化H2O2反应产生羟自由基进而引起神经细胞的氧化应激,使神经细胞出现损伤甚至发生凋亡,这是导致阿尔兹海默症的一个重要假说机制[5-6]。

铁皮石斛是我国一种传统的名贵中药,可以清热滋阴,生津益胃,有着丰富的药用价值[7]。铁皮石斛中含有大量的活性成分,如石斛碱、石斛糖类、芪类及其衍生物、多糖、氨基酸、微量元素以及多种挥发性物质[8]等。医学研究表明,铁皮石斛具有抗衰老、抗肿瘤[9]、降低血糖[10]、提高免疫功能[11-12]等作用,对恶性肿瘤、胃肠道疾病、糖尿病、白内障、关节炎、血栓闭塞性脉管炎及慢性咽炎等疾病具有很好的疗效。

目前铁皮石斛多糖的提取方法主要是水提醇沉法[13]、超声法[14]、酶提法[15]、超高压提取法[16]、超微粉碎法[17]、闪式提取法[18]等。己有研究发现铁皮石斛多糖具有一定的抗氧化特性,可以清除超氧阴离子自由基并且可以显着提高小鼠肝组织及血清中谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶活力,降低丙二醛含量[19]。除此之外,铁皮石斛多糖还具有清除氧自由基和抗脂质过氧化的能力[20],在增强免疫力[21]、抑制肿瘤[22]、抗癌[23]和抗衰老[24]方面有着广泛的用途。但是铁皮石斛多糖对羟自由基诱导的神经细胞凋亡的抑制作用鲜见报道。本研究通过单因素试验和正交试验优化铁皮石斛多糖的提取工艺,并利用优化工艺后的铁皮石斛多糖提取物针对其抗氧化作用和对羟自由基诱导的SH-SY5Y细胞凋亡进行研究,探讨铁皮石斛多糖提取物对于神经细胞的保护作用,以期为老年痴呆症的治疗提供新的方向并为铁皮石斛多糖的相关产品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铁皮石斛 深圳市源汇升生物科技有限公司;纤维素酶(酶活力1 000 U/g)、果胶酶(酶活力10 000 U/g)、中性蛋白酶(酶活力50 000 U/g) 上海基免实业有限公司;果糖、甘露糖、葡萄糖(均为食品级) 上海源叶生物科技有限公司;三氟乙酸(分析纯) 上海麦克林生化科技有限公司;乙腈(分析纯) 瑞典Oceanpak公司;CuSO4·5H2O、H2O2(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司;抗坏血酸(分析纯) 北京鼎国昌盛生物技术有限公司;SH-SY5Y细胞 中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心;噻唑蓝(methyl thiazoly1 tetrazolium,MTT)、香豆素-3-羧酸(coumarin-3-carboxylic acid,CCA) 美国Sigma公司;DMEM/F12(1∶1)培养基、胎牛血清、0.25%胰酶(含EDTA) 美国Gibico公司;流式凋亡检测试剂盒 美国Promege公司。

1.2 仪器与设备

DK-522电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司;SB-5200超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;YRE-5299旋转蒸发仪 巩义市予华仪器有限责任公司;722S紫外-可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;DNM-9602酶标仪 北京普朗新技术有限公司;F-4600荧光分光光度计 日本Hitachi公司;S111 CO2培养箱 美国Thermo Electron公司;AV52428流式细胞仪 美国Beckman公司;LC-20AT高效液相色谱仪 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 铁皮石斛多糖提取工艺的优化

1.3.1.1 铁皮石斛多糖的提取

准确称取铁皮石斛粉末0.5 g,用蒸馏水将其溶解,用0.1 mol/L NaOH溶液调pH值为5.4,再加入一定浓度的复合酶(纤维素酶和果胶酶1∶1等质量混合),40 ℃水浴2 h后,90 ℃灭酶10 min,冷却至室温。将所得物进行一定时间的超声提取,4 000 r/min离心15 min,取上清液置于旋转蒸发仪中进行浓缩。所得浓缩液再加入4 倍体积的95%乙醇溶液沉淀8 h,4 000 r/min离心15 min,沉淀物即为铁皮石斛粗多糖。用30 mL蒸馏水溶解粗多糖,用0.1 mol/L NaOH溶液调pH值为7.0,再加入0.9 g中性蛋白酶,50 ℃水浴酶解4 h,加入氯仿-正丁醇(4∶1,V/V)的混合试剂6 mL,磁力搅拌1 h。4 000 r/min离心15 min,提取物分为3 层,去掉中间层的变形蛋白后,重复操作,直至无变形蛋白析出。将所得液体置于分液漏斗中静置。溶液分为2 层,去除下层有机溶剂,上层即为多糖溶液[25-26]。将多糖溶液经冷冻干燥后粉碎成粉末。

1.3.1.2 铁皮石斛多糖得率测定

采用苯酚-硫酸法[27]测定多糖,准确称取葡萄糖标准品20 mg,加入蒸馏水定容至500 mL,分别移取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL标准液于试管中,加蒸馏水至2 mL。加入6%苯酚1 mL和浓硫酸5 mL,室温放置20 min后于波长490 nm处测其吸光度,绘制标准曲线Y=0.087 9X－0.032 09(R2=0.997 8),Y为吸光度,X为多糖含量。按式(1)计算铁皮石斛多糖得率:

1.3.1.3 单因素试验

料液比的确定:在超声时间1 h、复合酶(纤维素酶和果胶酶1∶1等质量混合)质量分数10%条件下,分别测定料液比为1∶30、1∶50、1∶100、1∶150、1∶200(g/mL)时多糖得率;超声时间的确定:在料液比1∶100(g/mL)、复合酶质量分数40%条件下,分别测定超声时间为1、1.5、2、2.5、3 h时多糖得率;复合酶质量分数的确定:在料液比1∶100(g/mL)、超声时间1.5 h条件下,分别测定复合酶质量分数10%、20%、30%、40%、50%时多糖得率。

1.3.1.4 正交试验设计

根据单因素试验结果,采用L9(34)正交表设计3因素3水平正交试验,对铁皮石斛多糖提取工艺进行优化[28-29],各因素及水平设计如表1所示。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and their levels used in orthogonal array design

1.3.2 铁皮石斛多糖的组成成分分析

准确称取5 mg果糖、甘露糖、葡糖糖溶于5 mL超纯水中得到单糖母液。

准确称取冷冻干燥后的粉末50 mg,溶解于10 mL超纯水中。分别吸取5 mL多糖溶液于2 个玻璃瓶中,其中一瓶不进行水解,另外一瓶加入4 mol/L三氟乙酸溶液5 mL,120 ℃油浴水解2 h。用6 mol/L NaOH溶液调节pH值至中性,未水解与水解过的多糖溶液均过0.45 μm滤膜,备用。

高效液相色谱检测条件:氨基柱(250 mm×4.6 mm,5 µm);柱温35 ℃;流动相:超纯水-乙腈(75∶25,V/V);流速1 mL/min;进样量20 μL。蒸发光散射器条件:氮气流速2.4 L/min,漂移管温度95 ℃。

1.3.3 CCA荧光标记法测定羟自由基清除率

向终浓度为6 μmol/L Cu2+和40 μmol/L H2O2的溶液中加入100 μmol/L pH 7.4的CCA溶液以及pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液制成150 μL的测定液,外覆锡箔纸避光。设置激发波长390 nm,将上述测定液加入到微量比色皿中,测定其在波长450 nm处的荧光强度。在以上混合液中再加入10 mmol/L抗坏血酸或不同质量浓度的铁皮石斛多糖提取物,重复测定操作。

1.3.4 SH-SY5Y细胞培养

将SH-SY5Y细胞接种于含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM/F12培养基中,置于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。待细胞长到培养皿的80%～90%时对其进行传代,根据细胞的生长速率定时对其进行换液。

1.3.5 MTT法测定细胞存活率

SH-SY5Y细胞培养至可传代状态,经胰酶消化后,取适量细胞液于血球计数板上,细胞计数后,将每孔接种了2×105个细胞的96 孔板置于含5% CO2、37 ℃培养箱中培养6 h使其贴壁生长。吸除上述96 孔板中的培养基,配制一定质量浓度梯度的铁皮石斛多糖提取物(20、40、60、80、100、120、140、160 μg/mL),分别加入到96 孔板中各100 μL,同时设置空白组和对照组于同一板上,置于CO2培养箱中培养24 h使其贴壁生长。吸除上述96 孔板中的药液,配制含10% MTT的培养基,加入到板中各孔100 μL,置于CO2培养箱中培养4 h。吸除上述96 孔板中的药液,各孔加入100 μL的二甲基亚砜试剂,用酶标仪在波长492 nm处测定吸光度并记录数值,计算得出细胞存活率,得到无毒性损伤的最大质量浓度值。再将6 μmol/L Cu2+和40 μmol/L H2O2连同10 mmol/L抗坏血酸或无损伤质量浓度的铁皮石斛多糖提取物一同加入到细胞中,重复MTT比色法实验,根据式(2)计算细胞存活率。

式中:A0为空白组吸光度;A1为对照组吸光度;A2为实验组吸光度。

1.3.6 流式细胞仪测定细胞凋亡

将SH-SY5Y细胞培养至可传代状态,经胰酶消化后吹打成单个细胞,向6 孔板中每孔加入0.5 mL细胞液,再加入1 mL培养基,置于含5% CO2、37 ℃培养箱中培养6 h使其贴壁生长。将上述6 孔板中的培养基吸掉,分别加入80 μg/mL铁皮石斛多糖、6 μmol/L Cu2+、40 μmol/L H2O2、40 μmol/L H2O2+6 μmol/L Cu2+、40 μmol/L H2O2+6 μmol/L Cu2++20 μg/mL铁皮石斛多糖、40 μmol/L H2O2+6 μmol/L Cu2++40 μgm/L铁皮石斛多糖、40 μmol/L H2O2+6 μmol/L Cu2++60 μg/mL铁皮石斛多糖、40 μmol/L H2O2+6 μmol/L Cu2++80 μg/mL铁皮石斛多糖溶液各1 mL,同时设置空白对照组,在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h。将6 孔板中不同处理组的SH-SY5Y细胞溶液收集到15 mL离心管中,收集好的细胞1 000 r/min离心5 min,弃上清液,每管中加入1 mL的1×结合液重悬细胞,再加入4 μL异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)和4 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI),通过流式细胞仪测定细胞的凋亡率。

1.4 统计学分析

使用SPSS 17.0对实验结果进行数据分析,两组间均数比较用t检验进行,组间均数比较用单因素方差分析进行,P＜0.05及P＜0.01均为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛提取条件的单因素试验结果

2.1.1 料液比对铁皮石斛多糖得率的影响

图1 料液比对铁皮石斛多糖得率的影响Fig. 1 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction yield of D. officinale polysaccharides

如图1所示,料液比在1∶30～1∶100时,多糖得率随提取液使用量的增加而上升,这是由于当料液比大于1∶100时,蒸馏水过少导致铁皮石斛多糖不能完全从物料中溶出,因此多糖得率会随着蒸馏水的增多而增加;料液比在1∶100～1∶200时,多糖得率随着提取液使用量上升而出现下降趋势,这是由于溶剂的增加导致其对超声波能量吸收增多,而铁皮石斛粉末对于超声波能量的吸收减少[30],使细胞壁不能完全破碎,多糖的溶出被抑制[31]。因此,选取1∶50、1∶100、1∶150(g/mL)作为正交试验的3 个水平。

2.1.2 复合酶质量分数对铁皮石斛多糖得率的影响

由图2可知,在复合酶质量分数为10%～50%(酶质量占铁皮石斛物料质量的百分数)的范围内,随着复合酶质量分数的增大,铁皮石斛多糖得率上升,当其质量分数达到40%以后,得率增长趋势变缓。这是因为在复合酶量小于40%时,随着酶质量分数的增加,酶对铁皮石斛细胞壁的破坏程度加强,因此加快活性成分溶出细胞的速率,提高得率;但当酶质量分数大于40%时,大部分细胞壁己经被破坏,再加大酶量对得率的影响减小。综合得率和成本,选取30%、40%、50%作为正交试验的3 个水平。

图2 复合酶质量分数对铁皮石斛多糖得率的影响Fig. 2 Effect of enzyme concentration on extraction yield of D. officinale polysaccharides

2.1.3 超声时间对铁皮石斛多糖得率的影响

图3 超声时间对铁皮石斛多糖得率的影响Fig. 3 Effect of ultrasonication time on extraction yield of D. officinale polysaccharides

由图3可知,在1～3 h内,随着超声时间的延长,铁皮石斛多糖得率呈上升趋势。当超声时间小于1.5 h时,多糖得率的升高较为明显,但当超声时间大于1.5 h时,多糖得率没有明显增加,这是由于因分子运动引起的溶质溶出己经接近平衡[32],再延长超声时间并不会对得率有显着作用。综合考虑得率和节能省时的因素,选取1、1.5、2 h作为正交试验的3 个水平。

2.2 正交试验结果

表2 L9（34）正交试验设计及结果Table 2 L9(34) orthogonal array design with experimental results

由表2可知,各因素对于多糖得率的影响程度为复合酶质量分数＞料液比＞超声时间。酶解超声法提取铁皮石斛总糖的最佳工艺组合为A2B3C3。经验证实验,最佳工艺组合为A2B3C3平均得率为25.69%,因此,确定最佳提取条件为料液比1∶100(g/mL)、复合酶质量分数50%、超声时间2 h。

2.3 铁皮石斛多糖的单糖组成

图4 单糖标准品（A）和水解后铁皮石斛多糖提取物（B）色谱图Fig. 4 HPLC chromatograms of mixed monosaccharide standards (A) and monosaccharides derived from D. officinale polysaccharides (B)

为确定铁皮石斛多糖提取物中单糖的组成成分,以果糖、甘露糖和葡萄糖作为标准品,采用高效液相色谱法[33]对铁皮石斛多糖组分进行测定。如图4A所示,混合标样中3 种单糖的流出顺序及保留时间分别为果糖7.678 min、甘露糖8.795 min、葡萄糖9.730 min。未水解的铁皮石斛多糖样品进样后,仅在2.5 min左右有一个大的色谱峰,其他位置并未有色谱峰出现。这是因为非单糖组分在糖柱中会快速被冲洗出来,在柱中并不会有保留,因此在本实验条件下,在未水解的铁皮石斛多糖样品中并未有单糖被检出(因其色谱峰在标样位置并没有峰,因此未附图)。经水解后的铁皮石斛多糖中有2 种单糖被检出,如图4B所示,保留时间分别为8.754 min和9.687 min,因此推断铁皮石斛多糖中主要的单糖组成分别为甘露糖和葡萄糖。

2.4 铁皮石斛多糖提取物对Cu2+催化H2O2产生羟自由基清除作用

在老年痴呆病人脑中,有过量沉积的Cu2+,其浓度高达0.4 mmol/L[34],而细胞代谢和体内氧化还原反应会产生一定量的H2O2[35],Cu2+可催化H2O2生成羟自由基,进而诱导氧化应激效应,导致神经细胞凋亡[36-37]。因此研究铁皮石斛多糖对Cu2+催化H2O2产生的羟自由基的清除效果对于研究其对神经细胞的保护作用有重要意义。如图5所示,抗坏血酸具有一定的清除Cu2+催化H2O2产生的羟自由基的能力,但是对比铁皮石斛多糖,10 mmol/L抗坏血酸羟自由基清除率为43.02%,而20 μg/L的铁皮石斛多糖,羟自由基清除率达71.73%,当继续增加铁皮石斛的质量浓度时,羟自由基清除率并没有显着变化。因此,铁皮石斛多糖具有清除羟自由基的能力,且其能力大于抗坏血酸。

图5 抗坏血酸和铁皮石斛多糖提取物对H2O2/Cu2＋产生的羟自由基的清除作用Fig. 5 Hydroxyl radical scavenging capacity of ascorbic acid and D. of ficinale polysaccharides

2.5 铁皮石斛多糖提取物对SH-SY5Y细胞的保护作用

2.5.1 对SH-SY5Y细胞存活率的影响

图6 铁皮石斛多糖提取物对SH-SY5Y细胞存活率的影响Fig. 6 Effect of Dendrobium of ficinale polysaccharides on the viability of SH-SY5Y cells

如图6所示,当铁皮石斛多糖质量浓度小于80 μg/mL时,基本对细胞存活率无显着影响(P＞0.05);而当铁皮石斛多糖质量浓度大于80 μg/mL时,细胞存活率会极显着降低(P＜0.01)。证明高质量浓度(大于80 μg/mL)的铁皮石斛多糖具有一定的神经细胞毒性。这可能是因为过高的多糖浓度会引起细胞渗透压的改变,从而引起细胞毒性[38]。

2.5.2 对Cu2+催化H2O2产生羟自由基造成的SH-SY5Y细胞存活率下降的抑制作用

图7 H2O2、Cu2＋、抗坏血酸和铁皮石斛多糖提取物对细胞存活率的影响Fig. 7 Effects of H2O2, Cu2＋, ascorbic acid and D. of ficinale polysaccharides,alone and in combination, on the viability of SH-SY5Y cells

如图7所示,单独Cu2+溶液的细胞存活率可达93.33%,单独H2O2的细胞存活率为57.67%,H2O2/Cu2+混合溶液细胞存活率下降到43.63%,这是因为Cu2+催化H2O2产生的羟自由基具有比H2O2更强的神经细胞毒性[39]。当加入10 mmol/L抗坏血酸时,细胞存活率上升至55.53%,而随着不同质量浓度铁皮石斛多糖的加入,细胞存活率从60.20%上升到83.82%。证明铁皮石斛多糖具有抑制由H2O2/Cu2+产生的羟自由基诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的能力,且其能力远大于抗坏血酸。

2.5.3 对Cu2+催化H2O2产生的羟自由基诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的抑制作用

图8 铁皮石斛多糖粗提物抑制HO/Cu2＋诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的22流式图（A）和凋亡率图（B）Fig. 8 Flow cytometric patterns (A) and apoptosis rates (B) of SH-SY5Y cells in the presence of different concentrations of D. of ficinale polysaccharides, 40 μmol/L H2O2 and 6 μmol/L Cu2＋separately and in combination

利用流式细胞法研究铁皮石斛多糖对羟自由基诱导的神经细胞凋亡的抑制作用,结果如图8所示,细胞凋亡分为早凋和晚凋,即a2+a4为细胞凋亡率。对照组细胞的凋亡率为15.62%,单独H2O2处理的细胞的凋亡率为55.20%,单独Cu2+处理的细胞的凋亡率为22.26%,H2O2/Cu2+混合溶液中细胞凋亡率为56.97%。随着铁皮石斛多糖的加入,在20～80 μg/mL范围内,细胞的凋亡率随铁皮石斛多糖提取物质量浓度增大而减小,由56.97%降至17.97%。证明铁皮石斛多糖能够有效抑制Cu2+催化H2O2产生的羟自由基诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。

3 结 论

采用酶解超声提取法提取铁皮石斛多糖,通过单因素试验和正交试验确定最佳的提取条件为料液比1∶100(g/mL)、超声时间2 h、复合酶质量分数50%,此时多糖得率为25.69%。通过高效液相色谱法测得铁皮石斛多糖中含有甘露糖和葡萄糖2 种单糖。通过羟自由基清除实验和MTT细胞存活率及细胞流式实验,证明铁皮石斛多糖可以通过清除Cu2+催化H2O2产生的羟自由基,从而有效抑制SH-SY5Y细胞的凋亡。