噬菌体vB_SauM_RS对乳源金黄色葡萄球菌生物被膜的清除作用

阮红日，王宇辉，徐若洋，陈 立，靳育琦，王建发，宋 军,*，郑家三,*

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江省牛病防制重点实验室，黑龙江 大庆 163319）

食品安全是关系到人类健康与国家发展的重大问题，而食源性致病菌污染是食品安全的首要问题。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作为重要的食源性致病菌，无论在发达国家还是在发展中国家，因其引起的食物中毒在细菌性食物中毒中均占有较大比例[1-2]。索玉娟等[3]对食品中毒污染源进行监测和追踪发现，生鲜肉、乳制品、速冻食品等受金黄色葡萄球菌污染严重。因此，有效防控金黄色葡萄球菌污染对于食品行业的发展至关重要。

噬菌体是一类细菌病毒，具有严格的宿主特异性，可在宿主菌内复制并破坏宿主菌，对动植物和人体无害[4]。近年来，噬菌体作为一种天然的抗菌剂备受关注，在食品安全领域的应用也越来越多，如利用噬菌体清除奶酪中的金黄色葡萄球菌[5]；利用噬菌体鸡尾酒降低牛奶、鸡胸肉和白菜中沙门氏菌（Salmonella）浓度[6]；利用噬菌体抑制生鱼片组织表面单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的生长，防止生鱼片腐败[7]；利用噬菌体鸡尾酒降低蔬菜和牛肉中大肠杆菌（Escherichia coli）浓度，延长贮存时间等[8]。目前，美国食品药品监督管理局已经批准了几种用于食品上市前预防细菌污染的噬菌体制剂[9-10]。由此可见，噬菌体在作为食品生物抗菌剂方面具有巨大的发展潜力[11-12]。

本实验以金黄色葡萄球菌ATCC 43300为宿主菌，分离裂解性噬菌体，研究其生物学特性，检测该噬菌体对细菌及生物被膜的清除效果，并评估噬菌体在巴氏灭菌的脱脂牛奶和全脂牛奶中抑菌潜力，旨在探讨噬菌体作为乳制品生产、加工过程中生物抗菌剂的潜在应用价值。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

金黄色葡萄球菌ATCC 43300由吉林大学顾敬敏教授馈赠；金黄色葡萄球菌Sau254分离自鲜牛乳，经鉴定为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；污水样品采自黑龙江省某养牛场。

SM缓冲液、磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS） 生工生物工程（上海）股份有限公司；Luria-Bertani（LB）培养液、琼脂 青岛海博生物技术有限公司；24 孔细胞爬片、结晶紫、二苯甲亚胺、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙二醇辛基苯基醚和3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸 北京索莱宝科技有限公司；96 孔细胞培养板、24 孔细胞培养板无锡耐思生物科技有限公司；巴氏灭菌牛奶、304型不锈钢片为市售。

1.2 仪器与设备

DRP-9082电热恒温培养箱 上海森信实验仪器有限公司；5810R高速冷冻离心机 德国艾本德股份公司；T6分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Ti2荧光显微镜 日本尼康公司；JEM-2100 Plus透射电子显微镜 日本电子株式会社。

1.3 方法

1.3.1 噬菌体分离纯化及形态观察

采集养牛场污水500 mL，参照Jamalludeen等[13]的方法分离噬菌体。污水用滤纸过滤后，5 000×g离心15 min，除去污水中杂质，使用0.45 μm的半透膜对水样进行浓缩，最后用0.22 μm滤膜过滤除菌。将100 mL 2×LB培养液和1 mL培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌ATCC 43300菌液加入处理后的污水中，37 ℃振荡培养过夜，次日采用双层平板法对分离到的噬菌体进行纯化。将纯化后的噬菌体用SM缓冲液10 倍连续稀释，每个稀释度取100 μL稀释液加入100 μL宿主菌中制成双层平板，按下式[14]计算噬菌体效价。

式中：噬菌斑数为3 组重复实验的每个平板上噬菌斑数量的平均数/PFU；稀释倍数为经过10 倍连续稀释后最终的稀释倍数；0.1为最初取液量（100 μL）。

采用磷钨酸负染色法观察噬菌体形态，将20 μL噬菌体悬液（106PFU/mL）滴于铜网，吸附15 min后取出铜网，自然干燥2～3 min，用体积分数2%磷钨酸水溶液染色，2 min后吸干水分，自然干燥10 min，透射电子显微镜观察噬菌体形态。

1.3.2 噬菌体的生物学特性分析

1.3.2.1 最佳感染复数的测定

最佳感染复数（multiplicity of infection，MOI）参照Lu等[15]的测定方法，略有改动。按照不同感染比例（1∶1 000、1∶100、1∶10、1∶1、10∶1、100∶1）（噬菌体数∶细菌数）将噬菌体和对数生长期的宿主菌混合，37 ℃振荡培养（160 r/min），3.5 h后测定上清液中噬菌体效价，效价最高的比例即为MOI。

1.3.2.2 一步生长曲线的绘制

一步生长曲线可以反映噬菌体从吸附宿主菌到释放子代噬菌体的完整增殖周期[16]。将噬菌体和对数生长期的宿主菌以MOI＝1∶100混合，37 ℃静置培养15 min后12 000×g离心，弃上清液，使用50 mL预热的LB培养液重悬细菌细胞沉淀，迅速置于37 ℃摇床中振荡培养（160 r/min）。分别于不同时间测定培养液中噬菌体效价。以取样时间为横坐标，噬菌体效价为纵坐标，绘制一步生长曲线。

1.3.2.3 pH值稳定性实验

取1 mL效价约为108PFU/mL的噬菌体于试管中，分别加入1 mL pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的SM缓冲液，室温作用1 h，稀释适当倍数并通过双层平板法测定噬菌体效价。

1.3.2.4 热稳定性实验

取1 mL效价约为108PFU/mL的噬菌体于试管中，分别在20、30、40、50、60、70 ℃水浴作用1 h，稀释适当倍数并通过双层平板法测定噬菌体效价。

1.3.3 噬菌体对乳源金黄色葡萄球菌的清除作用

1.3.3.1 噬菌体对金黄色葡萄球菌Sau254的裂解作用

将Sau254菌株培养至对数生长期，PBS洗涤去除培养基，并调整细菌浓度为1010PFU/mL，加入1 mL效价约为107PFU/mL的噬菌体于37 ℃静置培养，分别于0、1、2、4、6、8、12、24 h测定培养液中细菌浓度以及噬菌体效价。

1.3.3.2 噬菌体对生物被膜的清除效果

参照Torlak等[17]的方法，在96 孔板上培养成熟的金黄色葡萄球菌生物被膜，用PBS洗涤3 次去除浮游菌和培养基，之后加入200 μL效价约为107PFU/mL的噬菌体溶液，分别于0、4、8、12、24、48 h通过稀释平板涂布法测定生物被膜内细菌数量，并通过结晶紫染色法确定噬菌体对细菌生物被膜清除效果。将噬菌体处理后的生物被膜样品用PBS缓慢清洗3 次，去除浮游细菌和培养基，之后每孔加入200 μL体积分数95%的甲醇溶液，室温固定30 min，再用PBS冲洗3 次，自然晾干后每孔加入0.1%的结晶紫溶液染色30 min，流水冲洗每孔2～3 次，最后每孔加入200 μL体积分数30%冰乙酸作用15 min，使用分光光度计测定OD600nm，记录数据。

1.3.3.3 荧光显微镜观察

按1.3.3.2节的方法，在24 孔细胞爬片上培养成熟的细菌生物被膜，加入2 mL效价约为107PFU/mL的噬菌体溶液，分别处理0、24、48 h，PBS洗涤3 次去除游离细菌，之后使用二苯甲亚胺染色3～5 min，封片后置于荧光显微镜下观察膜内细菌密度，以0 h未经噬菌体处理的生物被膜作为对照组，分析噬菌体对生物被膜的清除效果。

1.3.4 噬菌体在牛奶中的抑菌应用

将Sau254菌株培养至对数生长期，PBS洗涤去除培养基，分别使用脱脂牛奶和全脂牛奶将细菌终浓度稀释为1×104CFU/mL，设立实验组和对照组。实验组加入1 mL效价约为107PFU/mL的噬菌体，对照组加入等体积的PBS，分别置于4 ℃和25 ℃中静置培养，分别于0、4、8、12、24 h测定脱脂和全脂牛奶中细菌浓度以及噬菌体效价。

1.3.5 噬菌体对不锈钢材料上生物被膜的清除作用

参照邓旗等[18]的方法，略有改动。将不锈钢片用NaOH和丙酮处理后，移入培养液中，按1.3.3.2节的方法培养生物被膜。之后加入2 mL效价约为107PFU/mL的噬菌体溶液，分别于0、4、8、12、24、48、72 h测定生物被膜内细菌数量和上清液中噬菌体效价。

1.3.6 常用洗涤剂对噬菌体活性的影响

取效价约为108PFU/mL的噬菌体分别与SM缓冲液、阴离子洗涤剂（1%（质量分数，下同）十二烷基硫酸钠）、阳离子洗涤剂（1%十六烷基三甲基溴化铵）、非离子洗涤剂（1%聚乙二醇辛基苯基醚）和两性离子洗涤剂（1% 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸）等体积混合，37 ℃作用30 min，通过双层平板法测定各组洗涤剂中噬菌体效价，以SM缓冲液作为对照组，评价各种洗涤剂对噬菌体活性的影响。

1.4 数据处理与分析

实验结果以平均值±标准偏差表示，数据采用GraphPad Prism 8统计学软件进行分析。两组间比较采用studentt检验，以P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 噬菌体的形态观察结果

从养牛场采集的污水中分离出一株噬菌体，其噬菌斑呈现出典型裂解性噬菌体特征（图1），透亮且有晕环，直径为1.5～2.0 mm，双层平板法测定噬菌体效价为1×108PFU/mL。

图1 噬菌斑形态Fig.1 Morphology of plaques

2.2 噬菌体透射电子显微镜观察结果

图2 噬菌体透射电子显微镜图（30 000×）Fig.2 TEM of phages (30 000 ×)

如图2所示，噬菌体头部呈正多面体，头部直径（83.0±0.5）nm，尾部长度（140±1）nm，其尾部可收缩，按国际病毒分类委员会分类规则，符合肌尾噬菌体科特征，因此命名为vB_SauM_RS。

2.3 噬菌体最佳感染复数和一步生长曲线分析结果

当MOI＝1∶100时噬菌体产出量最高（图3A），因此，按1∶100的比例绘制一步生长曲线。由图3B可知，噬菌体vB_SauM_RS在感染宿主细菌后的20 min内效价几乎保持不变，表明该噬菌体潜伏期约为20 min，在感染宿主细菌后20～50 min，噬菌体效价急剧增加，可知vB_SauM_RS爆发期约为30 min，噬菌体的平均裂解量为39 PFU/cell（裂解量＝爆发末期噬菌体效价/感染初期宿主菌浓度）。

图3 噬菌体vB_SauM_RS MOI（A）和一步生长曲线（B）Fig.3 MOI (A) and one-step growth curve (B) of phage vB_SauM_RS

2.4 噬菌体pH值稳定性

图4 噬菌体vB_SauM_RS pH值稳定性Fig.4 pH sensitivity of phage vB_SauM_RS

由图4可知，vB_SauM_RS在pH 4.0～11.0时效价与初始效价（约108PFU/mL）无明显差异，且具有良好的裂解活性，说明该噬菌体对酸碱的耐受力较强；当pH值低于4.0或者高于11.0时噬菌体基本失活，说明vB_SauM_RS的稳定pH值范围为pH 4.0～11.0。

2.5 噬菌体热稳定性

图5 噬菌体vB_SauM_RS热稳定性Fig.5 Thermal stability of phage vB_SauM_RS

由图5可知，vB_SauM_RS在20～50 ℃内活性保持稳定，60 ℃时噬菌体效价降低至初始效价的50%以下，在高温（70 ℃）时全部失活。因此，vB_SauM_RS对高温耐受性较差，适合在50 ℃及以下温度生存。

2.6 噬菌体对金黄色葡萄球菌Sau254的裂解作用

图6 噬菌体vB_SauM_RS对金黄色葡萄球菌的裂解作用Fig.6 Lytic effect of phage vB_SauM_RS on S.aureus

由图6可知，vB_SauM_RS作用24 h后，细菌浓度由1×1010CFU/mL降至0 CFU/mL，而vB_SauM_RS效价从105PFU/mL增至108PFU/mL。Sau254浓度随vB_SauM_RS作用时间延长不断降低，vB_SauM_RS效价不断增加，表明vB_SauM_RS能够持续有效抑制和清除细菌。噬菌体效价在8 h升至108PFU/mL后趋于稳定，表明vB_SauM_RS增殖具有自我限制。

2.7 噬菌体对生物被膜的清除效果

图7 噬菌体vB_SauM_RS对生物被膜的清除效果Fig.7 Removal effect of phage vB_SauM_RS on biofilm

由图7 可知，成熟的生物被膜内细菌浓度为5.28（lg（CFU/mL）），随着vB_SauM_RS处理时间的延长被膜内细菌浓度不断减少，作用4 h后细菌浓度下降至4.97（lg（CFU/mL）），作用12 h被膜内细菌浓度下降至4.48（lg（CFU/mL）），作用48 h后细菌浓度下降至3.94（lg（CFU/mL））（生物被膜内细菌浓度降低了95.6%），表明vB_SauM_RS对生物被膜有良好的清除效果；结晶紫染色结果显示，噬菌体处理48 h后，OD600nm由0.83降至0.36，同样表明vB_SauM_RS对生物被膜具有良好的清除效果。

2.8 荧光显微镜观察结果

由图8可知，Sau254菌株可在细胞爬片上形成致密的生物被膜结构。与对照组相比，vB_SauM_RS处理24 h和48 h后细菌呈分散分布，少有聚集的现象，且被膜内细菌密度明显减小，表明vB_SauM_RS可以破坏生物被膜结构并且对膜内细菌有较强的清除能力。

图8 荧光显微镜观察生物被膜Fig.8 Observation of biofilm by fluorescence microscope

2.9 噬菌体在牛奶中的抑菌作用结果

由图9A可知，在4 ℃条件下，脱脂牛奶中加入vB_SauM_RS作用4 h时，噬菌体与细菌的浓度均升高，但在8 h时实验组与对照组Sau254浓度出现不同的变化。当作用24 h时，实验组Sau254浓度较对照组下降了1.079（lg（CFU/mL））；由图9B可知，在4 ℃条件下，全脂牛奶中加入vB_SauM_RS前12 h实验组和对照组Sau254浓度均升高，没有出现明显的差异，但在作用24 h时，实验组Sau254浓度较对照组下降了1.021（lg（CFU/mL））；在25 ℃条件下，于脱脂牛奶和全脂牛奶中分别加入vB_SauM_RS作用24 h后，实验组Sau254浓度较对照组分别下降了5.418（lg（CFU/mL））（图9C）和5.740（lg（CFU/mL））（图9D）。结果表明，vB_SauM_RS在脱脂和全脂牛奶中对Sau254均具有良好的抑制作用，并且对低温保存牛奶中Sau254同样具有抑制作用。实验组中vB_SauM_RS效价从初始5×106PFU/mL升至108PFU/mL，表明vB_SauM_RS能利用宿主菌进行自我增殖，不断扩大优势，最终抑制细菌生长。并且噬菌体效价会维持在较高的水平，产生持续的抑菌作用。

图9 噬菌体vB_SauM_RS在牛奶中的抑菌作用Fig.9 Bacteriostatic effect of phage vB_SauM_RS in milk

2.10 噬菌体对不锈钢板材料上生物被膜的清除作用

图10 噬菌体vB_SauM_RS对不锈钢片表面生物被膜的清除作用Fig.10 Removal effect of phage vB_SauM_RS on biofilms formed on stainless steel sheet

由图10可知，vB_SauM_RS对不锈钢上生物被膜的清除效果明显，作用72 h后Sau254浓度由初始6.8×104CFU/mL降至3.5×102CFU/mL，被膜内细菌数量降低了99.5%，具有明显的清除效果。噬菌体效价由107PFU/mL升至108PFU/mL，结果表明其能够对生物被膜保持持续的清除作用。

2.11 常用洗涤剂对噬菌体活性的影响

图11 常用洗涤剂对噬菌体vB_SauM_RS活性的影响Fig.11 Effect of common cleaning agents on the activity of phage vB_SauM_RS

由图11可知，非离子洗涤剂聚乙二醇辛基苯基醚和两性离子洗涤剂3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸对vB_SauM_RS活性并无显着影响，而阳离子洗涤剂十六烷基三甲基溴化铵能够使vB_SauM_RS效价下降2.1（lg（PFU/mL）），阴离子洗涤剂十二烷基硫酸钠中的vB_SauM_RS完全失去活性。表明噬菌体vB_SauM_RS对阴离子洗涤剂和阳离子洗涤剂敏感，应避免与它们同时使用；而非离子洗涤剂和两性离子洗涤剂对vB_SauM_RS裂解活性无明显影响，可联合应用。

3 讨 论

与传统的抗菌剂相比，噬菌体作为一种天然的抗菌剂具有先天优势，在自然界广泛分布、对正常菌群无影响、有长期使用史[4]。目前许多研究机构致力于噬菌体制剂的研发，以期减少细菌污染问题[19]。牛奶和乳制品在贮存、运输和加工过程中极易被细菌污染，严重影响牛乳品质，其中金黄色葡萄球菌污染较为常见[20]。因此，研究噬菌体对牛奶中金黄色葡萄球菌的防控和对乳制品行业的发展具有重要的意义。

本实验分离的噬菌体vB_SauM_RS属于有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科。该噬菌体潜伏期20 min，在50 ℃以下、pH 4.0～11.0范围内活性稳定，具有良好的环境耐受能力。vB_SauM_RS在适宜条件下24 h可完全清除浓度为1×1010CFU/mL的金黄色葡萄球菌，具有高效的裂解效率。良好的环境耐受能力和高效的裂解效率是vB_SauM_RS作为生物抗菌剂的应用基础。噬菌体vB_SauM_RS在牛奶中的抑菌实验结果表明，在4 ℃和25 ℃条件下，其均可明显降低牛奶中细菌浓度，这与蔡天舒等[21]的研究结果相同，但在低温条件下抑菌效果相对较弱，可能是由于低温影响了噬菌体的吸附能力，也可能是低温抑制了微生物的生长从而限制噬菌体的增殖[22]。Gill等[23]认为牛奶中的脂肪颗粒和乳清蛋白等对噬菌体抑菌作用存在影响，与本实验结果不同，可能是因为巴氏灭菌法改变了牛奶中部分物质的活性。

在实际生产中，细菌为适应外界环境多以生物被膜的形式附着于物体表面，难以清除。有研究表明，噬菌体可以有效防控常见食源性细菌，但仅限于对浮游细菌有防控作用[24-26]。而在牛奶贮存、运输和加工过程中很难一直保持无菌状态，极易在设备的接触表面形成生物被膜，从而导致持续性污染，严重影响牛奶品质[27-28]。普通的消毒杀菌措施很难清除成熟细菌生物被膜，甚至可能使细菌产生抗药性，目前已有研究证实噬菌体可以有效清除或抑制细菌生物被膜[29-30]。本实验不同材料表面生物被膜的清除效果结果表明，vB_SauM_RS对聚苯乙烯、玻璃、不锈钢表面生物被膜均具有良好的清除效果，可明显降低膜内细菌数量。实验中细菌生物被膜虽然没有被完全清除，但vB_SauM_RS可以破坏生物被膜的完整性，使其更容易被清除，并且噬菌体效价最终维持在108PFU/mL，能够持续抑制生物被膜形成。因此，应用vB_SauM_RS预防和控制乳制品生产加工过程中细菌生物被膜是切实可行的[31]。此外，噬菌体应用于实际生产时不可避免地会与洗涤剂发生接触，本实验研究发现，阴离子洗涤剂十二烷基硫酸钠和阳离子洗涤剂十六烷基三甲基溴化铵可显着降低噬菌体活性，应用时应避免与此类洗涤剂共同使用。

综上，本实验所分离的噬菌体vB_SauM_RS具有作为生物抗菌剂的潜力，不仅对牛奶中金黄色葡萄球菌有良好的裂解效果，对生物被膜也有很好的清除作用，但在应用时应避免与阴离子或阳离子洗涤剂共同使用。