基于变性血红蛋白和二胺氧化酶的生物传感器检测马鲛鱼中的尸胺

张 敏，吴俊铨，姚嘉文，杨春婷，白卫东,2，赵晓娟,2,

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510225；2.广州市广式传统食品加工与安全控制重点实验室，广东 广州 510225）

尸胺又名1,5-二氨基戊烷、尸毒素，属于脂肪族多胺类化合物，是由赖氨酸在赖氨基酸脱羧酶的作用下进行脱羧反应形成的一种多胺类化合物，广泛存在于生物体中[1-2]。有研究表明，尸胺具有刺激生长、延缓衰老的作用[3-4]。但尸胺具有腐蚀性和毒性，人们经过食物食入过量尸胺，会引起机体的炎症、痉挛、水肿，甚至导致死亡[5-6]。食物中的尸胺可以与亚硝酸盐反应产生致癌物质——亚硝基胺，尸胺也会使食物中组胺的毒性增大[7-8]。鉴于尸胺的生理和毒理学影响，其在食品中的存在已成为一个潜在的公共卫生问题。尸胺一般被认为是肉类中微生物衰变程度的关键性化合物。由于肉类腐败变质后通常含有高浓度的尸胺，因此，可用来作为食品新鲜度的一个评价指标[9-10]。尸胺的检测对保障人们的健康和提高食品的品质安全有着重要的意义。

目前，检测食品中尸胺的方法主要有薄层色谱法[11-13]、离子色谱法[14]、液相色谱法[15-18]、液相色谱-质谱联用法[19]、毛细管电泳法[20-21]和生物传感器法[22]等。其中，生物传感器法灵敏度高、检测速度快，在生物胺的检测食品品质与安全领域备受研究关注，有广泛的应用前景。血红蛋白（hemoglobin，Hb）是铁蛋白的一种，由4 个亚基构成，每个亚基由一条肽链和一个血红素分子构成，结构清晰，分布广泛，是研究生物传感器的理想模型。研究表明，Hb被尿素和酸共同诱导变性后，其对过氧化氢的催化能力可增强15 倍左右[23]。因此，利用变性血红蛋白（unfolded hemoglobin，uHb）制备传感器可显着提高检测灵敏度。二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）也被称作含吡哆醛的胺氧化酶，尸胺等二胺可以在DAO的催化作用下脱去氨基生成氨、醛及过氧化氢，通过测定过氧化氢的生成量可以确定待测样品中生物胺的含量。唐晗等[24]用DAO作为生物传感器的分子识别元件，以鲁米诺-铁氰化钾作为化学发光系统，建立了一种快速高效的食品中生物胺含量的检测方法。Shanmugam等[25]将DAO与纳米四氧化三铁通过共价结合固定于玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE）表面，制备了一种检测腐胺的生物传感器。纳米金（AuNPs）具有良好的生物相容性，易于进行表面修饰，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性[26]。由于AuNPs还具有高比表面积、高活性、特殊的物理性质等特点，在传感器领域有着广泛的应用前景[27-28]。朱旭等[29]利用多电位脉冲沉积法制备AuNPs修饰电极（AuNPs/GCE），再将L-精氨酸电聚合在AuNPs/GCE表面，制备出的聚L-精氨酸/AuNPs/GCE测定多巴胺时响应灵敏、特异性高。本研究基于DAO催化尸胺产生H2O2和uHb对H2O2具有良好催化能力的原理，结合Clay-AuNPs构建了一种高灵敏的电化学生物传感器，并用于马鲛鱼中尸胺含量的检测，为马鲛鱼等各种样品中尸胺含量的快速测定及新鲜度评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马鲛鱼 广州黄沙水产交易市场；尸胺二盐酸盐（98%）、苯乙胺（≥99.0%）、精胺（≥99.0%）、腐胺二盐酸盐（≥99.0%）、酪胺盐酸盐（≥98%）、亚精胺磷酸盐六水合物（≥99.0%）、组胺二磷酸盐（≥99.0%）、色胺（98%）、二胺氧化酶（≥0.05 U/mg）美国Sigma-Aldrich公司；柠檬酸钠（98.5%）、氢氧化钠（96%）、磷酸氢二钠（≥99.0%） 天津市福晨化学试剂厂；氯金酸（Au≥49%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高氯酸（70%～72%）、氯化血红素（97%）、戊二醛（glutaraldehyde，GLU）（50%）上海麦克林生化科技有限公司；过氧化物酶（BR，≥250 U/mg）、牛血红蛋白（BR，≥15%（以N计））、尿素（≥99.0%） 国药集团化学试剂有限公司；所用试剂均为分析纯；实验用水均为超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）。

1.2 仪器与设备

CHI660E电化学分析仪 北京华科普天科技有限公司；三电极系统：工作电极为GCE（Φ=3 mm）或修饰的GCE，参比电极为Ag/AgCl电极（饱和KCl溶液），辅助电极为铂丝电极 上海辰华仪器有限公司；BSA124S电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HR/T20M台式高速冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司；旋涡混匀器 上海安戈仪器有限公司；便携式pH计 奥豪斯仪器（上海）有限公司；JEM-2100F透射电镜（200 kV加速电压） 日本电子株式会社。

1.3 方法

1.3.1 电极预处理方法

将GCE依次用粒径为1.0、0.3、0.05 μm的α-Al2O3粉在专用抛光绒毛垫上抛光，用超纯水淋洗干净后，再分别置于硝酸（1＋1）、无水乙醇、超纯水中各超声1 min，淋洗干净，然后将其置于0.5 mol/L硫酸溶液中，在-1.0～1.0 V电位区间内，以50 mV/s的扫描速率进行循环伏安（cyclic voltammograms，CV）扫描，直到获得稳定的CV响应曲线。最后，将预处理的GCE室温下晾干备用。

1.3.2 电极修饰材料的制备

1.3.2.1 1 mg/mL黏土（Clay）分散液

准确称取Clay于超纯水中，超声分散均匀后置于4 ℃冰箱过夜膨胀，备用。

1.3.2.2 纳米金（AuNPs）

AuNPs的制备参考文献[30-31]方法。首先将实验过程中所要用到的玻璃器皿，用HNO3-HCl（1∶3，V/V）清洗干净，然后吸取1 mL氯金酸溶液（0.01%）于烧杯中，并加入99 mL的水，用恒温磁力加热搅拌器加热到沸腾，再逐滴加6 mL 1%的柠檬酸钠溶液，继续加热待反应液变为酒红色，停止加热，继续搅拌15 min后自然冷却至室温，用纯水定容至100 mL容量瓶刻度线后，放于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.3.2.3 黏土-纳米金（Clay-AuNPs）复合材料

将Clay分散液和AuNPs按照2∶1体积比进行混合，并用涡旋混匀器混匀，放于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.3.2.4 uHb溶液（酸性条件下尿素诱导）

准确称取一定质量的尿素，溶于0.1 mol/L PBS（pH 2.0）溶液，配制成3 mol/L的尿素溶液。接着称取一定量的牛血红蛋白溶于3 mol/L尿素溶液（pH 2.0），配制63 μmol/L的变性Hb溶液。将配制好的变性Hb溶液在4 ℃冰箱中储存23 h以达到变性平衡。

1.3.2.5 DAO溶液

准确称取DAO溶于0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中，配制成不同浓度的DAO溶液。

1.3.2.6 GLU溶液

准确量取一定体积的50% GLU溶液，以超纯水稀释成2.5%的GLU溶液。

1.3.3 修饰电极的制备

取5 μL的Clay-AuNPs分散液均匀滴涂于GCE表面，室温晾干后制得Clay-AuNPs修饰的GCE（Clay-AuNPs/GCE）。将Clay-AuNPs/GCE置于变性Hb溶液中，于4 ℃冰箱静置吸附1 h，使uHb固定在电极表面，吸附完成后以超纯水淋洗电极，室温晾干后得到uHb/Clay-AuNPs/GCE。将2 μL的GLU溶液均匀滴涂于uHb/Clay-AuNPs/GCE上，然后立即在其表面再滴涂5 μL的DAO溶液，室温晾干后得到DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE。电极不用时置于4 ℃冰箱中保存。

1.3.4 样品处理

马鲛鱼样品的处理参考文献[32]方法。称取2.0 g已粉碎的马鲛鱼样品，置于50 mL的离心管中，加入8 mL 0.4 mol/L的高氯酸溶液，用涡旋振荡器振荡1 min；于10 000 r/min离心10 min，且需重复进行一次，并将两次提取的上清液合并移至25 mL容量瓶中，用浓度为0.4 mol/L高氯酸溶液定容。移取10.00 mL鱼样提取液于离心管中，加入10.00 mL正己院，涡旋振荡5 min，弃去上层有机相，需重复进行一次，合并两次去脂后的样液，即为待测样液。

1.3.5 伏安测试

将工作电极、参比电极和辅助电极置于不同浓度的尸胺标准液中，于电位-0.7～0.3 V，电位增量4 mV/s，方波振幅25 mV，方波频率15 Hz条件下进行方波伏安（square wave voltammetry，SWV）扫描。

1.4 数据统计及图表绘制方法

利用Excel对实验数据进行统计分析。选用Origin 8.1作为绘图软件，对数据进行绘图分析。

2 结果与分析

2.1 AuNPs的透射电镜分析

将制备好的AuNPs进行透射电镜表征，并对100 个AuNPs颗粒的粒径进行统计分析，结果如图1所示。可以观察到分散良好和几乎为球形的纳米粒子，且纳米粒子的粒径分布相对较窄，大部分粒径在3.5～6.5 nm范围内，平均粒径约为5.0 nm。

图1 AuNPs的透射电镜图（A）和粒径分布图（B）Fig.1 Transmission electron micrograph (A) and particle size distribution of AuNPs (B)

2.2 测试底液pH值的选择

配制底液的pH值会影响尸胺在溶液中的存在状态以及稳定性，从而影响尸胺与DAO的作用能力。利用SWV考察DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE在不同浓度pH 7.0的尸胺溶液和pH 10.0的尸胺溶液中的电流响应（图2）。DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE在pH 10.0的底液中的响应电流值随着尸胺浓度的增加而增加，这主要是由于在pH 10.0的底液中尸胺带负电荷，有利于其与带正电荷的DAO发生反应，高浓度的尸胺可产生较多的H2O2，从而使响应电流增大。所以，选择尸胺测试底液的最佳pH值为10.0。

图2 pH 7.0（A）和pH 10.0（B）PBS配制的尸胺溶液在DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE上的SWV图Fig.2 SWV curves for cadaverine in pH 7.0 (A) and pH 10.0 (B) PBS on DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE

2.3 电极修饰条件的优化

2.3.1 修饰体系的选择

图3 不同修饰电极对尸胺的电化学响应情况Fig.3 Electrochemical responses of different modified electrodes to cadaverine

分别制备Hb/Clay-AuNPs/GCE、uHb/Clay-AuNPs/GCE、DAO-GLU/Clay-AuNPs/GCE、DAO-GLU/Hb/Clay-AuNPs/GCE、DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE，考察不同修饰电极在浓度为6×10-12mol/L和1×10-7mol/L的尸胺溶液中的电化学响应情况，分别计算各修饰电极在上述两个浓度的尸胺溶液中的响应电流差值（ΔI），并以ΔI衡量电极的测试效果，结果如图3所示。尸胺溶液在DAO-GLU/Clay-AuNPs/GCE上未出现电化学响应。Hb/Clay-AuNPs/GCE和DAO-GLU/Hb/Clay-AuNPs/GCE的测试效果较差。uHb/Clay-AuNPs/GCE和DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE的ΔI大，说明这两种修饰电极在尸胺溶液中的测试效果较好。由于DAO对尸胺等生物胺的催化具有较强的专一性，可以避免电极在实际样品测定时受到其他物质的干扰，从而提高测定结果的准确性。因此，选择DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE对尸胺进行测定。

2.3.2 过氧化物酶（模拟酶）的选择

辣根过氧化物酶、氯化血红素以及变性Hb均可以催化由DAO和尸胺反应产生的H2O2，从而产生电化学响应。在相同条件下，分别制备3 种过氧化物酶（模拟酶）修饰电极：DAO-GLU/Hm/Clay-AuNPs/GCE、DAO-GLU/HRP/Clay-AuNPs/GCE、DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE，考察这3 种修饰电极在浓度为6.0×10-12mol/L和1.0×10-7mol/L的尸胺溶液中电流响应情况。如图4所示，尸胺在DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE表面的响应电流值随着尸胺浓度的增加而增加，还原峰形明显，说明由uHb修饰的电极催化活性较高，更适合用于尸胺的测定。因此，选择变性Hb作为过氧化物酶（模拟酶）对电极进行修饰。

图4 pH 10.0尸胺溶液在DAO-GLU/Hm/Clay-AuNPs/GCE（A）、DAO-GLU/HRP/Clay-AuNPs/GCE（B）、DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE（C）上的SWV图Fig.4 SWV curves for cadaverine in pH 10.0 PBS on DAO-GLU/Hm/Clay-AuNPs/GCE (A), DAO-GLU/HRP/Clay-AuNPs/GCE (B) and DAOGLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE (C)

2.3.3 DAO修饰条件的优化

2.3.3.1 DAO配制底液的选择

酶配制底液的pH值及其所含的电解质类型对酶的存在状态和催化活性有一定影响，常见的酶配制底液为中性的磷酸盐缓冲液，但也可用其他溶液进行配制[33]。为选择最佳的DAO配制底液，分别以0.05 mol/L的硼酸溶液（pH 8.3）和0.1 mol/L的PBS（pH 7.0）配制相同浓度的DAO溶液（分别表示为(-)DAO和DAO），将其通过GLU交联固定于uHb/Clay-AuNPs/GCE表面，制得两种酶修饰电极，通过考察这两种修饰电极在浓度为6.0×10-12mol/L和1.0×10-7mol/L的尸胺溶液中的SWV响应情况，选出适合配制DAO的底液。如图5所示，由pH 7.0 PBS配制的DAO溶液修饰得到的电极对尸胺的响应较灵敏，说明用pH 7.0 PBS配制的DAO对测试溶液中的尸胺有较高的催化活性，因此选用0.1 mol/L PBS（pH 7.0）作为DAO的配制底液。

图5 pH 10.0尸胺溶液在(－)DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE（A）和DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE（B）上的SWV图Fig.5 SWV curves for cadaverine in pH 10.0 PBS on (-)DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE (A) and DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE (B)

2.3.3.2 DAO浓度的优化

DAO修饰浓度的高低对DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE的性能有一定影响，质量浓度过低会使修饰在电极表面同等面积的DAO膜中酶活单位减少，不能完全催化尸胺产生H2O2。DAO浓度越高，修饰膜越厚，不利于电子传递。分别以0.1 mol/L PBS（pH 7.0）配制10、30、50、60、70、80 mg/mL和90 mg/mL的DAO溶液，进一步修饰得到不同的DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE，分别置于浓度为6.0×10-12mol/L和1.0×10-11mol/L的尸胺溶液中，测定不同浓度酶修饰电极的SWV响应电流值，最后以上述两个浓度尸胺溶液的响应电流差值，判断各电极的灵敏度大小。如图6所示，随着DAO质量浓度的增加，电极的响应电流差不断增加，并在70 mg/mL时电流差达最大值，说明当DAO质量浓度为70 mg/mL时，DAO膜的厚度适宜，酶的催化活性最高，从而使DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE具有较高的测试灵敏度。因此选择70 mg/mL DAO溶液进行修饰。

图6 不同质量浓度DAO修饰电极在6.0×10－12 mol/L和1.0×10－11 mol/L尸胺溶液中的电流差比较图Fig.6 Comparison of current difference for electrodes modified by DAO at different concentrations in 6.0 × 10-12 mol/L and 1.0 × 10-11 mol/L cadaverine solutions

2.4 DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE的电化学表征

2.4.1 CV法

将GCE、Clay-AuNPs/GCE、uHb/Clay-AuNPs/GCE、DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE置于5 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中，利用CV法进行表征，结果如图7所示。由于Clay表面的负电荷对[Fe(CN)6]3-具有一定的排斥作用，K3Fe(CN)6在Clay-AuNPs/GCE（线b）上的氧化还原峰电流比在GCE（线a）上的明显减小。将uHb修饰在Clay-AuNPs/GCE上，由于uHb大的空间位阻使K3Fe(CN)6的响应电流进一步降低（线c）。K3Fe(CN)6在DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE上的氧化还原峰几乎消失，主要是由于DAO大的空间位阻阻碍了电子传递，同时表明DAO已固定在电极表面。

图7 GCE（a）、Clay-AuNPs/GCE（b）、uHb/Clay-AuNPs/GCE（c）、DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE（d）在5 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中的CV图Fig.7 Cyclic voltammograms for 5 mmol/L K3Fe(CN)6 on GCE (a),Clay-AuNPs/GCE (b), uHb/Clay-AuNPs/GCE (c), and DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE (d)

2.4.2 EIS分析

利用电化学阻抗（electrochemical impedance，EIS）对DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE的制备及应用过程进行监测，研究修饰电极的界面性质，得到EIS的Nyquist图谱（图8）。高频区半圆的直径代表电子转移阻抗（Rct），其大小反映K3Fe(CN)6等氧化还原探针在电极表面的电子转移动力学特性。由图8可以看出，与GCE（线a）相比，Clay-AuNPs/GCE（线b）的Rct明显增加，主要是由于Clay表面的负电荷对[Fe(CN)6]3-具有一定的排斥作用。uHb/Clay-AuNPs/GCE（线c）、DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GC（线d）和测试过尸胺溶液的DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE（线e）的Rct进一步依次增大，这主要是由于uHb和DAO大的空间位阻妨碍了电子转移，同时也表明uHb和DAO已被成功固定在电极表面。

图8 GCE（a）、Clay-AuNPs/GCE（b）、uHb/Clay-AuNPs/GCE（c）、DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE（d）、测试过尸胺的DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE（e）在5 mmol/L K3Fe(CN)6溶液中的EIS谱Fig.8 Nyquist plots of EIS for 5 mmol/L K3Fe(CN)6 on GCE (a), Clay-AuNPs/GCE (b), uHb/Clay-AuNPs/GCE (c), DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE (d), and DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE (e) used for testing cadaverine

2.5 性能测试

2.5.1 重复性

2.5.1.1 测试重复性

用同一支DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE在6.0×10-12mol/L尸胺溶液中连续扫描10 次，记录每次测定的尸胺还原峰电流值，并计算得出电流值的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为4.2%（n=10），表明DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE有较好的测试重复性。

2.5.1.2 制作重复性

制作5 支DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE，在优化条件下对6.0×10-12mol/L尸胺溶液进行测定，测得峰电流值的RSD为5.5%（n=5），表明DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE有较好的制作重复性。

2.5.2 选择性

以6.0×10-12mol/L尸胺溶液为对照，采用SWV法考察相同浓度的其他7 种生物胺，包括苯乙胺、精胺、酪胺、色胺、腐胺、亚精胺和组胺在DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE上的电化学响应情况。如图9所示，尸胺在该修饰电极上的响应灵敏度最高，在所测试的其他7 种生物胺中，苯乙胺的电化学响应极小，其余6 种生物胺均产生了一定的响应。以尸胺的响应值（按100%计）为参比，其他7 种生物胺的相对响应值大小顺序依次为：组胺（28.7%）、亚精胺（26%）、腐胺（25.2%）、色胺（22%）、精胺（16.4%）、酪胺（11.7%）、苯乙胺（2%）。因为马鲛鱼变质后会产生大量的尸胺，所以可以利用DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE对马鲛鱼中的生物胺含量（以尸胺计）进行测定，进一步可对马鲛鱼的新鲜度进行评价。

图9 相同浓度的其他7 种生物胺与尸胺的响应值比较图Fig.9 Comparison of electrochemical responses for other seven bioamines and cadaverine at the same concentration

2.5.3 稳定性

制备4支DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE，于第1天测定6.0×10-12mol/L尸胺溶液并记录其响应电流值，然后放于4 ℃冰箱保存。第7天时DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE对尸胺的响应电流值可以达到初始电流的95.2%，说明该电极在1 周内具有良好的稳定性。

2.5.4 线性范围和检出限

图10 DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE在不同浓度尸胺溶液中的SWV图Fig.10 SWV curves for cadaverine at different concentrations on DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE

在最优实验条件下，用DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE测定不同浓度的尸胺溶液，结果如图10所示。DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE在尸胺溶液中产生的还原峰电流值随尸胺浓度的增加而增大，还原峰电流差值（ΔI=I尸胺-IPBS）与尸胺浓度C在2.0×10-12～1.0×10-11mol/L浓度范围内呈良好的线性关系，其线性回归方程为：ΔI=37.181 2C＋2.402 8（r=0.991）。该法测定尸胺的检出限（RSN=3）为6.7×10-13mol/L。

2.6 样品分析与回收率的测定

取购买的冷鲜马鲛鱼，按照1.3.4节的样品前处理法进行前处理，然后使用SWV法进行检测。测得该马鲛鱼样品液中尸胺浓度为7.22×10-12mol/L，经换算得出该马鲛鱼样品中尸胺含量为23.05 mg/kg。为了验证此方法的准确性，对马鲛鱼样品进行加标回收实验。马鲛鱼样品中3.0×10-12mol/L尸胺的加标回收率为82.2%～109.1%，RSD为5.7%。

2.7 贮藏期间马鲛鱼中尸胺的变化

采用DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法同时对刚采购新鲜马鲛鱼（第0天）进行跟踪检测，即将新鲜马鲛鱼置于4 ℃冰箱内贮存，每隔1 d测定1 次，分别监测第0、2、4、6天马鲛鱼中尸胺含量的变化，结果如表1所示。DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE的测定结果与HPLC较为接近，表明该生物传感器法具有较高的准确度。随着贮存时间的延长，马鲛鱼中尸胺的含量也逐步增加，在贮藏至4 d后尸胺含量显着上升，此时马鲛鱼已失去光泽，腥臭味较重，纹理模糊，出现腐败状态，表明尸胺含量与马鲛鱼的腐败变质密切相关，因此可根据其含量变化对马鲛鱼贮藏期间的新鲜度进行快速评价。

表1 4 ℃贮藏的马鲛鱼尸胺含量变化（n=4）Table 1 Changes in cadaverine content of mackerel stored at 4 ℃ (n= 4)

图11 DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE与HPLC法检测样品中尸胺的线性相关性分析Fig.11 Linear correlation analysis between measured values of cadaverine in samples by DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE and HPLC

对2 种方法的测定结果进行线性回归分析，以DAOGLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE测得的尸胺含量为x轴，以HPLC法测得的尸胺含量为y轴，绘制散点图，做拟合曲线，结果如图11所示。线性回归方程为y=0.980 2x-6.389 2，r=0.999，说明基于DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE的电化学生物传感器法检测马鲛鱼样品中的尸胺结果准确可靠。

3 结 论

本实验基于二胺氧化酶可催化尸胺产生H2O2和变性Hb对H2O2具有良好的催化能力，建立了一种测定尸胺含量的电化学生物传感器法。为了得到最优的检测效果，对DAO的修饰质量浓度、过氧化物酶（模拟酶）的选择以及测试条件进行优化，并利用EIS和CV对修饰电极进行表征。结果表明：通过物理吸附法将酸和尿素诱导变性的血红蛋白固定在Clay-AuNPs/GCE表面，然后以2.5%的GLU为交联剂固定二胺氧化酶制得的DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE对尸胺有较好的检测效果，检出限为7.6×10-13mol/L。DAO-GLU/uHb/Clay-AuNPs/GCE具有良好的重复性和稳定性，且灵敏度高，可用于马鲛鱼等样品中尸胺含量的测定。