郭 垚，符 萌，李雪静，王 娜，常耀光，王静凤

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003）

肥胖是一种全身性代谢性疾病，体内脂肪过多积累会导致寿命缩短以及罹患II型糖尿病、心血管疾病等一系列健康问题[1-3]。脂肪组织在肥胖的发生发展过程中起着重要作用，研究表明，脂肪组织中脂肪细胞数目过多和体积过大则会导致肥胖[4-5]。因此调控脂肪细胞分化对改善肥胖及其引起的代谢疾病至关重要。

多糖生物活性的发挥依赖于它们的结构特征。近期研究发现，高级结构特征中的分子质量和链构象与多糖的功能发挥密切相关。袁松[6]发现，低分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯预防酒精性胃溃疡的效果优于高分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯；Sun Liqin等[7]对不同分子质量（6～1 000 kDa范围）紫球藻多糖的抗肿瘤和免疫活性进行了研究，结果表明，最小分子质量（6.53 kDa）的多糖具有最强的免疫增强活性。Kojima[8]和Falch[9]等发现裂褶多糖和香菇多糖抗肿瘤和免疫调节作用的实现依赖于其三股螺旋结构，当该螺旋被破坏时，相应的生物活性也随之降低或消失。

海参岩藻聚糖硫酸酯（sea cucumber fucoidan，SC-FUC）是海参体壁中的重要活性成分[10]。大量研究表明，SC-FUC具有抗炎[11]、抗凝血[12]、改善胰岛素抵抗[13]、改善饮酒导致的肝损伤[14]、抗肿瘤[15]、免疫调节[16]等多种生理功能。目前已有研究证明海参硫酸多糖可以抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化过程[17]，但关于SC-FUC高级结构与其抑脂活性相关性的研究鲜见报道，因此研究不同高级结构SC-FUC对脂肪细胞分化的影响具有深远意义。

本实验以3T3-L1细胞为研究对象，在体外水平对不同高级结构墨西哥海参岩藻聚糖硫酸酯（fucoidan from Holothuria mexicana，Hm-FUC）调控脂肪细胞分化的活性进行比较研究并探讨其作用机制，以期为SC-FUC活性的高效利用及其在功能食品领域的深入开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Hm-FUC由中国海洋大学食品科学与工程学院常耀光教授提供。

D M E M 培养基 美国G i b c o 公司；胎牛血清以色列Biological Industries公司；胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、地塞米松（dexamethasone，Dex）、胰岛素、油红O染料美国Sigma公司；乳酸脱氢酶试剂盒 南京建成生物工程研究所；RNeasy Mini Kit 德国Qiagen公司；M-MLV逆转录酶 日本Takara公司；SYBR Green荧光染料瑞士Roche公司；基因引物序列 上海生工有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HF 90型CO2培养箱 香港Heal Force公司；DL-CJ-IN型超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；IX51型倒置显微镜 日本Olympus公司；680型酶标仪美国Bio-Rad公司；Nano 200型微量分光光度计 杭州奥神仪器有限公司；LightCycler 96 Instrument实时荧光定量聚合酶链式反应仪 瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 Hm-FUC结构分析

参照续晓琪[18]的方法分析4 种Hm-FUC（Hm1、Hm2、Hm3、Hm4）的高级结构。

1.3.2 3T3-L1前脂肪细胞增殖活性测定

将细胞按2×103个/孔接种于96 孔板中，细胞贴壁24 h后，在培养基中加入不同质量浓度（0、20、40、80 μg/mL）的Hm1、Hm2、Hm3和Hm4，分别孵育24、48 h，采用MTT法测定细胞的增殖活性。细胞的相对增殖率按式（1）计算。

1.3.3 LDH活力测定

3)国家农机补贴目录中对于同样用途的提水设备，不分成本大小给予同样比例的补贴，可能不利于成熟机组的推广应用。

细胞接种及加样方法同1.3.1节。3T3-L1细胞经Hm1、Hm2、Hm3和Hm4作用48 h后，收集细胞培养上清液，使用试剂盒测定上清液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活力。

1.3.4 油红O染色及细胞分化率计算

将细胞按2×104个/孔接种于24 孔板中，待细胞融合后接触抑制48 h，采用“传统鸡尾酒”法进行诱导分化。于第0天添加受试物（Hm1、Hm2、Hm3和Hm4质量浓度均为60 μg/mL），每2 d更换培养基，分化至第8天进行油红O染色，于显微镜下进行观察拍照。

采用比色法对细胞中脂肪含量进行半定量检测。每孔中加入800 μL异丙醇，充分吹打混匀，于490 nm波长处测定OD值。细胞分化率按式（2）计算。

1.3.5 mRNA提取及逆转录

细胞接种、诱导分化及加样方法同1.3.4节。采用RNeasy Mini Kit试剂盒提取RNA，取1 μg RNA样品逆转录为cDNA。以所得cDNA为模板，采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测脂肪细胞分化相关基因的mRNA表达。以β-actin作为内参，基因相对表达量以目的基因表达量/β-actin表达量表示，引物序列见表1。

表1 脂肪细胞分化相关基因引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of genes related to adipocyte differentiation

1.4 数据统计分析

实验结果以 ±s表示，使用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，以P＜0.05表示具有统计学意义上的差异。

2 结果与分析

2.1 Hm-FUC结构分析结果

Hm-FUC原糖及其低分子质量多糖的重均分子质量（Mw）、均方根旋转半径（Rg）、水合半径（Rh）等分子特征和链构象参数如表2所示。Hm1、Hm2和Hm3均为无规卷曲链构象，且随着重均分子质量降低，多糖链逐渐变短变柔顺；Hm4为球形链构象。

表2 不同高级结构Hm-FUC的重均分子质量、分子尺寸和链构象参数Table 2 Molecular masses and chain conformational parameters of Hm-FUCs with different advanced structures

2.2 Hm-FUC对3T3-L1前脂肪细胞增殖活性的影响

图1 Hm-FUC 对3T3-L1前脂肪细胞增殖活性的影响Fig. 1 Effect of Hm-FUCs on the proliferation of 3T3-L1 preadipocytes

增殖是脂肪细胞分化必经的一个重要阶段[19]。为研究Hm-FUC对3T3-L1细胞增殖活性的影响，采用MTT法检测细胞存活率。细胞增殖曲线结果如图1所示，Hm-FUC可显着抑制3T3-L1细胞的生长，且随着时间延长和受试物剂量增加，抑制效果逐渐增强，呈现出明显的时间-效应和剂量-效应关系。当受试物质量浓度为80 μg/mL时，经Hm1、Hm2、Hm3和Hm4处理48 h，3T3-L1前脂肪细胞的存活率分别下降了14.88%、18.38%、18.46%和13.47%（P＜0.01）。结果表明，4 种Hm-FUC均可显着抑制3T3-L1细胞的增殖活性，其中Hm2和Hm3效果较好。

图2 Hm-FUC对3T3-L1前脂肪细胞LDH活力的影响Fig. 2 Effect of Hm-FUCs on LDH activity of 3T3-L1 preadipocytes

为进一步评估H m-F U C 的细胞毒性，检测了3T3-L1细胞培养上清液中LDH的活力。如图2所示，分别与Hm1、Hm2、Hm3和Hm4共孵育后细胞培养上清液中LDH的活力均无显着变化，表明Hm-FUC可以显着抑制3T3-L1细胞增殖活性，但不造成细胞损伤。综合MTT实验与LDH活力分析结果，本研究选取60 μg/mL作为受试物质量浓度进行后续实验。

2.3 Hm-FUC对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

图3 Hm-FUC对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响Fig. 3 Effect of Hm-FUCs on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes

油红O可以特异性结合甘油三酯[20]。染色结果如图3所示，经诱导分化后，对照组中近90%脂肪细胞可与油红O染料结合，表明3T3-L1细胞分化率高；而Hm-FUC对脂肪细胞的分化成熟有明显的抑制作用，受试物组细胞内甘油三酯含量减少，其中Hm3效果尤为显着。油红O半定量结果进一步证明了上述结果，经Hm1、Hm2、Hm3和Hm4处理后，3T3-L1细胞的分化率分别下降了9.14%、20.05%、21.15%和8.73%（P＜0.05，P＜0.01）。上述结果表明，4 种Hm-FUC均可不同程度地抑制3T3-L1细胞分化，其中Hm3（210 kDa，无规卷曲短链构象）活性最强。

2.4 Hm-FUC对脂肪细胞分化关键转录调控因子mRNA表达的影响

图4 Hm-FUC对脂肪细胞分化关键转录因子mRNA表达的影响Fig. 4 Effect of Hm-FUCs on mRNA expression of key genes related to adipocyte differentiation in 3T3-L1 preadipocytes

C/EBPα、PPARγ和SREBP1c是调控脂肪细胞分化过程的关键转录因子[21-22]。由图4可知，与对照组相比，Hm1、Hm2、Hm3和Hm4均能在转录水平上显着下调C/EBPα、PPARγ和SREBP1c的表达，表明4 种Hm-FUC均可以抑制脂肪细胞分化关键基因的mRNA表达，且低分子质量Hm-FUC优于高分子质量原糖，其中Hm3效果最优。

2.5 Hm-FUC对经典Wnt/β-catenin通路关键基因mRNA表达的影响

图5 Hm-FUC对Wnt/β-catenin通路上游关键基因mRNA表达的影响Fig. 5 Effect of Hm-FUCs on mRNA expression of key genes in Wnt/β-catenin signaling pathway in 3T3-L1 preadipocytes

Wnt/β-catenin信号通路是负调控脂肪细胞分化的经典通路[23]。如图5所示，Hm1、Hm2、Hm3和Hm4均可在转录水平上显着上调膜受体Frz以及LRP5/6辅助受体的表达（P＜0.05，P＜0.01），并下调Wnt通路重要负调控因子GSK3β的表达（P＜0.05，P＜0.01），但对Wnt10b的表达无显着性影响。

图6 Hm-FUC对β-catenin及其靶基因cmyc和CCND1基因mRNA表达的影响Fig. 6 Effect of Hm-FUCs on mRNA expression of β-catenin and its target genes cmyc and CCND1 in 3T3-L1 preadipocytes

此外，由图6可知，Hm1、Hm2、Hm3和Hm4均可显着上调β-catenin及其靶基因cmyc和CCND1的mRNA表达（P＜0.05，P＜0.01）。上述结果提示，不同高级结构的Hm-FUC均能显着上调Wnt/β-catenin通路，其中Hm3（210 kDa，无规卷曲短链构象）效果最优。

3 讨 论

本实验在体外水平对不同高级结构Hm-FUC调控脂肪细胞分化的活性及其机制进行了研究。结果表明，4 种Hm-FUC均可显着抑制脂肪细胞分化，其中Hm3（210 kDa，无规卷曲短链构象）活性最强。

脂肪细胞分化过程受一系列转录因子调控，主要包括PPARγ、SREBP1c和C/EBPα。Hwang等[24]证实秋葵叶提取物通过下调PPARγ和C/EBPα等关键脂肪生成转录因子的表达来抑制脂肪形成。Jeong等[25]发现通过诱导SREBP-1c蛋白磷酸化，抑制其向核内转位并与靶基因结合，从而减少脂肪生成基因表达和细胞内脂质积累。本实验中，Hm-FUC能显着下调SREBP-1c、PPARγ、C/EBPα的mRNA表达，表明Hm-FUC通过抑制脂肪细胞分化关键转录因子的表达，下调下游脂肪特异性基因的表达，从而抑制脂肪细胞分化。

Wnt配体（如Wnt6、Wnt10a和Wnt10b）可与细胞膜上Frz受体及LRPs辅助受体结合激活Wnt/β-catenin通路[26]。当Wnt信号被激活时，β-catenin得以在细胞质内稳定积累，进而移至核内，与TCF/LEF相互作用，调节下游靶基因CCND1和cmyc的表达。CCND1和cmyc通过合成组蛋白去乙酰化酶和抑制C/EBPα活性进而抑制PPARγ功能，最终抑制脂肪生成[27-28]。本研究中，4 种Hm-FUC均可在转录水平上显着上调Wnt通路关键基因表达，但对Wnt10b的mRNA表达无显着影响。Wnt10b为一类分泌蛋白，而本研究尚未对Wnt10b的蛋白表达进行测定。此外，Lee等[29]研究发现，IL-6可以激活Wnt/β-catenin通路而Wnt10b表达无显着变化。Hm-FUC通过激活Wnt/β-catenin通路，抑制脂肪细胞分化关键转录因子PPARγ和C/EBPα表达，从而抑制脂肪分化。

分子质量变化对多糖生物活性有着重要影响。Bhadja等[30]证实了低分子质量降解海藻多糖对受损HK-2细胞的修复活性优于未降解多糖；王凤舞等[31]在衰老模型小鼠上进行了研究，发现经过酶解的岩藻低聚糖相比于岩藻聚糖硫酸酯表现出更优越的抗氧化活性，清除羟自由基效果更好。本研究结果表明，酶解后的低分子质量Hm-FUC对脂肪生成的抑制效果优于原糖，且随着Mw降低，效果增强；但当分子质量降到一定程度，抑制脂肪生成效果反而减弱，表明Hm-FUC的分子质量与其抑制脂肪生成活性之间为非线性关系。Xu Zhou等[32]从油茶籽饼多糖中分离出分子质量为7.9、36、83 kDa和225 kDa的低分子质量多糖，其中分子质量为36 kDa时清除自由基能力最强，优于其他分子质量多糖。这与本研究结果是一致的，分子质量过大或过小都不利于多糖生物活性的发挥。

链构象是不同分子质量多糖表现出活性差异的一个重要因素，且目前相关研究主要集中在链形态和主链柔顺性上。岩藻聚糖硫酸酯内切酶CZ1127 Fucoidanase可以特异性切割α-L-Fucp2(OSO3-)-(1→3)-α-L-Fucp之间的α(1→3)-糖苷键[33]，在分子质量降低过程中，Hm-FUC分子链不断变短，同时分子的负电性降低，当分子质量降到一定程度时，转化为球形构象。朱玉婕[34]研究了3 种SC-FUC分子质量和链构象与改善胰岛素活性之间的关系，发现与球形构象相比，当SC-FUC为无规卷曲链构象时改善胰岛素抵抗的效果更好。Xu Xiaoqi等[35]的研究证明了梅花参岩藻聚糖硫酸酯球形构象对胃黏膜的保护作用优于无规卷曲构象。在本研究中，当Hm-FUC多糖由无规卷曲链构象转化为球形链构象时，抑制脂肪细胞分化活性减弱。通过酶切的作用，Hm-FUC的αs参数随Mw的降低而下降，说明Hm-FUC原糖的半刚性链被打散，多糖链构象趋于松散、柔顺。本研究中，在无规卷曲链构象范围内，随着主链柔顺性增加，Hm-FUC的抑制脂肪生成活性增强。上述研究表明，Hm-FUC分子质量变化引起的链构象变化是其活性改变的重要原因，可能是脂肪细胞对不同链形态的敏感度不同，因此链构象的转化导致了其活性的变化；而当多糖链形态相同时，主链的柔顺性在一定程度上影响其生理活性，但多糖链构象差异影响其活性的内在原因还需要通过进一步实验深入探究。

综上所述，Hm-FUC可以抑制脂肪细胞分化，该作用是通过Wnt/β-catenin通路实现的。在100～4 000 kDa分子质量范围内，210 kDa、无规卷曲短链构象的Hm-FUC抑脂活性最强。本实验研究了Hm-FUC高级结构与其抑制脂肪细胞分化活性之间的关系，为Hm-FUC的高效利用和深度开发提供了理论依据。