基于特异性适配体封盖介孔纳米材料的T-2毒素快速检测技术

徐群博，谭红霞，马 良

（西南大学食品科学学院，重庆 400715）

T-2毒素是一种由多种镰刀霉菌产生的真菌毒素，对多种粮食作物造成污染[1]。T-2毒素对动物体的生殖系统[2]、免疫系统[3]、神经系统[4]等都具有一定毒性作用，且由于强烈的急性毒性，T-2毒素在近几十年内仍被用于生物战剂中。由于具有与黄曲霉素相似的毒性和危害，对于T-2毒素的研究正逐渐成为新的热点。在中国，对于T-2毒素的检测是谷物、食品、动物饲料等安全检测的必要环节。目前，主要的T-2毒素检测方法包括高效液相色谱法[5]、气相色谱-质谱联用法[6]、气相色谱法[7]、酶联免疫法[8]等，国家标准对于其中的部分T-2毒素检测方法进行描述[9-10]。目前的快速检测方法主要包括酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测和金标试纸条等技术[11]，其原理均为基于抗原抗体特异性免疫反应的标记型检测方法，需要通过标记酶、胶体金或发光材料等提高检测灵敏性。其中，ELISA方法是主流的检测方法，采用试剂盒形式，检测时间约为3 h，适合高通量定性或半定量筛查。而试纸条技术的检测时间较短，但主要进行定性筛查。开发非标记型、低成本T-2毒素快速定量检测方法对快速准确识别T-2毒素污染和控制其风险有非常积极的作用。

介孔二氧化硅纳米（mesoporous silica nanoparticles，MSN）材料具有表面多孔、性质稳定等多种优点，可以通过空穴起到运输、富集微粒的作用，已有报道用于药品的装载以及物质的检测[12-14]。核酸适配体能与目标物质高特异性、高选择性地结合，在生物传感器的研究与物质检测中受到广泛运用[15-19]。本研究期望构建一种以MSN材料和T-2毒素特异性适配体为基础，以荧光信号探针罗丹明6G（Rhodamine 6G，Rh6G）染料为直接检测物，通过体系释放的染料探针荧光强度和毒素质量浓度之间的关系，间接检测T-2毒素含量的非标记型T-2毒素快速检测方式，相较于ELISA方法，该方法采用适配体作为免疫识别器，降低了检测成本，同时由于免去了标记过程，缩短了毒素检测所需的时间，更适用于非实验室环境下的快速定量检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3-氨丙基三乙氧基硅烷（(3-aminopropyl)triethoxysilane，APTES）、正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）、Rh6G 美国Damas-beta公司；NaOH 中国重庆川东化工（集团）有限公司；十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB） 美国Biosharp公司；T-2毒素、黄曲霉素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黄曲霉素G1（aflatoxin G1，AFG1）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素（ochratoxin，OTA） 美国Sigma公司；T-2适配体（gTA TAT CAA gCA TCg CgT gTT TAC ACA TgC gAg Agg CgA A） 生工生物工程（上海）股份有限公司；所有材料与试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2450紫外分光光度计 日本岛津公司；F-2500荧光分光光度计 日本日立公司；台式高速离心机德国Eppendorf公司；JEM-1200EX透射电子显微镜日本电子株式会社。

1.3 方法

1.3.1 MSN的制备

参照文献[20-22]方法。取0.5 g CTAB置于圆底烧瓶中，加入240 mL超纯水使CTAB充分溶解，用油浴加热到80 ℃，加入1.75 mL 2 mol/L的NaOH溶液。在剧烈搅拌下，逐滴缓慢加入2.50 mL TEOS，反应2 h后，静置冷却，将生成的白色絮状沉淀在10 000 r/min离心12 min，将沉淀与液相分离，所得产物依次用乙醇和水洗涤3 次，放入真空冷冻干燥箱中过夜干燥，即可得到含有模板CTAB的MSN。

将干燥好的颗粒放入马弗炉中，调节温度至550 ℃，灼烧5 h，即可得到除去模板的MSN颗粒。

1.3.2 氨基修饰的MSN的制备

参照文献[21, 23-26]方法。称取0.5 g MSN颗粒，分散于50 mL含有1.5 mL APTES的无水乙醇中，在110 ℃热油浴中缓慢搅拌10 h，将沉淀物在12 000 r/min离心10 min，所得产物依次用乙醇和水洗涤3 次，放入真空冷冻干燥箱中过夜干燥，得到氨基修饰的MSN颗粒（NH2-MSN）。

1.3.3 适配体封盖及可行性分析

准确称取 30 mg NH2-MSN置于离心管中，加入500 μL 1 mmol/L的Rh6G溶液，于25 ℃振荡12 h，然后加入200 μL 50 μmol/L的核酸适配体，于25 ℃封盖5 h，将多余的染料洗脱。将装载有Rh6G的适配体封端的MSN重新分散到磷酸盐缓冲液（pH 8.0）中。

准备2 组20 μL上述颗粒分散液，其中一组加入质量浓度为10 ng/mL的T-2毒素溶液，另外一组作为对照。两组溶液分别于37 ℃反应2 h后，离心，取上层清液在25 ℃测定荧光强度，记录样品的荧光光谱。比较两组溶液的荧光强度。测试过程采用信号探针罗丹明的最大激发波长（480 nm），扫描波长范围为530～600 nm[27]。

1.3.4 影响荧光强度的关键反应过程条件分析

以1.3.3节方法为基础，在NH2-MSN、Rh6G的量以及封盖、反应及检测温度不变的情况下，分别研究适配体封盖浓度、封盖时间、与毒素反应时间对于检测后荧光强度的影响。设置浓度分别为5、10、20、40、50、75、100 μmol/L；设置封盖时间分别为40、70、120、150、180、240、300 min；设置反应时间分别为40、70、90、120、150、180、300 min。分别检测荧光强度并比较各项研究中各组之间荧光强度的差异。

1.3.5 T-2毒素质量浓度与荧光强度之间的线性关系分析

在1.3.4节研究确定的条件下测定不同质量浓度（0、0.005、0.05、0.5、1、2、5、7.5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、250 ng/mL）T-2毒素的荧光强度，以毒素质量浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标绘制标准曲线，通过曲线得出该方法的毒素检测范围，以3 倍空白对照组荧光强度对应的毒素质量浓度为检出限。

1.3.6 特异性分析

在1.3.4节研究确定的条件下，测定干扰毒素（AFB1、AFG1、OTA、ZEN）的荧光响应值，对比T-2毒素的荧光响应值分析方法特异性。

1.3.7 方法准确度分析

以玉米、大麦、小麦等作物[28]为检测样品，向检测样品中加入T-2毒素标准品溶液，浸泡过夜后挥干溶剂，配制成不同水平的加标阳性样本，其处理方法为：将5 g加标样品粉碎后分散在20 mL乙腈-水（7∶3，V/V）溶液中，超声处理2 min（过程中每分钟取出旋涡振荡0.5 s），静置10 min后在15 000 r/min离心15 min，两次。将上清液稀释100 倍后添加不同含量的T-2毒素制配成为不同水平的加标阳性样品。按照1.3.3节方法检测并计算回收率。

1.4 数据统计及图表绘制

各实验重复3 次，各样品的指标进行3 次平行测定，结果以表示。使用SPSS 18.0软件对数据进行单因素方差分析（P＜0.01，差异显着），用Origin 8.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 T-2毒素的检测策略构建及可行性分析

如图1所示，将具有荧光特性的Rh6G作为信号探针装填在MSN的孔穴中，MSN表面的氨基和T-2毒素特异性核酸适配体通过静电作用结合，从而对材料上的孔穴进行封盖，当目标检测样中存在T-2毒素时，介孔表面的T-2毒素特异性适配体会与T-2毒素发生特异性的结合并使适配体脱离介孔材料，以此实现孔盖的打开，荧光探针随之被释放出来，通过检测荧光信号探针相应荧光信号变化情况值间接反映T-2毒素含量。

图1 T-2毒素检测策略原理示意图Fig. 1 Schematic diagram showing the principle of toxin detection usin MSN

按照1.3.3节方法对该方法进行可行性分析，如图2所示，未加入毒素时，溶液的荧光值较低，当加入10 ng/mL的T-2毒素溶液时，荧光值显着升高，这是由于T-2毒素与适配体发生特异性结合导致适配体脱落颗粒表面释放出Rh6G导致，以上结果表明该方法可行，结果与设计的检测策略一致。

图2 接触靶标T-2毒素前后体系的荧光强度变化（CT-2＝10 ng/mL）Fig. 2 Changes in fluorescence intensity of the system before and after exposure to T-2 toxin (CT-2 = 10 ng/mL)

2.2 NH2-MSN表征分析

按照1.3.1节方法合成NH2-MSN材料，采用透射电子显微镜进行表征，结果如图3所示，所合成的NH2-MSN颗粒分散性良好，粒径大小均一，可以看到明显的微孔结构，颗粒呈球形，尺寸在100 nm以内，属于纳米级介孔型富集材料。

图3 透射电镜表征结果Fig. 3 TEM image of MSN

图4 MSN与N2-MSN材料的红外光谱（A）和Zeta电位（B）表征结果Fig. 4 FTIR spectra (A) and zeta potential (B) of MSN and NH2-MSN

如图4所示，MSN的FTIR谱图中仅有二氧化硅的振动峰，而NH2-MSN在1 500 cm－1（图4A）附近出现了氨基的特征峰，表明颗粒表面已修饰上氨基。同时，图4B中MSN颗粒电位为－27.2 mV，NH2-MSN电位为19.7 mV，电位明显升高，进一步表明颗粒表面修饰上了氨基。参考文献[27]可以得出结论，微粒表面成功修饰了大量氨基，有大量氨基与适配体产生静电结合，将荧光信号探针Rh6G封盖在微粒的孔穴中，实现信号探针的富集，此时为检测前体系，反应较低但较稳定的荧光强度。

2.3 体系条件对荧光强度的影响

2.3.1 T-2适配体浓度对荧光强度的影响

适配体封盖浓度与时间是影响微粒表面适配体吸附量主要因素，而适配体吸附量直接影响了方法的检测效果，当表面附着当适配体吸附量较少时，由于Rh6G无法被完全封盖在孔隙之中，导致在洗脱外部染料时，部分孔隙中的染料由于缺乏适配体的阻挡散逸在洗脱液中，导致在反应后荧光强度偏小，检测性能较差；而当适配体的吸附量过大时，即使核酸适配体与T-2毒素结合，可能仍有适配体封盖在NH2-MSN的表面，从而影响Rh6G的释放，使荧光强度偏低，检测性能偏小。因此对于适配体封盖浓度、时间的研究十分必要。

图5 T-2毒素适配体浓度对反应体系荧光强度的影响Fig. 5 Effect of T-2 toxin aptamer concentration on fluorescence intensity of reaction system

由图5可知，随着适配体浓度增加，各适配体浓度下的荧光强度呈现先上升后下降的趋势，可以推测出随着适配体浓度的上升，首先更多的Rh6G被封盖在微粒孔穴内，而部分孔穴由于适配体浓度不足仍然无法封盖导致洗脱后微粒中的染料数量偏低，当适配体浓度增加时，首先所有的孔穴都被封盖，反应后荧光强度达到最高。但适配体浓度继续增大时，即使适配体与目标物T-2毒素结合，可能仍有少量的适配体封盖在介孔颗粒的表面，从而影响了Rh6G的释放，其荧光强度下降。因此，T-2核酸适配体封盖浓度采用50 μmol/L。

2.3.2 T-2适配体封盖时间对荧光强度的影响

由图6可知，随着封盖时间的延长，体系中的荧光强度首先上升，直到3 h时趋于平缓。这是由于随着封盖时间延长，更多的适配体附着在微粒表面并将Rh6G染料被封盖在孔隙之中，当封盖时间到达3 h后，体系中的适配体几乎完全附着在纳米材料表面，从而达到封盖的目的，使得更多的Rh6G富集在纳米材料内，提高T-2检测的灵敏度。因此，T-2核酸适配体封盖时间采用3 h。

图6 N2-MSN封盖时间对反应体系荧光强度的影响Fig. 6 Effect of capping time of NH2-MSN on fluorescence intensity of reaction system

2.3.3 毒素反应时间对荧光强度的影响

如图7所示，随着反应时间的延长，荧光强度呈现先上升后趋于平稳的趋势，且荧光强度在2 h时达到最高。这是由于随着反应时间的延长，更多的适配体与T-2毒素特异性结合，使得适配体从NH2-MSN表面脱离，释放出孔穴中的Rh6G。当反应2 h后，T-2与适配体反应完全，无法再使更多的适配体脱离，体系中的Rh6G浓度不再发生变化，随着反应时间的延长，荧光强度也不再发生较大变化，因此采用2 h作为与毒素反应时间。

图7 反应时间对反应体系荧光强度的影响Fig. 7 Effect of reaction time on fluorescence intensity of reaction system

2.4 体系检测的线性范围

以2.3节优化条件对不同浓度的T-2毒素进行检测。以不同质量浓度的T-2毒素为横坐标、荧光强度为纵坐标绘制标准曲线图，如图8所示，随着T-2毒素质量浓度的增加，荧光强度逐渐增大，说明随着体系中毒素的增加，更多的适配体与毒素发生特异性结合并离开微粒表面，从而导致更多的荧光染料被释放，荧光强度不断上升。从图8可以看出，该分析方法在0～50 ng/mL或50～200 ng/mL之间具有较好的线性关系，当T-2毒素质量浓度在0～50 ng/mL之间时，其线性回归方程为y＝9.750 2x＋64.939，R＝0.993，当T-2毒素质量浓度在50～250 ng/mL时，其线性回归方程为y＝1.697 0x＋497.90，R＝0.977。该方法检出限为1.25 ng/mL。实际应用时可以根据不同毒素含量水平选择不同线性范围计算。

图8 T-2毒素质量浓度与荧光强度关系Fig. 8 Correlation between T-2 toxin concentration and fluorescence intensity

2.5 特异性分析

图9 方法特异性Fig. 9 Selectivity of the detection method for different toxins

图9 显示，在相同实验条件下，体系对T-2毒素检测效果最好，其他干扰毒素的响应很低，甚至无响应，说明T-2毒素适配体和本检测体系对其他的毒素无法形成特异性识别，因此依然吸附在微粒表面，无法释放在体系中，荧光强度变化值较小。因此，该方法对T-2毒素具有较好的选择性，在使用过程中受其他毒素的影响较小，可以用于T-2毒素的特异性检测。

2.6 方法的准确度和精密度结果

按照1.3.7节方法进行加标回收实验，结果如表1所示，利用传感器检测的加标回收率在85.8%～111.4%范围内，且相同质量浓度下测得数据标准差较小，相对标准偏差在4.6%以内，说明该检测方法具有较好的准确性和精密度，可用于真实复杂样品中T-2毒素的测定。

表1 实际样品加标回收率（n＝3）Table 1 Recoveries of the method for spiked samples (n= 3)

3 讨 论

本实验建立一种非标记型基于介孔二氧化硅材料结合适配体封盖的T-2毒素检测技术，可有效避免目前主流的标记型方法在使用标记过程对抗体等免疫产品活性造成影响的问题。通过实验发现，本方法检测结果呈现较好的准确性、精密性和特异性，具有高灵敏度，且线性范围较宽是一种简单快速有效的非标记型T-2毒素定量检测方式。与目前我国主流快检技术中的ELISA等标记型检测方法相比，本法检测时间不超过2 h，检测速度略高于ELISA方法约1 h；但本方法属于非标记型方法，且原理不需要竞争抑制作用，因此省去了检测产品标记过程，最大限度保护了免疫产品（抗体、适配体）活性，也避免了ELISA方法中酶标抗原（酶标毒素）的使用，对操作人员和环境更为安全；而且本方法在同等高灵敏度水平的前提下线性范围明显宽于ELISA，可有效用于各污染水平范围的样品测定。因此，本研究方法可以在较宽的线性范围内进行T-2毒素快速灵敏的定量检测。本实验构建的该方法思路和材料具有其他毒素检测应用的普适性，可以通过不同毒素适配体和条件的研究进行推广应用。