史佳鹭,闫芬芬,李慧臻,焦雯姝,关嘉琦,宋 月,霍贵成

（东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150030）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）是一种主要累及直肠、结肠黏膜和黏膜下层的慢性非特异性炎性肠病,临床主要表现为腹痛、腹泻、血便等,严重影响患者生活质量,甚至会演变为癌症,与克罗恩病（Crohn's disease,CD）都属于炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）[1]。流行病学统计,美国和西欧国家等UC的发病率较高[2],近年来我国UC患病人数也逐年增多且患病人群呈现年轻化趋势[3]。目前其病因和发病机制尚且不明,可能与遗传、免疫、营养、细菌、病毒及其他环境因素有关。研究发现,人体肠道菌群在UC发病机制中起着重要的作用,且可能决定肠道炎症的严重程度。肠道菌群失调,黏膜屏障功能消失,使肠道致病菌侵袭黏膜下层,微生物抗原激活,导致宿主免疫失调,炎症细胞活化使机体发生炎症反应,因此对肠道菌群的干预成为一个有潜力的治疗措施[4]。益生菌是一类摄入适当数量时会对宿主健康产生有益作用的活性微生物的总称,在UC患者的临床治疗中,其可恢复患者肠道菌群平衡,抑制炎症反应,且副作用较传统药物治疗小[5-7]。本文介绍了肠道菌群在UC发病机制中的作用,以及益生菌在治疗UC方面的研究进展。

1 肠道菌群与溃疡性结肠炎

1.1 肠道菌群

人体微生物群包括细菌、真菌、噬菌体和病毒,其充当“器官”与宿主相互协同作用,构成稳定的生态系统。其能够在皮肤、泌尿生殖系统、呼吸系统中和肠道中定植,尤其是肠道内含有超过人体细胞数目10 倍的微生物,其所含的基因更是超过人体自身基因的150 倍[8]。肠道菌群主要为厚壁菌门和拟杆菌门,根据需氧情况,分为专性厌氧菌、兼性厌氧菌和好氧菌。这些肠道菌主要分布在结肠和远端小肠,定植在肠黏膜表面,形成“菌膜屏障”,在肠道营养物质代谢、肠道通透性和肠道免疫等方面发挥重要的作用[9]。肠道稳态时结肠细胞代谢趋于氧化磷酸化和脂肪酸氧化,耗氧量高,因此形成的低氧环境利于专性厌氧菌生长,它们可降解纤维生成短链脂肪酸（short-chain fatty acids,SCFA）,进而促进宿主健康。肠道病原体会破坏结肠细胞代谢,导致肠上皮氧合作用增加,会导致以兼性厌氧菌增殖为特征的菌群失调[10]。根据肠道微生物在宿主中的作用,可将其分为3 类：共生菌是肠道的主要微生物群（如双歧杆菌、拟杆菌和链球菌）,附着在黏膜上皮细胞上,在营养和免疫调节中起关键作用；条件致病菌是肠道非优势细菌（如肠球菌和肠杆菌）,在机体条件成熟时能够对机体产生致病作用；病原菌（如变形杆菌和假单胞菌）在人体肠道多为过路菌,长期定植机会少,一般不致病,但当病原菌大量繁殖时,则会引起疾病的发生。人体肠道群菌在正常状态下呈现动态平衡,当平衡遭到破坏,肠道微生态失调,黏膜屏障破坏,病原菌入侵,激活体内免疫系统,细胞因子释放失衡,活化炎症细胞导致肠黏膜发生炎症反应,诱导结肠炎发生[11]。

1.2 溃疡性结肠炎的肠道内菌群变化

早期肠道内大多数细菌无法用常规技术培养,但随着培养组学的发展,如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱以及16S RNA测序用来鉴定细菌物种,迅速提高了人们对肠道微生态的认识。越来越多的证据证明肠道菌群在UC发病机制中起重要作用,且可能决定肠道炎症的严重程度[12-13]。与健康者相比,UC患者肠道内微生物变化主要体现为兼性厌氧菌（如柔嫩梭菌群、梭菌属IV簇）减少,且条件致病微生物的增加,如克雷伯氏菌、肠杆菌、变形杆菌和真菌；乳杆菌和双歧杆菌显着减少,拟杆菌数量增加（表1）[14]。此外发现在UC患者中,炎症最严重的部位是肠道细菌最多的结肠区域,且无菌小鼠不会发生严重的结肠炎,这提示UC的发病机制可能与肠道微生物有重要关系。

表1 UC患者肠道菌群变化Table 1 Changes in intestinal flora in patients with UC

1.3 肠道菌群在UC发病中的作用机制

1.3.1 影响短链脂肪酸

在结肠区域肠道共生菌酵解膳食纤维生成短链脂肪酸,研究认为肠道内SCFA数量的减少与UC的发病密切相关。丁酸盐作为一种重要的短链脂肪酸盐,不仅是结肠上皮细胞重要的能量来源,能够促进肠腔内钠、钾和水的吸收,还可以抑制炎症因子释放,通过增加黏液素和抗菌肽产生,上调紧密连接蛋白的表达来增强上皮屏障完整性,对结肠健康具有重要作用。研究发现,UC患者肠道菌群在炎症活跃的区域产丁酸盐的细菌数量降低,如F.prausnitzii和人罗斯拜瑞氏菌（Roseburia hominis）。处于活动期的UC患者粪便中丁酸盐的浓度降低,肠黏膜氧化丁酸盐的能力也下降,但缓解期UC患者体内丁酸盐氧化处于正常水平。Nancey等发现UC患者丁酸盐氧化降低可能与结肠发炎处肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平增加有关[21]。另一方面,在UC患者中发现含有较高水平的硫酸盐还原菌（sulfatereducing bacteria,SRB）和较高浓度的硫化氢,而在体外实验证明硫化氢抑制丁酸盐氧化[22-23]。提示丁酸盐作为细菌代谢产物,保护肠道黏膜屏障,抑制肠道炎症,参与结肠炎的发展。

1.3.2 参与免疫调节

图1 NF-κB/IκB通路[26-27]Fig.1 NF-κB/IκB signaling pathway[26-27]

肠道微生物通过提供抗原或其他刺激因子,对炎症反应中启动或维持肠道免疫起重要作用,这与UC发生密切相关。许多研究证实核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路参与多种免疫异常相关疾病,如炎性肠病、Ⅱ型糖尿病、肥胖等[24]。在UC患者中肠道菌群失衡,黏膜屏障功能和通透性改变,革兰氏阴性菌发生易位,进入淋巴和血液系统。革兰氏阴性菌的内毒素脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激先天性免疫系统,与Toll样受体4（Toll-like receptors 4,TLR4）结合,从而活化髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88,MyD88）依赖途径,MyD88依赖途径通过细胞内信号分子募集并活化下游的肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6）,活化的TRAF6进一步激活NF-κB信号通路。在稳定状态时NF-κB在细胞质中与它的抑制子IκB结合,当细胞受到刺激后,复合物IκB蛋白发生磷酸化和泛素化,NF-κB单体从复合物中释放出来并进入细胞核,随后NF-κB单体将有序的调控下游基因的转录和翻译过程,促使机体产生大量的炎性因子,如TNF-α、白介素（interleukin,IL）-6、IL-1β等（图1）,从而增加共刺激分子在抗原提呈细胞表面的表达,进而激活T细胞激活免疫系统致炎症反应发生。表明肠道菌群不仅对天然免疫有调控作用,而且也对适应性免疫有重要作用。目前,一项纳入17 名健康者和15 名炎症性肠病患者粪便样本的研究中,对无菌小鼠进行粪菌移植,结果发现在受体小鼠中,IBD患者粪便菌群可诱导更多的辅助性T细胞（helper T cell,Th）2和Th17,而健康者粪便菌群能诱导更多的RORγt+调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）。在结肠炎易感小鼠模型中,移植IBD患者菌群与移植健康者菌群相比,小鼠更容易患病[25]。揭示肠道菌群通过诱导T细胞向不同细胞亚群分化,从而影响不同细胞因子分泌,介导结肠炎发生。

1.3.3 与胆汁酸相互作用

胆汁酸是胆固醇的代谢产物,在小肠中肠道微生物通过胆盐水解酶（bile salt hydrolases,BSH）对结合胆汁酸进行早期解离,再对其进行7-脱羟基反应生成次级胆汁酸[28]。次级胆汁酸是人粪便中胆汁酸的主要成分,适当浓度的次级胆汁具有免疫调节能力。胃肠道中BSH活性主要来自厚壁菌门（30%）、拟杆菌门（14.4%）和放线菌门（8.9%）,提示UC患者肠道内拟杆菌门和厚壁菌门数量的变化可能是导致胆汁酸代谢改变的基础原因[29]。宏基因组分析UC患者关于胆汁酸代谢的细菌基因丰度,结果发现BSH基因丰度下降。同时,IBD患者体内对胆汁酸解耦合、脱羟基和脱硫活性下降[30]。因此,UC患者血清和粪便中次级胆汁酸含量降低,而结合胆汁酸在粪便中增加,减弱对法尼醇X受体（farnesoid X receptor,FXR）和G蛋白偶联胆汁酸受体5（G protein coupled bile acid receptor 5,TGR5）的刺激,失去维持黏膜屏障的完整性与抗炎作用,这有助于UC发病机制。此外,通过研究FXR（NR1H4）基因中的5 个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）,发现其中的SNP rs3863377显示与UC发病呈负相关,说明FXR（NR1H4）基因编码的遗传变异与IBD有关[31]。目前还不清楚SNP的缺失或增加是否会影响FXR的功能,但UC患者携带SNP rs386377基因显着低于健康者,提示SNP rs386377对该病具有保护作用。

1.3.4 与宿主基因相互作用

肠道微生物菌群的丰度在一定程度上受宿主基因型的影响,这种特定的遗传变异和特定细菌的丰富之间的关系成为被称为微生物群数量性状基因座[32]。双胞胎研究表明,产生丁酸盐及使醋酸盐-丁酸盐转化的瘤胃球菌,在一定程度上可以遗传[33]。在动物实验中也发现某些微生物属与基因位点有关,如消化道细菌Akkermansia与2和7号染色体上的基因座相关联[34]。有研究发现,双胞胎肠道微生物具有相似性,进一步表明了宿主基因可以影响肠道菌群[35]。此外,初步研究数据显示,IBD患者中肠杆菌科的丰度变化与NOD2基因变异有关。在一项研究中,收集313 位IBD患者（包括188 位CD患者、107 位UC患者、18 位中级和未明确的IBD患者）与582 位健康者的粪便、外周血和临床数据。采用16S rRNA测序分析肠道菌群组成,利用基因上11 个与IBD有关的遗传变异位点衡量遗传风险,包括与细菌有关的NOD2、CARD9、ATG16L1、IRGM和FUT2基因。结果发现在具有高度遗传风险的健康人中,遗传风险值与罗斯氏菌属丰度下降显着相关[36],揭示了与IBD相关的遗传变异可影响正常人的肠道菌群。

目前针对防治UC的传统药物主要为氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制剂和抗体制剂等[37-40],但因传统药物治疗存在效果不佳、副作用大和依赖性强等局限性,治疗UC的新型方法的研究成为热点,而益生菌具有调节肠道菌群平衡,抑制炎症反应的特性,近年来其在UC的治疗中取得一定疗效。

2 益生菌与溃疡性结肠炎

2.1 益生菌对溃疡性结肠炎的影响

世界卫生组织将益生菌定义为“一类活的微生物,当有足够量的活菌体到达宿主肠道、定植从而改变宿主肠道菌落平衡,进而对宿主起着健康效应”[41]。UC是一种反复发作的慢性疾病,分为活动期和缓解期,尽管经过诱导缓解治疗后,临床症状与病理学可以获得最大程度的改善,但仍可出现反复,因此如何诱导缓解以及长期维持缓解是治疗UC的关键[42]。目前大量研究表明,益生菌制剂可以不同程度缓解UC的严重情况（表2）,乳酸菌、双歧杆菌和肠球菌是常用的益生菌。益生菌中可以恢复受损的黏膜屏障功能,调节肠道微生物群失衡,抑制病原菌,增强肠道及系统免疫,对缓解UC症状以及维持缓解有较好的疗效。

表2 不同益生菌对UC的影响Table 2 Effect of probiotics on UC

2004 年,Kruis等进行一项纳入327 名UC患者的双盲实验,患者接受益生菌或美沙拉嗪治疗,结果发现益生菌大肠杆菌Nissle 1917与美沙拉嗪疗效相似[50]。现在大肠杆菌Nissle 1917已经被认为是5-氨基水杨酸盐有效代替物。大量VSL#3（短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、物乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌）对UC患者治疗效果的研究被报道。Fedorak等研究发现VSL#3对34 例轻度-中度的成年UC患者效果良好,且无不良影响[51]。Venturi等评估了VSL#3对20 例不耐受5-ASA及过敏的UC患者的积极影响,还进行了VSL#3对新诊断的UC儿童患者疗效的评估[52]。此外,一项对187 例UC患者的研究显示,鼠李糖乳杆菌对此有良好的治疗效果[53]。Mallon等称益生菌对轻中度UC患者维持缓解有积极作用[54]。尽管关于益生菌在UC治疗中积极结果不断被报道,但其机制需进一步研究深入。

2.2 益生菌的作用机制

2.2.1 调节免疫反应、抑制炎症

UC是由免疫系统介导的慢性炎症,细胞因子可以协调肠道内免疫和非免疫细胞间的沟通,并改变局部及全身水平的急慢性炎症反应,作为细胞信号因子通过刺激促炎介质产生和激活炎症通路在UC发病机制中起关键作用（表3）。

表3 不同细胞因子在UC中的作用[61-62]Table 3 Roles of different cytokines in UC[61-62]

研究表明,益生菌通过抑制TLR4/NF-κB信号通路和磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶/NF-κB信号通路,降低TNF-α和IL-1β等促炎细胞因子水平,提高IL-10等抗炎因子水平,从而维持UC的缓解[55]。一项纳入167 项口服益生菌或合成制剂一周以上的对照临床实验,对炎症性肠病、关节炎和脂肪肝等炎症标志物（C-反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α、干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）、转化生长因子-β）进行系统回顾和荟萃分析,结果发现益生菌可以显着降低IBD患者血清中CRP和TNF-α水平,但不改变IL-10水平[56]。植物乳杆菌KLDS00170、嗜酸乳杆菌KLDS20010和瑞士乳杆菌KLDS10010 3 种混合益生菌能够显着降低小鼠结肠及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量,提高IL-10含量。提示益生菌通过降低局部及全身炎症,改善结肠炎[57]。植物乳杆菌LP可改善IL-10基因敲除小鼠结肠炎的严重程度[58]。副干酪乳杆菌LS2通过减少固有层中Th1细胞和巨噬细胞的数量缓解结肠炎[59]。嗜酸乳杆菌可降低葡聚糖硫酸钠盐（dextran sulfate sodium salt,DSS）诱导小鼠结肠组织中信号传导及转录激活因子（signal transducers and activators of transcription,STAT3）和磷酸化STAT3水平,并增加2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid solution,TNBS）诱导小鼠肠上皮及固有层淋巴细胞中Treg细胞的数量[60],从而减轻炎症。

2.2.2 增强肠道黏膜屏障

完整的肠黏膜屏障由机械屏障（由肠道黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接和黏液层构成）、化学屏障（由胃酸、胆汁、消化酶、溶菌酶、黏多糖、糖蛋白、蛋白质等构成）、免疫屏障（由免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）A、IgG和IgM等构成）与生物屏障（由约1013～1014CFU细菌组成,深层菌膜群由双歧杆菌、乳酸杆菌等组成；表层腔菌群由大肠杆菌、肠球菌等组成）共同构成[66],能够防止肠内的有害物质如细菌和毒素穿过肠黏膜进入人体内其他组织、器官和血液循环。肠道免疫功能主要靠肠道黏膜屏障实现,免疫、生物、理化等各种因素损伤肠道黏膜屏障功能,肠道内将出现细菌易位、内毒素吸收等现象。在UC患者体内,结肠黏膜屏障已被破坏,肠道表面菌群失衡,肠上皮细胞大量凋亡,引起肠道局部环境免疫紊乱。

益生菌通过与上皮细胞互作,减少水的分泌,增强黏液或抗菌肽的产生,如β-防御素、溶菌酶、乳铁蛋白或磷脂酶等。VSL＃3能够使IL-10缺陷型小鼠保持肠上皮细胞完整性,恢复受损结肠屏障功能,增强T-84细胞上皮抗性[63]。植物乳杆菌ZS2058能够上调结肠炎小鼠模型的肠上皮细胞黏蛋白MUC2、紧密连接蛋白Claudin3、ZO-1和E-cadherin1的mRNA表达,增强黏液层,从而改善屏障功能[64]。乳酸乳杆菌HT121-2可以显着提高DSS诱导的结肠炎小鼠结肠内再生胰岛衍生蛋白Reg3γ相对表达,Reg3γ是一种抗微生物肽,其分泌缓解肠炎症状（包括降低炎症因子水平和改善肠黏膜病理变化等）,维护肠黏膜屏障。此外,益生菌通过调节肠黏膜上细菌平衡,增强生物屏障。Siaw等在研究116 例缓解期UC患者和16 例健康者的粪便菌群中,发现UC患者中F.prausnitzii定植数量显着减少,且UC患者口服F.prausnitzii后,肠道内F.prausnitzii定植增加,抑制病原菌定植和入侵,有助于UC的缓解[65]。

2.2.3 抑制氧化应激反应

过度的氧化应激反应参与UC的发病。研究发现,过度氧化与肠道黏膜中性粒细胞的活化和募集密切相关,在UC患者的结肠中,吞噬白细胞的活性显着增加,导致自由基分子数量升高[67],从而会导致DNA、蛋白质和脂肪严重受损。UC患者抗氧化能力不足,可能是由于体内过度炎症导致（图2）[68]。对UC患者的药理学干预也证实了氧化应激在该疾病中的作用。例如,5-氨基水杨酸的治疗机制部分是由于抗氧化作用,铁螯合作用和自由基清除作用[69]。

图2 UC体内过度氧化[70]Fig.2 Over-oxidation in patients with UC[70]

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是抗氧化自由基的第一道防线,能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢[71]。研究显示,SOD的使用可显着降低发炎结肠中的过氧化反应,且改善TNBS诱导的大鼠结肠炎模型[72]。在一项研究中,高产SOD的植物乳杆菌和乳酸乳球菌可以显着降低TNBS结肠炎模型的炎症反应[73]。另一项实验研究表明,产生锰SOD的加氏乳杆菌具有抗炎活性,可降低IL-10缺陷小鼠的结肠炎严重程度[74]。此外发酵乳杆菌E-3、发酵乳杆菌E-18和嗜热链球菌由于产生SOD而显示具有抗氧化活性[75]。

研究发现益生菌能够调控与氧化应激相关的信号通路以缓解氧化损伤,主要调控核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2）/抗氧化反应元件（antioxidant response element,ARE）（图3）。人体在正常状态下,Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1,keap1）在细胞质中以结合状态存在,当发生氧化应激时,Nrf2与keap1分离,进入细胞核内,与ARE结合,诱导抗氧化酶或抗氧化蛋白表达[76]。在UC小鼠模型中,植物乳杆菌ZDY2013和两歧双歧杆菌WBIN03通过激活Nrf2通路,调节SOD1、谷胱甘肽过氧化物酶2、过氧化氢酶抗氧化酶的分泌,达到缓解结肠炎的效果[77]。

研究表明,MPO髓过氧化物酶是氧化应激标志之一,结肠发生炎症后大量中性粒细胞内流进入组织使MPO活力大幅度提高。植物乳杆菌YS-2[78]、植物乳杆菌Zhang-LL[79]可以显着提高小鼠结肠内MPO活性,提示益生菌可能通过降低MPO活性来减轻氧化程度。

图3 益生菌干预Nrf2/ARE途径[80]Fig.3 Nrf2/ARE signaling pathway for probiotic intervention[80]

然而,益生菌干预UC患者的效果并不一致。研究表明益生菌加剧肠道蠕动,加重UC腹泻,增加排便次数和DAI。Wildt等[81]研究发现,给予嗜酸乳杆菌LA-5和动物双歧杆菌BB-12组与安慰剂对照组对UC患者的缓解效果无显着差异。仍需要更多的样本量和随机对照临床实验来阐明益生菌在UC治疗中的作用机制。

3 结 语

随着对肠道菌群-宿主之间相互作用研究越来越深入,发现肠道微生物与溃疡性结肠炎密切相关,以肠道菌群为靶点为治疗溃疡性结肠炎提供新的途径。无论临床研究或动物研究,益生菌在改善溃疡性结肠炎中都展现出良好的干预效果,但也有研究发现益生菌对溃疡性结肠炎没有显着效果甚至加重病情。此外,由于UC发病机制复杂,再加上益生菌个体差异、种类和治疗剂量不同甚至益生菌自身的生长状态的不同导致益生菌治疗效果有所差异。因此,仍需大量深入研究为益生菌的有益效果提供合理详细的证据。