辛 亮，张兰威*
（1.清华大学医学院 清华大学-北京大学生命科学联合中心，北京 100084；2.哈尔滨工业大学化工学院，黑龙江 哈尔滨 150001；3.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003）
食品病原微生物是威胁人类健康的重大问题。美国疾病控制中心数据显示，每年病原微生物污染的食品导致约4 800万 人患病，128 000 人住院，仅在美国每年就有3 000 人死亡[1-2]。引起食源性疾病爆发的主要病原微生物为Salmonellaspp.、Escherichia coliO157:H7、Listeria monocytogenes、Clostridium perfringens、Norovirus、Hepatitis A、Cryptosporidium、Cyclospora和Toxoplasma，这些病原微生物可以通过空气、水和土壤等传播，在食品加工、运输和贮存等阶段污染食品[3-5]。
传统的食品微生物检测采用平板培养结合生化鉴定的方法[6]。虽然该方法成本低廉，但是操作繁琐、耗时久，检测速度受到微生物在不同培养基中生长能力的限制，通常需要2～3 d进行初步鉴定，一周以上才能确认微生物种类[7]；由于存在不可培养微生物，传统检测方法会出现假阴性结果，增加了病原微生物的传播风险[8]。基于核酸检测方法的优势在于能够短时间内大量扩增样品中低水平目标微生物的核酸，这是研究人员将研究转向基于核酸检测方法的主要原因[9]。在过去的几十年里，核酸检测方法广泛发展，但由于食物成分复杂，往往需要样品前处理以及昂贵的设备和有经验的实验操作人员，现场和普通工业实验室无法达到检测要求[10]。近年来，微流控系统的出现为食品病原微生物的高效检测提供了强大技术基础。2006年，Whitesides定义了微流控技术，它是指利用微米级通道精确地操控微量流体[11]。微流控芯片体积小，试剂和样品消耗少，而且便于携带，可以实现现场检测[12]；微流控芯片的比表面积高，传质和传热速率快，可有效缩短检测时间；而且微流控芯片设计灵活，可将多个实验集成至单个微流控芯片，实现高通量检测，极大提高检测效率的同时，避免样品在检测过程中出现交叉污染[13]。
目前，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重组酶聚合酶扩增（recombinant polymerase amplification，RPA）、依赖核酸序列扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）和解旋酶依赖扩增（helicase dependent amplification，HDA）等方法均已结合微流控芯片应用于食品病原微生物的检测。微流控芯片与核酸扩增技术的结合为从复杂的食物基质中简便高效地检测病原微生物提供了新的可能。本文对近年来核酸扩增结合微流控芯片检测食品病原微生物的相关技术进展进行介绍。
1 PCR-微流控芯片检测食品病原微生物
PCR技术的发展在分子生物学上引起了一场革命，它使DNA分子的扩增可在短时间内跨越多个数量级[14]。PCR反应通常包括3 个步骤：变性、退火和延伸。在变性（≈95 ℃）步骤中，双链DNA变成两条单链，经退火（≈56 ℃）步骤降低温度，使引物与单链DNA模板结合；在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料进行延伸，合成一条与模板链互补的半保留复制链，如此循环获得大量目标基因；为保证聚合酶活性，延伸温度通常设置为72 ℃左右[15]。自1998年PCR技术首次与微流控芯片结合应用以来，越来越多的研究人员深入发展PCR-微流控芯片[16]。PCR-微流控芯片检测利用微流控器件热质量小和比表面积高的特点实现快速传热，从而缩短PCR扩增过程中稳定温度所需的时间。与传统PCR相比，PCR-微流控芯片可以获得更均匀的体系温度，有助于提高扩增产量，使检测更灵敏。
PCR-微流控芯片逐渐成为食源性致病菌检测的研究热点。Salman等建立了一种分流PCR方法，采用并联热循环器使微流控芯片的反应室在不同的温度区域之间移动，反应体系于期望温度处停留相应的反应时间，完成PCR过程。反应装置中的3 块加热板取代了价格昂贵且笨重的PCR仪[17]。该体系对于E.coli的检测限（limit of detection，LOD）低至0.7 ng/μL，且所用设备简单，检测成本低，具有极强的可应用性。
提高微生物DNA提取效率可有效提高PCR-微流控芯片的检测灵敏度。Zhang Huilin等设计同轴通道的DNA提取微流控芯片[18]。首先，将磁性玻璃珠泵入同轴通道，通过施加多环高梯度磁场使其在通道中均匀分布。然后将E.coliO157:H7裂解，释放胞内物质于同轴通道，磁性玻璃珠高效提取其中的DNA，提取量较之前的空心毛细管通道提高了4 倍左右，LOD低至12 CFU/mL，该方法具有检测较低水平E.coliO157:H7的能力[18]。
食品病原微生物的检测经常需要多个目标同时检测，不同引物之间的相互竞争和抑制影响液相PCR的检测效果。研究人员尝试将多对引物固定于支持物上，以类似于原位PCR的方式一次性对样品中的多个目的片段进行扩增，避免了引物种类过多带来的干扰，这种方法称为固相PCR（solid phase PCR，SP-PCR）[19]。Hung等基于超临界角荧光（super critical angle fluorescence，SAF）原理设计微透镜阵列微流控芯片，并将SP-PCR引物嵌入阵列中，实现了4 种目的基因同时检测，结果表明该方法特异性强，并且SAF设计可将LOD优化至1.6 拷贝数/μL，为微流控芯片检测提供了新的研究方向[20]。
PCR-微流控芯片的检测方法仍然存在一定问题，例如连续单向流动PCR体系容易被微流控芯片通道表面吸附，通道中心与接近表面区域的流速不同造成热循环中PCR反应体系的停留时间存在误差等。这些问题一定程度上限制了PCR-微流控芯片检测的应用[21]。
2 等温扩增-微流控芯片检测食品病原微生物
等温扩增技术的出现解决了PCR变温过程带来的弊端，其体系在等温条件下扩增效率良好，所需能量减少，仪器要求降低。将等温扩增技术与微流控芯片结合可以开发更简便高效的检测平台，使非专业技术人员能够在实验室外进行操作[22]。近十年，多种等温扩增方法已与微流控芯片结合应用于食品病原微生物的检测中。
2.1 LAMP-微流控芯片检测食品病原微生物
LAMP由Notomi等于2000年建立，是近年来应用最广泛的等温扩增技术[23]。LAMP的基本原理是设计2～3 套引物，60～65 ℃恒温条件下，利用BstDNA聚合酶的高链置换活性和复制活性介导DNA链的循环置换合成，30～60 min内即可得到目的基因的106～109拷贝数[24]。
离心式微流控芯片是微流控检测领域近年的创新热点。离心式微流控芯片呈光碟形状，上置多个反应单元。反应起始、试剂混合、储存和计量等均由圆盘的旋转控制。因其设计灵活、操作简单且通用性强得到广泛应用[25]。Nguyen等将LAMP与微流控芯片结合，建立了一种便携离心检测装置。首先，将样品加入芯片，然后利用离心力将储存于芯片试剂盒中的试剂释放至指定区域与样品混合，发生LAMP反应（图1[26]）。反应结束后，通过比色法对检测结果进行分析。该装置可在1 h内完成对E.coliO157:H7、Salmonella typhimurium和Vibrio parahaemolyticus的检测，LOD均为102个/mL[26]。另有研究将生物素-链霉亲和素试纸条与离心式LAMP-微流控芯片结合，用于判定检测终点，无需仪器或人工干预，进一步简化了检测流程。该系统用于乳中S.typhimurium和V.parahaemolyticus的多重检测，反应80 min的LOD可达50 CFU[27]。LAMP-微流控芯片通常需要其他设备辅助调控反应温度，存在一定误差，影响检测效率，芯片的精确测温和加热系统设计仍存在很大挑战。Lim等提出了一种基于离心式微流控芯片的自动回路LAMP检测系统，该系统利用热变色涂层远距离测量腔体内部温度，并在腔体内覆盖一层微石墨膜，超高速远程吸收激光束，实现无物理接触的温度测量和加热。实验结果表明，该方法能够有效地实现LAMP检测，灵敏度仍需进一步提高[28]。
近年来智能手机应用普遍，无线通信技术快速发展。智能手机中包埋若干感应器，例如摄像头和音频插口。智能手机和微流控芯片均具有易操作和便携带的特点，基于微流控芯片和智能手机传感器可以开发一系列应用程序，支持实验室外的食品病原微生物检测[29]。Sayad等设计离心式LAMP芯片，自动完成LAMP反应后，采用钙黄绿素比色法判定检测终点。紫外线发射器（365 nm）激发钙黄绿素，光学传感器识别发射光并导入电机，通过无线蓝牙电子系统将信号传输到智能手机，完成检测结果的输出。将该方法用于鸡肉中E.coli、Salmonellaspp.和Vibrio cholerae的检测，60 min的LOD为3×10-5ng/μL DNA[30]。智能手机与微流控芯片的结合提供了强大的实验操作平台，以移动方式实现远端的数据分析和管理。
离心力可以使离心式微流控芯片中的LAMP反应体系自动配置，滤纸的毛细效应也有相应功能。Pang Bo等设计了聚二甲硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）/纸芯片用于LAMP检测，该芯片由3 层组成，分别为中央进液层、反应层和支撑层，其中，浸有LAMP引物的滤纸片位于支持层和反应层之间（图2[31]）。当LAMP其余反应成分和样品注入芯片后，滤纸片将其吸入并与引物混合，开始LAMP反应，反应终点由羟基萘酚蓝和SYBR Green I染料判定。该芯片多重检测虾肉中Staphylococcus aureus和V.parahaemolyticus结果的LOD为103CFU/mL[31]。虽然此方法的LOD并不理想，但是装置的制作无需精密光刻且反应过程无需离心装置，具有应用于资源匮乏地区的潜力。
LAMP-微流控芯片检测所用试剂价格低、灵敏度高、特异性强，反应过程中无需热循环。而且LAMP对模板要求低于PCR，可以在复杂的生物基质中进行，因此，LAMP-微流控芯片具有现场快速检测的优势；LAMP-微流控芯片检测也存在一些问题，例如检测需要设计多对引物，较为复杂，对于未知序列的目标基因无法检测等[32]。
2.2 RPA-微流控芯片检测食品病原微生物
RPA是一种等温扩增方法，自2006年发表以来，引起了研究人员的重点关注。RPA反应的第一步是引物与E.coliRecA重组酶结合形成复合体，当复合体搜索到模板中存在的引物互补序列后，重组酶打开双链DNA，引物与同源序列发生链置换，形成D-loop复合物，单链核酸结合蛋白（single-stranded DNA-binding protein，SSB）随即与互补链结合，稳定引物。重组酶解离后，DNA聚合酶识别引物3’端并启动DNA扩增反应，新生成的DNA链可作为下一轮RPA的模板[33]。RPA操作温度为37～40 ℃，反应效率高，获得104拷贝数仅需10 min左右[34]。
Lutz等于2010年首次提出RPA-微流控芯片检测双链DNA的方法，并以mecA的PCR扩增产物分析了该方法检测S.aureus的可行性[35]。目前，已有研究将RPA检测食品病原微生物的全过程集成于单个微流控芯片。Kim等开发了一种用于食品中Salmonella enteritidis检测的离心式微流控芯片。首先，利用免疫磁珠对样品中的少量检测目标进行富集，然后激光二极管驱动阀门打开使样品进入反应室，再由激光调节温度开始反应。当反应结束后，通过离心力将样品送入稀释室，最后通过反应体系与横向流动试纸条反应表征检测结果。将该装置用于乳中S.enteritidis的检测仅需不到30 min，LOD为102CFU/mL[36]。Kunze等也建立了一种RPA-微流控芯片的集成检测方法，该方法中设计了微阵列芯片，结合化学发光法分析检测结果，应用于Enterococcus faecalis的检测，48 min的LOD为5×103基因组/μL[37]。
滑动芯片自2009年创建以来，以其操作简单、无需泵或阀门输送液体的特点备受关注。滑动芯片由顶板和底板组成，两块板放在一起并相对滑动使试剂在重叠部分进行交换并发生反应[38]。顶板和底板组合后共有6 个重复反应孔和2 个阴性对照孔，对照孔中一个无DNA，一个无乙酸镁；纵向侧视图中演示加载配置。用移液枪将DNA样本、RPA体系和乙酸镁分别装入样本孔中；侧视图显示了设备的尺寸和特征。Tsaloglou等将RPA与滑动芯片结合（图3[39]），以tacB为靶基因，实时检测Clostridium difficile的LOD为103DNA 拷贝数，用时不到20 min[39]。
图3 滑动芯片示意图[39]Fig.3 Schematic illustration of the slip chip[39]
RPA-微流控检测特异性强、灵敏度高，对样本纯度要求较低，无需DNA初始加热变性步骤。但是，RPA的引物长度通常大于30 bp，有一定合成难度且体系较难优化。
2.3 NASBA-微流控芯片检测食品病原微生物
NASBA由Compton于1991年发明，该技术是以RNA为模板的等温扩增技术[40]。NASBA体系中包括两条根据检测目标设计的引物、逆转录酶（reverse transcriptase，RT）、RNase H和T7 RNA聚合酶。NASBA反应过程中，第一条引物的5’端与T7 RNA聚合酶连接并与模板中的互补位置结合，引导RT合成RNA模板的互补DNA链；然后，RNase H破坏RNA模板，第二条引物结合在（反义）DNA链的5’端，RT再次延伸引物合成另一条DNA链，产生双链DNA。T7 RNA聚合酶以DNA链为模板合成互补的RNA拷贝，每个新合成的RNA都是下一个循环阶段的模板，RNA指数扩增。NASBA于41 ℃反应1.5 h可以产生约1010的目标RNA[41]。
NASBA可将mRNA、rRNA、tmRNA、SSDNA和病毒的核酸作为检测目标。其中，由ssrA编码的tmRNA较为稳定，接近DNA的鲁棒性，是很好的检测目标。Dimov等将tmRNA纯化和NASBA检测集成于单个微流控芯片，用于E.coli的实时检测，结果表明102CFU/μL的E.coli检测用时为30 min[42]。为提高NASBA的检测效率，Zhao Xinyan等致力于改良检测过程中RNA的提取方法，先后设计免疫提取RNA和膜富集RNA的NASBA微流控芯片，其中，后者的检测效果较好[43-44]。膜富集RNA-NASBA应用于水中Saccharomyces cerevisiae、S.aureus和E.coli检测的LOD均为64 CFU/L。而且该芯片设计依照96 孔板的尺寸，荧光强度判定检测结果可使用酶标仪完成，实现检测结果实时输出。Chung等也对芯片中RNA的提取方法进行了改良，并将其应用于牡蛎中Norovirus的检测，实验首先将污染的牡蛎进行研磨，取上清液注入芯片，然后利用电物理法将病毒吸附在微球上并进一步打浆溶解。随后将提取的RNA转移到检测室，进行NASBA扩增。经体系优化后，牡蛎中Norovirus的LOD为102PFU/个[45]。
NASBA-微流控芯片的检测目标为RNA，因此样品中的死细胞对检测结果无干扰，检测结果更准确，而且检测灵敏度高、特异性强、成本低。但是，当样品中大部分为双链DNA时，NASBA需要95 ℃辅助初始变性；当样品中大部分为RNA时，需要温和的热处理（65 ℃）去除二级结构。因此，NASBA并非完全等温扩增，对微流控芯片的设计和使用提出了更高要求。
2.4 HDA-微流控芯片检测食品病原微生物
HDA是由Vincent等在2004年首次报道的一种恒温扩增技术，该技术中DNA解旋酶在ATP驱动下打开DNA双链，SSB结合单链DNA防止降解，同时，一对与DNA模板互补的特异性引物退火结合到模板的3’端，此时，无核酸外切酶活性的大片段DNA聚合酶沿着引物延伸合成新的双链DNA。新合成的双链DNA作为模板在DNA解旋酶的作用下进入下一轮扩增反应，使DNA呈指数扩增[46]。
经过近些年的发展，HDA检测的全过程已经可以整合至单一芯片。Mahalanabis等通过瓣阀和疏水性排气孔驱动芯片中的液体流动，在单一芯片上完成HDA检测的全过程，极大地减少了繁琐操作。将该芯片用于E.coli检测的LOD可达10 CFU，用时50 min[47]。另有研究人员利用二氧化硅超顺磁粒子进行DNA的固相提取和反应体系的驱动，实现HDA-微流控芯片检测分析一体化。该方法以E.coli为模式生物，验证了其可行性[48]。常见的微流控芯片以玻璃、硅和PDMS作为基质，虽然实现了装置小型化，但仍存在成本相对较高的问题。纸可以作为降低成本的一种选择。尽管纸基芯片缺乏高分辨率和高灵敏度，但对于工业化程度较低的国家，尤其是对需要持续测试的情况，纸基芯片成为非常有吸引力的替代装置[49]。Tang Ruihua等将核酸提取、HDA检测和横向流动试纸条分析整合在纸芯片中，对废水、果汁、牛奶和鸡蛋中的S.typhimurium进行检测，结果表明，检测特异性高、灵敏度强，废水和鸡蛋中的LOD均为102CFU/mL，牛奶和果汁中的LOD为103CFU/mL，检测用时为1 h左右[50]。
HDA-微流控检测的引物设计简单、灵敏度高、特异性强，对样品纯度要求较低，但是HDA体系中所需酶试剂的价格较为昂贵，是该技术应用过程中的限制因素。
3 结 语
虽然目前以核酸为基础的食品病原微生物检测方法已经成熟，但是操作过程依赖于大型设备和熟练操作人员，导致测试耗时长、成本昂贵，且不便于现场应用。核酸-微流控将检测全过程集中在一块芯片中，实现了自动化，并具有微型化带来的便携性和低成本的优势，结合灵活的设计可以进一步实现高通量检测，具有取代传统检测的潜力。但将核酸-微流控芯片实际应用于食品病原微生物检测仍然存在一些挑战，例如食品的基质比较复杂，需要前处理；检测中所有关键步骤需高效集成在单个微流控芯片；微流控芯片中的反应体系体积小，对传感器的灵敏度和稳定性要求更高。目前，许多策略如重力、电、磁、声学、亲和化学和流体力学等已经用于解决核酸-微流控芯片检测食品病原微生物过程中存在的问题，这一领域的研究仍处于起步阶段，需要付出更多努力来促进食品病原微生物检测的发展。
