浓香型白酒新、老窖池池壁泥与池底泥原核菌群结构分析

张会敏，王艳丽，孟雅静，李安军，周庆伍，胡心行，刘国英，李 兰，黄 艳，邢新会

（1.安徽省固态发酵工程技术研究中心，安徽 亳州 236820；2.清华大学化学工程系，北京 100084）

浓香型窖泥中富含大量厌氧菌群[1]，对提高白酒发酵质量具有重要作用[2]。现已知窖池越老窖泥菌群越丰富[3]，酒质越好。Deng Bo等[4]发现窖泥菌群内部复杂合作和抑制关系导致窖泥菌群结构的进化演变。Tao Yong等[3]研究了1、10、25、50 a窖龄窖泥菌群的变化，发现窖泥至少需25 a达到老熟。Liu Maoke等[5]也进一步证实40 a与400 a窖龄的窖泥菌群结构差异不明显。由此可知，窖泥菌群需要25 a达到老熟状态。在窖泥菌群老熟过程中，窖泥菌群与其所在的理化环境相互适应、相互影响。由于池底泥与池壁泥所处的理化环境截然不同，因此有必要将池壁泥和池底泥分开研究，对详细了解窖泥的老熟具有重要作用。目前，只有Ding Xiaofei等[6]通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）研究发现池底泥中真细菌的菌群丰度大于池壁泥，两者真细菌的菌群组成不同，两者古菌（主要为甲烷菌）的组成类似。但是，由于PCR-DGGE研究方法的限制，并没有给出详细的菌群组成。在实际酿酒中，一般分层出醅分层蒸酒，靠近池底泥的下层酒醅出酒的酒质普遍好于上层酒醅出酒的酒质，即池底泥菌群更有利于提高酿酒质量。在酿酒过程中，粮食等原材料经微生物分解代谢形成黄水，黄水沉积在池底，给池底泥带去了丰富的营养和水分。随着黄水水位提高，池底泥和池壁泥中的厌氧菌随着黄水相互流通、相互影响。因此，池壁泥与池底泥菌群的老熟程度差异对酒的品质具有影响。了解池壁泥与池底泥的原核微生物组成差异与理化性质差异，分析两者的关系，有助于分析窖泥老熟的关键因素。

鉴于目前有关池壁泥与池底泥菌群的比较研究很少，本研究选取安徽省北部某知名浓香型白酒公司的新窖池（5 a窖龄）和老窖池（50 a以上窖龄）的窖泥作为研究对象，对池底泥与池壁泥宏基因组的16S rRNA基因V4区进行Illumina高通量测序，深入分析新老窖池池壁泥与池底泥的理化性质和原核微生物群落结构（包括真细菌和古菌），并建立窖泥理化性质与原核微生物群落之间的冗余相关分析（redundancy analysis，RDA），分析新老窖池池底泥与池壁泥菌群差异的原因，为综合的窖泥改良提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

窖泥样本取自安徽某知名浓香型白酒企业；Omega土壤DNA提取试剂盒（D5625） Omega bio-tek公司；T-vector质粒（B522211） 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FE20 pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Pikoreal实时定量PCR（real-time PCR）仪、ICS5000＋离子色谱仪（配ICS-5000＋ -DC电导检测器）美国ThermoScientific公司；6890气相色谱仪（配CP-WAX 57 CB色谱柱50 m×0.25 mm，0.2 μm） 美国Agilent公司；Acquity超高效液相色谱（配二极管阵列检测器和Waters HSS T3色谱柱100 mm×2.1 mm，1.8 μm）美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥样本采集

选取新窖池（窖龄5 a）和老窖池（窖龄＞50 a）各6 个。于窖池底部中心点、1 个角点以及中心点和角点连线共3 点，分别取1 块深度2 cm的池底窖泥混匀作为一个池底泥样本；于4 个池壁的中心点（黄水最高水位线覆盖处）取池壁泥混匀作为一个池壁泥样本。6 个老窖池池底泥样本（BMP_old）标记为BMP_o1～BMP_o6；6 个老窖池池壁泥样本（WMP_old）标记为WMP_o1～WMP_o6；6 个新窖池池底泥样本（BMP_young）标记为BMP_y1～BMP_y6；6 个新窖池池壁泥样本（WMP_young）标记为WMP_y1～WMP_y6。置于无菌袋中，于-80 ℃贮存，待用。

1.3.2 理化性质分析

采用烘干法[5]检测窖泥水分。使用pH计检测窖泥pH值（将新鲜窖泥与去离子水按照1∶5（g/mL）料液比混匀静置后检测[3]）。采用紫外分光光度计法检测铵态氮含量[7]。采用滴定法检测总酯含量[8]。将新鲜窖泥与15%甲醇按照1∶9（g/mL）料液比混匀，30 ℃超声处理40 min，0.22 μm滤膜过滤，使用气相色谱检测滤液中挥发性有机酸、酯和乙醇的含量。进样量1 μL，柱流速1 mL/min，进样口温度250 ℃，分流进样，分流比30∶1；柱温箱程序：初始温度35 ℃，2 ℃/min升温至60 ℃，保持4 min，6 ℃/min升温至195 ℃，保持20 min；氢火焰离子检测器温度250 ℃。采用液相色谱检测滤液中乳酸的含量，进样量1 μL，流动相KH2PO4溶液（0.02 mol/L），柱流速0.1 mL/min，检测波长208 nm，柱温箱30 ℃。将新鲜窖泥与去离子水1∶9（g/mL）料液比混匀，8 000 r/min离心5 min，取上清液滤膜（0.22 μm）过滤，用离子色谱仪检测可溶性K＋与Ca2＋浓度。离子色谱柱为IonPacTM CS12A RFICTM（4 mm×250 mm），进样量25 μL，柱流速1 mL/min，柱温30 ℃，流动相甲基磺酸溶液（20 mmol/L），等浓度洗脱，检测器为ICS-5000＋ -DC电导检测器。

1.3.3 DNA提取与Illumina高通量测序

使用Omega土壤DNA提取试剂盒（D5625）提取窖泥DNA。然后，通过上海派森诺生物科技股份有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序。引物为：520F（5’-7 bp barcode＋GCA CCT AAY TGG GYD TAA AGNG-3’）和802R（5’-TAC NVG GGT ATC TAA TCC-3’），扩增16S V4区。25 μL扩增体系：0.25 μL Q5高保真DNA聚合酶，5 μL 5×PCR Buffer，5 μL 5×High GC Buffer，2 μL dNTP（2.5 mmo/L），2 μL DNA模板，1 μL上下游引物（10 μmol/L）和8.75 μL双蒸水。PCR扩增程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，25 个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物纯化、荧光定量、构建克隆文库均按照试剂盒说明书进行。确定DNA文库合格（Agilent 2100 Bioanlyzer），按照试剂盒要求进行Illumina MiSeq双向测序。

1.3.4 16 S rDNA拷贝数real-time PCR绝对定量

使用16S rDNA通用引物341F（5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）和518R（5’-TTA CCG CGG CTG CTG GC-3’）扩增窖泥宏基因组DNA，得到16S rDNA混合扩增产物。使用T-vector试剂盒（B522211）构建T-vector质粒文库并转化感受态细胞。通过蓝白斑筛选，随机挑选白斑克隆用于Sanger测序，确保PCR产物连接成功。提取质粒作为标准品，用于绝对定量real-time PCR标准曲线的制作。普通PCR和绝对定量real-time PCR程序相同：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环；72 ℃延伸2 min。real-time PCR信号采集在72 ℃产物延伸阶段进行。所有标准品、无模板对照和实验样本设置3 个重复。

1.3.5 测序数据处理与统计学分析

原始序列去掉长度＜150 bp或者＞300 bp、模糊碱基（N）数＞1、同聚碱基数目＞8，引物错配＞1 bp的序列（QIIME，v1.8.0）；双向拼接（FLASH软件v1.2.7），剔除嵌合体（USEARCH，v5.2.236）。得到优质序列。UCLUST聚类（97%）得到可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU），认定OTU中丰度最高的序列为代表序列。使用Silva数据库（Release132）注释代表序列为代表OTU的注释结果（80%可信度），形成OTU列表。去除OTU列表中序列数少于总测序量0.001%的OTU。然后将OTU列表进行100 次抽平，取平均，四舍五入取整，得到新的OTU列表。对新OTU列表，使用Qiime软件（v1.8.0）计算各样本的Coverage指数、Shannon指数、Chao1指数，并对unweighted和weighted uniFrac距离矩阵进行UPGMA聚类分析并可视化（R3.3.2）。窖泥理化因子的差异显着性分析通过SPSS（24.0）方差分析（ANOVA）实现。窖泥理化因子与其菌群组成之间的RDA分析通过Canoco 5实现。

2 结果与分析

2.1 窖泥理化性质

窖泥的理化性质，即窖泥菌群所处的生长环境，对窖泥菌群的生长具有重要作用。如表1所示，4 组窖泥样本中，BPM_old的pH值最高，WPM_young的pH值最低。与窖泥中的其余有机酸比，乳酸含量最大，且乳酸pKa值最小（3.86），说明乳酸对窖泥的pH值影响最大。通过Pearson相关性分析，证实窖泥中乳酸含量与其pH值的相关性很强。现已知乳酸杆菌[9]和瘤胃菌科[10]的一些菌属具有降解乳酸的功能，推测乳酸的多少与菌群的降解功能有关。普遍认为窖泥pH值与其品质具有重要相关性，即pH值越高窖泥品质越好[1,3]。因此，考虑到乳酸对窖泥pH值的主要影响作用，降解乳酸是提高窖泥质量的重要途径。4 组窖泥样本中，BPM_old中的乙醇、丙酸、乳酸、己酸乙酯、乳酸乙酯的含量相对较少，而乙酸、己酸的含量相对较多。推测BPM_old中的菌群更倾向于代谢乙醇、丙酸、乳酸、己酸乙酯、乳酸乙酯等而生成乙酸和己酸，即浓香型白酒重要香型物质乙酸乙酯和己酸乙酯的前体物质。4 组窖泥样本相比，BPM_old的铵态氮含量显着高于其余3 组。铵态氮提供微生物生长的氮源，对窖泥菌群的丰度具有重要影响。已知Aminobacterium[11-12]和Sedimentibacter[13]具有降解氨基酸提高铵态氮的功能。老窖泥（尤其是池底泥）中K＋的含量相对较高，可能与其中细菌通过运输系统积累K＋[14]有关，因此推测老窖泥中菌群丰度较高。池底泥中可溶性Ca2＋浓度显着高于池壁泥中的浓度，一方面有可能与白酒发酵过程中形成的黄水（pH 3.2～3.5）沉积在窖池底部与池底泥中的碳酸钙反应有关，另一方面池壁泥与黄水反应形成的可溶性Ca2＋也可能随黄水集中于窖池底部。此外，BPM_old的水分显着高于BPM_young，2 组池壁泥的水分不具有显着差异，说明老窖池的池底泥的保水性更好。4 组窖泥的理化性质相比，2 组池底泥的己酸、K＋和Ca2＋的值比较高且接近，说明池底泥比较适宜己酸菌的生存。新窖池的池壁泥与池底泥相比，池底泥的理化性质更接近老窖泥，也同样说明，池底泥更适宜菌群生存。4 组窖泥中，老窖池的池底泥的pH值、铵态氮、己酸、乙酸、K＋的值最高，而丙酸、乳酸、乙醇、己酸乙酯和乳酸乙酯的值最低，反映了老窖池池底泥菌群与环境相互作用的结果。

表1 新老窖池池底窖泥和池壁窖泥的理化性质Table 1 Physicochemical properties of BPM and WPM from old and young pits

2.2 real-time PCR绝对定量结果

图1 4 组窖泥样本中16S rDNA拷贝数Fig.1 Numbers of 16S rDNA copies in four pit muds

Sanger测序显示T-vector中成功插入了长度为189 bp的16S rDNA片段。BLAST结果显示，其与一株unculturedClostridiumsp.具有100%相似性（Accession No.KR704228.1）。提取该质粒作为标准品，通过绝对定量real-time PCR检测窖泥样本中16S rDNA的丰度，结果如图1所示。老窖泥的16S rDNA的拷贝数显着高于新窖泥；新窖池中池底泥的16S rDNA拷贝数略高于池壁泥，不具有显着性差异。本研究的新老窖泥中16S rDNA的拷贝数据与已有研究规律一致[15]。16S rDNA的拷贝数在一定程度上反映了窖泥中原核菌群的丰度。总结来说，与新窖泥相比，老窖泥中的菌群丰度普遍高1～2 个数量级。

2.3 窖泥原核微生物群落的α多样性

通过高通量测序（表2），共得到1 030 680 条优质序列，平均长度207 bp，平均29 268～49 669 条/样本。抽平后，得到25 778～25 906 条序列/样本。OTU聚类共得到10 935 个OTU，平均456 个OTU/样本。平均测序覆盖率98.6%，说明测序数目足够代表其菌群组成。序列的注释度（门、纲、目、科、属）＞99.9%，说明窖泥中大量未培养菌实现系统分类。4 组窖泥样本中，BPM_old的OTU数目、Shannon指数和Chao1指数值最高，WPM_young最低，与图1结果一致。WPM_old与BPM_young相比，BPM_young中的OTU数目和Chao1指数值更大一些，不具有显着差异；两者Shannon指数值相当，表明两者菌群丰度和多样性相当。WPM_young的丰度和多样性显着低于其余3 组，表明池壁泥比池底泥的老熟速度慢，与Tao Yong等[3]的研究结论基本一致。本研究进一步发现了新窖池的池底泥和池壁泥的巨大差异，老窖泥的原核菌群数量（16S rDNA的拷贝数）比较多且未知菌最多，说明了老窖泥菌群的复杂性。

表2 4 组窖泥样本的原核微生物群落丰度和多样性参数Table 2 Richness and diversity indices of prokaryotic community in four pit muds

2.4 窖泥原核微生物群落的β多样性

如图2所示，OTU注释共得到25 个门，其中23 个细菌门，2 个古菌门（Euryarchaeota，WSA2）。含量超过0.1%的门有11 个。含量最多的门为后壁菌门（Firmicutes）。2 组池底泥中Firmicutes的含量相当，BPM_old中含有更多的互养菌门（Synergistetes），BPM_young中含有更多的拟杆菌门（Bacteroidetes）。两组池壁泥相比，新窖池的池壁泥中Firmicutes和变形菌门（Proteobacteria）的含量远多于老窖池的池壁泥，而老窖池的池壁泥中Bacteroidetes、Euryarchaeota和Synergistetes的含量明显更多。Firmicutes、Bacteroidetes、Euryarchaeota、Synergistetes和Proteobacteria在各组窖泥样本中的含量均不小于1%，为窖泥菌群中的5 个优势门，占总测序数的97.7%，占每个样本的94.2%～99.6%。根据Tao Yong[3]和Liu Maoke[5]等的研究结果，老窖泥中Bacteroidetes、Euryarchaeota和Synergistetes的含量较高，而新窖泥中Proteobacteria的含量较多，与本研究的结果一致。新窖池中，池底泥与池壁泥相比较，池底泥与老窖泥更接近，说明池底泥比池壁泥的老熟速度更快。4 组窖泥样本相比较，新窖池池壁泥中的菌群组成最单一。此外，有些菌门，其总序列数小于总测序数的0.01%，为稀有菌门，如螺旋体菌门（Saccharibacteria）和Atribacteria。

图2 4 组窖泥样本中含量最多的11 个门的相对含量Fig.2 Relative abundances of top 11 phyla in four pit muds

OTU注释共得到268 个属，总注释度85.82%，其中BPM_old的注释度最低（68.95%），然后依次为WPM_old（86.09%）、BPM_young（89.04%）和WPM_young（99.20%），表明BPM_old的菌群组成最复杂。其余序列被不同程度地注释到门、纲、目、科或者无法被注释。将含量超过1%的属定义为优势菌属，4 组窖泥样本的优势菌属组成如图3所示。2 组新窖泥相比，WPM_young的菌群组成最单一，其中只有乳酸杆菌属（Lactobacillus，85.59%）和己酸菌属（Caproiciproducens，5.63%），而BPM_young的菌群组成则相对更丰富，其优势菌属组成种类与2 组老窖泥无异，说明池底泥的老熟速度更快。不过，BPM_young中Lactobacillus的含量（24.05%）依然显着高于2 组老窖泥（9.18%、1.13%）。与目前普遍认为的新窖泥中Lactobacillus的含量更高的结论一致[1,3]。Caproiciproducens是WPM_young中除了Lactobacillus之外的唯一的优势菌属，推测Caproiciproducens出现在窖泥中比较早。现已证明己酸菌和梭菌等产生的中长链脂肪酸（如己酸）具有抑制Lactobacillus的功能[16]。本实验数据的Pearson相关性分析也证明了Caproiciproducens与Lactobacillus的负相关性。推测随着Caproiciproducens增加，其产生的中长链脂肪酸（己酸、丁酸等）对乳酸菌的抑制作用增强，导致Lactobacillus的优势地位下降，同时老窖泥中降解乳酸的菌属[10,17]增多，进一步导致了老窖泥中乳酸的减少，进而促进了窖泥pH值升高，逐渐趋于中性，最终有利于噬中性菌属（氨基酸菌Aminobacterium、沉积菌属Sedimentibacter、甲烷菌等）的生长。4 组窖泥样本中，BPM_old中Aminobacterium的含量最高（11.85%），其次为WPM_old（2.52%），而2 组新窖泥中的含量微乎其微（0.003%～0.55%）。与Aminobacterium相比，沉积菌属（Sedimentibacter）含量稍低，其在老窖泥中的含量也显着高于新窖泥。窖泥中2 种丰度最高的甲烷菌为甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）和甲烷囊菌属（Methanoculleus），前者主要存在于BPM_young中，后者主要存在于BPM_old中。Methanobrevibacter为氢营养型革兰氏阳性菌，以H2、CO2以及甲酸盐为底物生成甲烷[18]。Methanoculleus为氢营养型革兰氏阴性菌，其生长以乙酸作为碳源，可以使用乙醇/仲醇作为电子供体产生甲烷[19]。新老窖池的池底泥中甲烷菌的种类差异有可能与其中代谢功能差异有关。此外，菌属Petrimonas在老窖池的池壁泥（15.58%）和新窖池的池底泥（10.77%）中含量都很高，具有代谢糖类生成乙酸、氢气和CO2的功能[20]，其在BPM_old中含量并不高，也是适应环境的结果。

图3 4 组窖泥样本中20 个优势属的相对含量Fig.3 Relative abundances of 20 dominant genera in four pit muds

根据已知的菌属的代谢功能，己酸菌（Caproiciproducens）和梭菌（Clostridium）可以通过厌氧发酵生成H2、CO2、丁酸和己酸[21-23]；互营单胞菌属（Syntrophomonas）可以将C4～C8的脂肪酸降解为丙酸、乙酸和H2[24]；氨基酸菌（Aminobacterium）和沉积菌属（Sedimentibacter）可以代谢氨基酸形成乙酸和丁酸[13,25]；氢营养型的甲烷菌（如Methanoculleus和Methanobrevibacter）可以转化H2和CO2为甲烷。甲烷菌被认为是窖泥老熟的标志性菌[26]，甲烷菌的存在代表着窖泥菌群代谢链的完善，即窖泥老熟。甲烷菌的出现，促进了产氢气的菌（如梭菌和己酸菌）与甲烷菌之间氢转移，同时与甲烷菌共生的Aminobacterium和Sedimentibacter的丰度增加，其降解氨基酸释放铵态氮和乙酸的功能，一方面提供了菌群生长的氮源（铵态氮）[13,25]；另一方面，又促进了以乙酸作为生长因子的甲烷菌（如Methanoculleus）的生长繁殖[19]。Demirel等[27]指出氢气的浓度达到一定程度才有利于甲烷菌转化氢气形成甲烷。己酸菌产生的氢气是氢转移的条件，也可能是己酸菌是除Lactobacillus之外最先出现在窖泥中的原因。池底泥的厌氧环境更有利于氢气的产生，从而池底泥的老熟速度比池底泥快。窖泥中的氢转移对浓香型白酒中特征风味物质（己酸乙酯）的前体——己酸的积累非常重要，一旦氢气堆积，己酸（以及乙酸和丁酸）的产生会受阻，甚至会被降解[28]，对浓香型白酒的风味物质产生不利。因此，老窖泥菌群代谢链的完善[29]，促进了环境中乙醇、丁酸、丙酸、乳酸、己酸乙酯、乳酸乙酯含量的减少，同时促进了铵态氮、乙酸和己酸的含量增加。乳酸和乙醇均具有抑菌功能，两者的减少也进一步促进了菌群的繁殖，包括很多未培养菌。综上所述，窖泥菌群所形成的代谢链的功能实际上是代谢窖泥中的有机物质形成己酸的同时，并释放甲烷或者氢气形成厌氧环境的过程。

图4 新老窖池池底泥和池壁泥样本菌群加权（A）和非加权（B）unifrac距离聚类图Fig.4 Cluster analysis of the OTU composition of old and young BPM and MBP based on unweighted (A) and weighted (B) unifrac distance

从图4A可以看到，4 组窖泥样本恰好聚类为4 组，说明4 组窖泥样本中的菌属组成差异明显，老窖池的池底泥与老窖池的池壁泥更相近，其次为新窖池的池底泥，表明窖龄对窖泥老熟更重要，池底泥比池壁泥的老熟速度更快。由图4B可知，4 组窖泥样本中，BPM_old组内差异度最小，说明BPM_old均一性比较好，而其余3 组窖泥样本内部的异质性比较强。老窖泥菌群一致性好于新窖泥菌群的一致性，与Liang Huipeng等[30]的结论基本一致。将图4A与图4B相比较，可知3 组窖泥样本的异质性主要表现在菌属组成的丰度，说明其老熟进度不同。2 种聚类结果均表明WPM_young成熟度最低，与成熟度最高的BPM_old之间的聚类距离最远。老窖泥的原核菌群数量（16S rDNA的拷贝数）比较多，且未知菌最多，说明老窖泥菌群的复杂性。

2.5 窖泥理化性质与菌群之间的RDA

图5 RDA冗余关联分析窖泥理化因子与原核菌群之间的关系图Fig.5 Redundancy analysis of the relationship between physicochemical factors and prokaryotic communities in pit mud

图5中箭头的长度代表相关性的大小，中心点和窖泥菌群之间的连线与箭头的夹角，锐角表示窖泥菌群与相应的理化因子呈正相关，钝角表示负相关。2 个主成分的总解释度88.10%，主要集中在坐标轴1（78.29%）。以纵轴为分界点，左侧主要为老窖池的窖泥，右侧主要为新窖池的窖泥。个别老窖泥样本出现在右侧，如WPM_o2；几个新窖泥样本出现在左侧，如BPM_y3、BPM_y6、BPM_y4和BPM_y5。BPM_old分布最集中，进一步说明其组内差异很小，均一度比较高，与图4结论一致。使用互动向前选择程序验收表1中理化因子和16S rDNA拷贝数（共16 个因素），发现乙酸（32.9%）和水分（20.6%）对相关性的解释度最高，具有极显着贡献（P＜0.01）。乙酸与窖泥原核菌群的强烈相关性，可能与其提供窖泥菌群代谢链的最下游底物有关；水分与窖泥原核菌群的强烈相关性，可能与窖泥微生物缺乏可以利用的自由水有关。参数16S rDNA拷贝数（7.9%）、己酸（7.2%）、乳酸乙酯（6.8%）和己酸乙酯（5.5%）对相关性具有显着贡献（P＜0.05）。其余10 个理化因子对相关性的解释度均不具显着性。与BPM_old具有强烈正相关的理化因子为乙酸、pH值和铵态氮，弱相关的理化因子为己酸、Ca2＋、总酯和己酸乙酯。目前关于新老窖泥菌群差异的研究[1,3]均表明pH值与优质老窖泥的菌群强烈正相关，乳酸与新窖泥或者退化窖泥的菌群强烈正相关。本研究将池底泥与池壁泥分开研究，发现乙酸和水分与窖泥菌群组成的相关性最强，说明在窖泥菌群老熟进程中，乙酸具有非常重要的作用。一方面，窖泥菌群老熟过程中，有可能缺乏自由水，需要对新窖泥额外补充水分；另一方面，窖泥中乙酸的量可能与促进单纯氢营养型甲烷菌（如Methanobrevibacter）向乙酸营养型甲烷菌（如Methanoculleus）的转变有关。乙酸营养型甲烷菌的存在更有利于乙酸的代谢，促进完整代谢链的形成。

3 结 论

4 组窖泥的理化性质差异明显，其中，老窖池池底泥的pH值、铵态氮、己酸和乙酸值最高，而乳酸、己酸乙酯和乳酸乙酯值最小。4 组窖泥的原核菌群结构相比，新窖池池壁泥的菌群组成最单一，其优势菌属仅包括Lactobacillus和Caproiciproducens；老窖池池底泥的原核菌群丰度最高，其中Caproiciproducens、Syntrophomonas、Sedimentibacter、Aminobacterium和甲烷菌属的含量都很高，而老窖池的池底泥中Lactobacillus的含量最低。窖泥理化性质与其原核菌群结构的RDA相关性分析发现，乙酸和水分与窖泥菌群的相关性的解释度最高，表明两者对窖泥菌群老熟具有重要作用。