高菜硫代葡萄糖苷提取物对人结肠癌细胞HCT116的抑制作用

田 艳，邓放明*，赵玲艳，廖 安，赖灯妮，陈秋佳

（湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128）

硫代葡萄糖苷（简称硫苷）（glucosinolate，GSL）及其降解产物是十字花科植物中的一类含硫次生代谢产物，不仅具有预防慢性疾病（包括心血管疾病、糖尿病、肥胖症等）、防癌抗癌、抗氧化等多种生物活性，还是十字花科蔬菜风味和气味形成的重要前体物质，硫苷是目前国际上研究的热门课题之一[1-3]。十字花科植物中硫苷类物质的含量、种类及其生物活性随种类品种、栽培技术、生长环境和加工处理不同有较大的变化。高菜（Brassica junceavar.integlifolia），又名紫脉大叶芥菜，属于十字花科芸苔属植物，由叶用芥菜宽柄芥变种而来，其植株高约50 cm，叶柄宽厚，叶片宽大，叶脉紫红色，耐寒、耐抽薹，产量高，商品性好，高菜性喜冷凉湿润，适宜生长温度为l5～20 ℃[4]。近年来，高菜是湖南和浙江等省广泛种植的用于腌制菜加工的主要原料，发酵加工后其质地脆嫩，味道鲜美，深受消费者的青睐[5-7]。但高菜中硫苷类物质的含量和种类鲜有报道，Jo等[8]报道了高菜硫苷具有降血糖作用，Yoo等[9-10]报道了高菜硫苷的抗氧化和降血压作用。十字花科植物硫苷的抗癌活性有较多研究[11-13]，主要活性成分是硫苷的分解产物，如异硫氰酸酯、腈、硫氰酸酯、乙硫腈和恶唑烷类等，尤其是黑介子苷以及其降解产物异硫氰酸烯丙酯、萝卜硫素、吲哚-3-甲醇等的抗癌研究报道较多[14-16]，据报道吲哚-3-甲醇和萝卜硫素能显着抑制结肠癌细胞[17]，但鲜有关于高菜硫苷的抗癌功效的报道。

目前，结肠癌是人群中发病率最高的恶性肿瘤之一，严重威胁着人们的生命健康，研究新型天然抗结肠癌物质越来越受到人们关注，人结肠癌细胞株HCT116是结肠癌体外实验研究最常用的材料[18-19]。因此，本实验采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用（high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS）技术分析高菜硫苷提取物中主要硫苷类物质，并通过人结肠癌细胞株HCT116体外实验初步研究高菜硫苷提取物的抗结肠癌效果，以期为揭示高菜的保健功能和高菜硫苷提取物的开发利用提供一定实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高菜：湖南省华容县芥菜基地。

弱阴离子交换树脂 郑州和成新材料科技有限公司；黑芥子硫苷酸酶 上海恒斐生物科技有限公司；葡萄糖氧化酶 北京酷来搏科技有限公司；过氧化物酶北京亚米生物科技有限公司；乙腈、甲酸、无水乙醇（色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司；人结肠癌细胞HCT116、CCD-18Co正常人结肠组织细胞 美国标准培养物收藏中心；RPMI-1640培养基 美国VWR公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美国Hyclone公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、青霉素（penicillin）、链霉素（streptomycin）（美国Sigma公司）；四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（分析纯）、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）；磷酸酶抑制剂I、磷酸酶抑制剂II、胰蛋白酶、反β-肌动蛋白抗体（anti-β-actin antibodies） 美国Sigma公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、异丙醇、乙醇、氯仿（分子生物学级） 美国Fisher BioReagents公司；核糖核酸酶抑制剂、高容量cDNA逆转录试剂盒（high-capacity cDNA reverse transcription kit）、Green master mix SYBR美国Applied Biosystems公司；TRIzol RNA提取剂、膜联蛋白-V、碘化丙啶（propidium iodide，PI） 美国Invitrogen公司；引物 美国Integrated DNA Technologies公司；细胞周期蛋白B、D1、E（Cyclin B、D1、E）、半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3）和裂解半胱氨酸蛋白酶（Cleaved caspase-3） 美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 仪器与设备

UV-1200型紫外-可见分光光度计 上海翱艺仪器有限公司；1290 HPLC串联6530 Q-TOF/MS 美国Agilent公司；Alpha 1-2 LDplus冷冻干燥仪 德国Christ公司；Micro 5417R高速冷冻离心机 美国赛默飞世尔公司；Elx800TM酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；FACSort流式细胞仪 美国BD Bioscience公司；Odyssey CLx红外成像系统 美国Li-Cor Bioscence公司；Hei-VAP G3 560-01302-00旋转蒸发仪 德国海道夫公司；1645050型电泳仪美国伯乐公司；CB系列CO2培养箱 德国宾得公司；DNA Engine 2 Opticon实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）仪美国MJ Research公司；TS100倒置显微镜 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

从田间采收新鲜高菜，清洗表面污泥，晾干，切碎混匀并进行真空冷冻干燥，高速中药粉碎机粉碎，过60 目筛，装袋密封，放于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.3.2 总硫苷的提取和纯化方法

参照文献[20-22]方法并作适当修改。提取方法：称取2.0 g干燥样品置于250 mL锥形瓶中，加入50 mL体积分数70%乙醇溶液，70 ℃恒温水浴提取30 min，冷却静置，4 000×g离心10 min收集上清液，沉淀物再用30 mL体积分数70%乙醇溶液重复提取2 次，合并3 次上清液，合并后采用旋转蒸发仪浓缩至一定体积，待纯化。纯化方法：采用柱层析法进行纯化，填料使用酸性氧化铝，先用100 mL蒸馏水进行洗脱以平衡柱体，采用湿法上样，每次上样量为5 mL，然后用500 mL硝酸钾溶液（0.1 mol/L）以3 mL/min的速率进行洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发至一定体积，再冷冻干燥得到粉末样品。

1.3.3 总硫苷含量的测定

总硫苷含量的测定根据SN/T 1868—2007《进出口油菜籽及其饼粕中硫苷总量的测定》[23]。

分别取0.1 g高菜冻干粉末和高菜硫苷提取物冻干粉末分别溶解于100 mL蒸馏水中，分别取5 mL溶液流经已活化的DEAE Sephadex A-25离子交换柱，加入5 mL醋酸钠溶液（0.02 mol/L）清洗柱子以去除未结合的物质，然后向层析柱中加入1.0 mL黑芥子硫苷酸酶溶液（50 mg/mL），37 ℃恒温水浴加热1 h后，用3 mL超纯水分3 次洗脱层析柱，混合洗脱液于10.0 mL容量瓶中，加入2.0 mL苯酚-钨酸溶液，加水定容。从中准确吸取1.0 mL置于试管中，加入3.0 mL葡萄糖显色液，37 ℃水浴30 min，冷却至室温，用紫外-可见分光光度计在505 nm波长处测定吸光度，根据标准品葡萄糖含量及其吸光度绘制标准曲线，定量分析高菜冻干粉末和高菜硫苷提取物粉末中总硫苷含量。

1.3.4 硫代葡萄糖苷鉴定的高效液相色谱-质谱条件

参照文献[24-26]并作适当调整。色谱条件：色谱柱Phenomenex C18柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流动相：A 0.1%甲酸水溶液，B乙腈；梯度条件：0～20 min：1%～45% B；20～30 min：45%～90% B；检测波长210 nm；流速0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量为5 μL。

质谱条件：ESI离子源；负离子模式；喷雾器压力：35 psig；干燥气温度：350 ℃；干燥气流速：10 L/min；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：12 L/min；毛细管电压：3 500 V；锥孔电压：1 000 V；扫描离子范围：m/z100.00～1 200.00；二级裂解电压15～50 eV。

1.3.5 MTT法测定人结肠癌细胞株HCT116细胞活性

人结肠癌细胞株HCT116细胞活化并传代至稳定，传代后培养于CO2培养箱中（温度37 ℃，相对湿度5%），24 h后再将细胞种板于96 孔板中（细胞种板浓度为1.25×104个/mL），培养24 h后弃去上清培养液。将1.3.2节中高菜硫苷提取物冻干粉末用DMSO溶解并配成溶液，再分别取3 μL DMSO样品溶液分别加入到3 mL的培养液中，最终得到质量浓度为0、50、100、150、200、300、400、500、600 μg/μL高菜硫苷提取物的培养液。用移液枪将以上不同质量浓度的高菜硫苷提取物的培养液移入弃去上清培养液的96 孔板中（200 μL/孔），培养24、48、72 h后用MTT法测定高菜硫苷提取物对细胞增殖的抑制作用，弃去含不同浓度硫苷提取物的培养液，每孔板中加入MTT溶液（0.5 mg/mL）100 μL，培养2 h，轻轻倒掉MTT溶液，加入100 μL DMSO溶解96 孔板中的紫色甲瓒晶体，轻轻拍打孔板外侧边缘混匀晶体，用酶标仪于570 nm处测定吸光度，计算细胞抑制率。同时对CCD-18Co细胞同样处理以验证高菜硫苷提取物对细胞的毒性。

1.3.6 细胞周期分析

将人结肠癌细胞株HCT116细胞（细胞浓度为2×104个/mL）接种在6 孔板中，于CO2培养箱中培养24 h，倒掉上清培养液，每孔终加入高菜硫苷提取物（浓度根据1.3.5节中细胞活性结果及半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值确定）0.5 mL/孔，培养48 h，然后用胰蛋白酶分离细胞，再经磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（10 mmol/L，pH 7.4）洗涤，70%乙醇固定，-20 ℃下将细胞在黑暗中重悬于含有核糖核酸酶（50 μg/mL）和碘化丙啶溶液（200 μg/mL）的PBS中，空白对照同样处理，最后使用流式细胞仪分析细胞周期[27-28]。

1.3.7 细胞凋亡分析

细胞种板及提取物处理细胞同1.3.6节，将细胞用PBS（10 mmol/L，pH 7.4）（0.5 mL/孔）洗涤，0.25%胰蛋白酶（0.5 mL/孔）分离细胞，然后各孔中加入结合缓冲液（1 mmol/L）0.3 mL，在黑暗中将细胞用凋亡液（含膜联蛋白-V溶液（1 mmol/L）、FITC溶液（1 mmol/L）、PI溶液（200 μg/mL），体积比1∶1∶2）进行染色，空白对照同样处理，室温下放置30 min后使用流式细胞仪分析细胞凋亡[29-30]。

1.3.8 蛋白质印迹法（Western blot，WB）分析高菜硫苷提取物对人结肠癌细胞株HCT116细胞相关蛋白的影响

实验步骤参照文献[31]并作适当调整。将人结肠癌细胞株HCT116细胞种于25 cm培养皿中（细胞浓度3.5×104个/mL，12 mL），培养24 h后，倾倒上清培养液，每平皿加入高菜硫苷提取物（浓度根据1.3.6节和1.3.7节中细胞周期和凋亡结果确定，12 mL）培养48 h，利用裂解液（裂解缓冲液RIPA（2×）、蛋白酶抑制剂（100×）、磷酸酶抑制剂Ⅰ（100×）、磷酸酶抑制剂I（100×），体积比50∶1∶1∶1）提取细胞蛋白质，并采用考马斯亮蓝法对其蛋白含量进行检测，加入相对应体积的5 倍蛋白上样缓冲液，95 ℃加热10 min进行蛋白变性，存于-80 ℃冰箱备用。

配制质量分数12%丙烯酰胺分离胶50 mL，每次取约6 mL注入灌胶模具，静置30 min，制成分离胶；配制质量分数5%丙烯酰胺浓缩胶50 mL，每次取约2 mL注入灌胶模具，静置60 min，制成浓缩胶。分别将浓缩胶和分离胶玻璃板装入电泳装置，上样（5 μL标准蛋白上样于两侧）后进行电泳，100 V电泳15 min，当样品即将从浓缩胶进入分离胶时，更改电压为160 V，继续电泳45 min，直至目标蛋白完全分离开为止。取出凝胶进行蛋白转膜（100 V，1 h 45 min），封闭，孵育一抗、二抗，然后使用红外成像仪进行成像检测。

1.3.9 qPCR检测mRNA水平

总RNA提取：将人结肠癌细胞株HCT116细胞接种于25 cm培养皿中（细胞浓度3×105个/mL，12 mL）培养24 h，倾倒上清培养液，每平皿加入高菜硫苷提取物（浓度根据1.3.6节和1.3.7节中细胞周期和凋亡结果确定，12 mL）培养48 h，倾倒上清培养液加入0.5 mL TRIzol试剂进行吹打，静置培养5 min待细胞完全溶解，加入0.1 mL氯仿，摇匀，轻漩涡后静置3 min，离心（12 000 r/min，4 ℃，15 min），吸取上清液并加入0.25 mL异丙醇，摇匀后静置10 min，离心（12 000×g，4 ℃，10 min），弃上清液留沉淀，加入0.5 mL 75%乙醇，摇匀，离心（7 500×g，4 ℃，5 min），弃掉上清液，真空干燥5 min，加入30 μL不含RNA酶的纯水中溶解RNA，280 nm波长处测定吸光度并计算RNA的浓度，分装于-80 ℃冰箱中备用。

按逆转录试剂盒说明书配制反应液，合成cDNA反应参数为：25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min。qPCR仪循环参数：95 ℃ 预变性10 min，95 ℃ 120 s，95 ℃ 15 s，50 ℃ 120 s，60 ℃ 60 s，40 个循环。

具体引物系列如表1所示[32-36]，将GAPDH用作内源性对照，并根据GAPDH含量对每个样品进行标准化。使用2－ΔΔCt方法计算目标基因的mRNA表达水平的相对定量，每个样品重复3 次独立平行实验。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 数据统计分析

采用GraphPad Prism 8.0软件计算细胞的IC50，细胞流式数据采用FlowJo 7.6软件进行分析，WB采用Image J软件对目标蛋白条带光密度进行定量。所有数据均采用SPSS 19.0进行统计分析处理，计量数据采用平均值±标准差表示，采用单因素方差分析比较组间差异显着性，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 高菜硫苷含量测定结果

采用紫外分光光度法对新鲜高菜和高菜硫苷提取物中总硫苷的含量进行了检测，结果显示，新鲜高菜中总硫苷含量为15.45 mg/g；70%乙醇提取，高菜总硫苷的得率为1.545%；高菜硫苷提取物中总硫苷质量分数为73.7%。

2.2 高菜硫苷提取物中硫苷成分分析结果

通过HPLC-Q-TOF-MS技术得到高菜硫苷提取物的总离子流图，如图1所示。根据文献报道的硫苷物质分子结构，对分子质量的误差值小于10×10-6（m/z）的化合物进行二级质谱分析，利用二级质谱数据进行硫苷物质结构的初步解析，于保留时间1.855 min的主要峰中发现主要成分2-丙烯基硫苷，于保留时间8.781 min的主要峰中发现主要成分4-甲基硫代丁基硫苷，于保留时间10.126 min的主要峰中发现主要成分4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷，3 种硫苷化合物如与标准品进一步比对便可确认。其他主峰因没有找到对应的硫苷物质，需要通过其他方法进行结构分析。

图1 高菜硫苷提取物的总离子流图Fig.1 Total ion current chromatogram of glucosinolates extracted from Brassica juncea var.integlifolia

2.2.1 2 -丙烯基硫苷结构解析结果

在高菜硫苷提取物中（保留时间1.855 min）发现主要化合物的离子碎片m/z358.026 8，与化合物2-丙烯基硫苷分子质量一致，其二级质谱图如图2所示，该化合物中有特征离子m/z274.990 8、259.011 3、241.002 2、195.031 7、161.985 1、138.969 3、116.016 8，结构解析如图3所示，碎片离子m/z241.002 2、259.011 3、195.031 7、274.990 8推测为2-丙烯基硫苷的硫与相邻碳原子发生断裂后形成，碎片离子m/z161.985 1推测为2-丙烯基硫苷的碳硫键（S-C1’）断裂从而失去硫代葡萄糖基团与相邻的氢（H-2’）而形成，碎片离子m/z138.969 3推测为硫酸化的葡萄糖发生裂解反应形成。因此初步推测该化合物为2-丙烯基硫苷，本实验推测的结果与相关文献[37-38]报道一致。

图2 2-丙烯基硫苷二级质谱图Fig.2 Tandem mass spectrum of 2-propenyl glucosinolate

图3 2-丙烯基硫苷结构解析Fig.3 Structure analysis of 2-propenyl glucosinolate

2.2.2 4 -甲基硫代丁基硫苷结构解析结果

在高菜硫苷提取物中（保留时间8.781 min）发现m/z422.057 9离子碎片，与化合物4-甲基硫代丁基硫苷分子质量一致，其二级质谱图如图4所示，该化合物出现特征离子m/z259.011 1、195.023 2、163.042 2、96.961 0，结构解析如图5所示，碎片离子m/z259.011 1、195.023 2推测为4-甲基硫代丁基硫苷的硫与相邻碳原子发生断裂后形成，因此初步推测该化合物为4-甲基硫代丁基硫苷，本实验推测的结果与相关文献[39-40]报道一致。

图4 4-甲基硫代丁基硫苷二级质谱图Fig.4 Tandem mass spectrum of 4-methyl thiobutyl glucosinolate

图5 4-甲基硫代丁基硫苷结构解析Fig.5 Structure analysis of 4-methyl thiobutyl glucosinolate

2.2.3 4 -甲氧基-3-吲哚甲基硫苷结构解析结果

在高菜硫苷提取物中（保留时间10.126 min）发现m/z477.055 7离子碎片，与化合物4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷分子质量一致，其二级质谱图如图6所示，该化合物中有特征离子m/z235.052 0、195.031 6、96.058 9，结构解析如图7所示，碎片离子m/z235.052 0、195.031 6推测为4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷的硫与相邻碳原子发生断裂后形成，因此初步推测该化合物为4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷，目前未发现有文献报道4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷在芥菜中被检测到。

图6 4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷二级质谱图Fig.6 Tandem mass spectrum of 4-methoxy-3-indolemethyl glucosinolate

图7 4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷结构解析Fig.7 Structure analysis of 4-methoxy-3-indolemethyl glucosinolate

2.3 高菜硫苷提取物抑制HCT116细胞生长的效果

通过MTT结果分析，高菜硫苷提取物以剂量和时间依赖性方式显着降低了HCT116细胞的存活率（P＜0.05），如图8A、C、E所示，硫苷提取物作用HCT116细胞24、48 h和72 h后，其IC50分别为181.9、81.1、80.6 μg/μL。但相同剂量的硫苷提取物对CCD-18Co正常结肠细胞没有产生任何毒性，如图8B、D、F所示。结果表明高菜硫苷提取物对HCT116细胞显示出特异性抗增殖作用。

图8 高菜硫苷提取物对结肠癌细胞增殖的影响Fig.8 Effect of glucosinolates extracted from Brassica juncea var.integlifolia on the proliferation of colon cancer cells

2.4 高菜硫苷提取物对HCT116细胞周期和细胞凋亡的影响

根据2.3节的实验结果，硫苷提取物作用HCT116细胞24 h和48 h后，其IC50从181.9 μg/μL降低至81.1 μg/μL，变化显着，但硫苷提取物作用细胞48～72 h，其IC50变化极小，因此后续细胞周期、细胞凋亡、WB和qPCR实验中细胞培养时间均选择48 h。采用MTT法分析了不同浓度的高菜硫苷提取物对HCT116 细胞的抑制研究，结果显示高菜硫苷提取物作用细胞48 h，其IC50为81.1 μg/μL，因此，选择50、100、150 μg/μL质量浓度梯度的高菜硫苷提取物进行HCT116细胞周期和凋亡预实验，预实验结果表明，高菜硫苷提取物浓度为150 μg/μL时，对HCT116细胞周期和凋亡的影响最大，与对照组相比，各时期细胞数量和凋亡数量差异明显，因此，以下细胞实验选用高菜提取物质量浓度为150 μg/μL进行重点分析，以研究高菜硫苷提取物对HCT116结肠癌细胞的抗增殖、促凋亡作用及其机理。

2.4.1 高菜硫苷提取物对HCT116细胞周期阻滞的效果

高菜硫苷提取物（150 μg/μL）对HCT116细胞周期分析实验结果见图9A、B，经分析整理得到细胞周期定量分析结果如图9C所示，与对照组相比，高菜硫苷提取物处理的HCT116细胞，G0/G1期的细胞数量增加了7.26%，S期的细胞数量减少了20.83%，G2/M期的细胞数量增加了13.56%，可见，高菜硫苷提取物主要是通过阻滞HCT116细胞S期实现抑制细胞增殖的作用。

图9 高菜硫苷提取物对结肠癌HCT116细胞周期的影响Fig.9 Effect of glucosinolates extracted from Brassica juncea var.integlifolia on cell cycle of HCT116 cells

2.4.2 高菜硫苷提取物诱导HCT116细胞凋亡的效果

细胞凋亡会导致与细胞死亡相关联的生化和形态学特征变化[41]。流式细胞仪双染色法检测HCT116细胞凋亡情况如图10A、B所示，经过分析整理得到细胞凋亡定量分析结果如图10C所示。图10A、B中各个象限表示处于不同状态的细胞：左上象限Q1表示死亡的细胞，右上象限Q2表示晚期凋亡细胞，左下象限Q3表示正常细胞，右下象限Q4表示早期凋亡细胞。与对照组相比，高菜硫苷提取物（150 μg/μL）处理的HCT116细胞的凋亡比例增加了16.5%，早期凋亡细胞从8.7%增加到15.4%，晚期凋亡细胞从12.3%增加到28.3%，结果表明高菜硫苷提取物可以通过促进凋亡来抑制HCT116细胞的生长。

图10 高菜硫苷提取物对结肠癌HCT116 细胞凋亡的影响Fig.10 Effect of glucosinolates extracted from Brassica juncea var.integlifolia on apoptosis of HCT116 cells

2.5 高菜硫苷提取物对HCT116细胞周期和凋亡相关mRNA及蛋白的影响

图11 高菜硫苷提取物对结肠癌HCT116细胞周期和凋亡相关mRNA及蛋白的影响Fig.11 Effect of glucosinolates extracted from Brassica juncea var.integlifolia on mRNA and proteins related to cell cycle and apoptosis in HCT116 cells

细胞周期蛋白B、D1、E（Cyclin B、D1、E）在调节细胞周期（G1到S期）中起到重要作用[42]，半胱天冬酶（Caspase-3）在细胞凋亡中起着不可替代的作用，是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，Caspase-3激活伴随着裂解半胱天冬酶（Cleaved caspase-3）的产生，这常被看作细胞凋亡的一个重要指标[43]。细胞周期及凋亡基因调控细胞相应的蛋白行为，继而引起细胞周期阻滞甚至凋亡。如图11A所示，高菜硫苷提取物（150 μg/μL）处理细胞后，Cyclin B、D1、E的mRNA水平与对照组相比，分别降低了20%、50%、30%，细胞凋亡相关的Caspase-3和Cleaved caspase-3的mRNA水平与对照相比，分别增加到3 倍和1.2 倍。如图11B所示，高菜硫苷提取物（150 μg/μL）处理细胞后，Cyclin B、D1、E的蛋白水平分别降低了31%、23%、50%，与细胞凋亡相关的蛋白Caspase-3和Cleaved caspase-3相比分别增加到2.3 倍和1.9 倍。

3 结 论

本研究采用70%乙醇提取高菜中硫代葡萄糖苷类物质，采用酸性氧化铝柱层析纯化后，用紫外分光光度法检测，发现新鲜高菜中总硫苷含量为15.45 mg/g，属硫苷类物质含量较高的蔬菜；高菜总硫苷的提取率为1.545%，高菜硫苷提取物中总硫苷质量分数为73.7%，表明70%乙醇能有效提取高菜中的硫苷类物质。通过HPLCQ-TOF-MS技术处理，结合相关文献报道的硫苷物质分子结构，从高菜硫苷提取物中初步解析出2-丙烯基硫苷、4-甲基硫代丁基硫苷和4-甲氧基-3-吲哚甲基硫苷3 种主要的硫苷化合物，3 种硫苷化合物如与标准品进一步比对便可确认，其他硫苷物质的种类和结构需要通过其他方法进一步进行分析。采用流式细胞仪、蛋白质印迹法和qPCR检测发现高菜硫苷提取物对正常人结肠成肌纤维细胞CCD-18Co细胞没有毒性，但通过诱导HCT116细胞周期信号蛋白（Cyclin B、CyclinD1、CyclinE）的下调导致了S期细胞周期的停滞，而早期和晚期凋亡细胞的增加以及Caspase-3和Cleaved caspase-3基因和蛋白表达水平的同步上调，诱导了HCT116细胞的凋亡，从而抑制人结肠癌细胞株HCT116细胞增殖，可见，高菜硫苷提取物具有抗结肠癌的活性，但其具体的抗癌机制还需使用结肠癌小鼠等动物模型进行进一步评估。

综上所述，高菜属硫苷类物质含量较高的蔬菜，高菜硫苷提取物在一定质量浓度下具有显着抑制人结肠癌HCT116细胞增殖和促进HCT116细胞凋亡的作用，有望成为预防结肠癌发生的功能性食品原料。