吴佳南，孙 娜,2，林松毅,2，吴汶飞,2,*
（1.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034；2.国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁 大连 116034）
硒是人体必需的微量元素之一[1]，具有抗氧化、保护生物膜和提高机体免疫力的作用[2]。缺硒会导致许多疾病，如克山病等[3]。与无机硒相比，有机硒能主动穿过肠壁，人体可以有效地把硒贮存、积累在靶组织内，供机体利用[4]。因此开发生物活性高的有机硒非常必要[5]。
新西兰长尾鳕是新西兰主要的经济鱼类，年产量20万 t[6]，广泛作为水产品加工的原料。新西兰长尾鳕平均大小为60～100 cm，质量为1～3.5 kg[7]。近年来，鱼肉加工业在美国、欧洲、日本、澳大利亚和中国发展迅速，由此也产生了副产物难以处理的问题，如鳕鱼皮常被丢弃，不仅造成资源的浪费，而且污染环境[6]。鳕鱼皮干物质中明胶占70%以上，是生产明胶的良好来源。与其他冷水鱼类相比，新西兰长尾鳕鱼皮明胶具有较好的理化性能[8]。当前，国内外以明胶为原料制备钙、铁、锌螯合肽的研究较多[9-12]，而有关明胶硒螯合肽的研究鲜有报道。目前，已有研究以无机硒为硒源，通过多肽螯合的方式制备出有机硒[13-15]。因此，以新西兰鳕鱼皮为原料，提取明胶，制备并表征肽硒复合物，具有重要的现实意义，其既能满足人体对硒元素的需要，又能达到补充胶原蛋白的作用。
本研究以鳕鱼皮为原料提取明胶后，经不同种类的酶进行酶解制备多肽，与硒离子结合制备出鳕鱼皮明胶肽硒复合物，采用红外、紫外、荧光、拉曼光谱和圆二色谱对肽硒结合前后的结构进行比较，推测肽硒复合位点，运用激光粒径仪、原子力显微镜、扫描电子显微镜和X射线衍射观察二者形貌特征和结构的差异。旨在为鳕鱼皮资源高值化利用提供新的思路，为肽硒复合物的产业化提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新西兰长尾鳕鱼皮 青岛益和兴食品有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 美国Sigma公司；风味蛋白酶丹麦诺维信公司；3,3’-二氨基联苯胺、盐酸、氢氧化钠、亚硒酸钠、乙二胺四乙酸二钠盐等试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
XRD-7000 X射线衍射仪 日本Shimadzu公司；F-2700荧光分光光度计、LA8080氨基酸自动分析仪、AFM550原子力显微镜 日本Hitachi公司；Spectrum 10傅里叶变换红外光谱仪 珀金埃尔默公司；JSM-7800F扫描电子显微镜 日本电子株式会社；J-1500圆二色光谱仪 日本Jasco公司。
1.3 方法
1.3.1 鳕鱼皮明胶的制备
参照Hou Hu等[16]的方法将鳕鱼皮剪成1 cmh 1 cm小片冲洗干净，室温下在0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡并搅拌0.5 h，料液比为1∶6（g/mL），将非胶原蛋白成分除去后，用蒸馏水洗至中性，室温下用0.1 mol/L HCl溶液浸泡并搅拌0.5 h，料液比为1∶6（g/mL），得到溶胀的鱼皮，洗至中性。把鱼皮和蒸馏水混合（1∶10，g/mL），65 ℃提取4 h，8 000hg、4 ℃离心20 min，收集上清液，冻干得到鳕鱼皮明胶。
1.3.2 氨基酸组成分析
参照Sun Na等[17]方法测定氨基酸组成。20 mg明胶在110 ℃、6 mol/L HCl溶液和真空安瓿瓶中水解24 h，蒸发皿蒸干后，用0.02 mol/L HCl溶液定容至25 mL，过0.22 μm滤膜。用氨基酸自动分析仪进行分析。
1.3.3 羟脯氨酸含量的测定
按照Liu Yang等[18]的方法进行测定。称取干基样品0.02 g于安醅瓶中，加入6 mol/L的HCl溶液3 mL，酒精喷灯密封，于烘箱130 ℃放置4 h进行水解。冷却后倒入烧杯中，滴1 滴甲基红试剂，用2 mol/L NaOH溶液调pH值至6.0，定容至25 mL。取1 mL上述溶液，加入1 mL柠檬酸缓冲液和1 mL氯铵T，涡旋振荡，室温反应10 min。加入1 mL 3.5 mol/L的高氯酸溶液，涡旋振荡，室温反应10 min，加入1 mL发色剂（4 g对二甲基氨基苯甲醛、14 mL 6%高氯酸、26 mL异丙醇），振荡，65 ℃水浴中显色反应20 min。冷却30 min，560 nm波长处测量吸光度。以羟脯氨酸作为标准品，绘制标准曲线进行定量分析。
1.3.4 鳕鱼皮明胶的酶解工艺
参照Wu Wenfei等[11]的方法，将明胶分别采用胰蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶3 种酶在各自最适酶解温度和pH值条件下水解鳕鱼皮明胶120 min，酶解条件：胃蛋白酶（37 ℃，pH 2.0）、胰蛋白酶（37 ℃，pH 7.5）、风味蛋白酶（5 0 ℃，p H 7.0），明胶质量浓度为20 mg/mL，加酶量4%。酶解结束后，水解液在沸水浴中灭酶10 min，冷却至室温，10 000hg离心20 min，收集上清液，冻干。
1.3.5 鳕鱼皮明胶肽硒复合物的制备
参照包怡红等[13]的方法，将0.5 mol/L的亚硒酸钠溶液和鳕鱼皮明胶多肽溶液以体积比1∶2充分混匀，调节pH值至9.0，在80 ℃水浴中反应1 h后冷却，4 000hg、10 min离心取上清液，加入5 倍体积的95%乙醇溶液，静置沉淀12 h，4 000hg、10 min离心取沉淀，无水乙醇洗涤数次后冻干，得到硒复合物粉末。
1.3.6 硒含量的测定
采用3,3’-二氨基联苯胺比色法[19]测定硒含量。
样品处理：称取试样0.1 g，加入5 mL消化液，低温消化至样液呈无色透明。冷却后，转入烧杯，用10 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0，最后定容到50 mL，待测。
标准曲线的测定：分别取5 μg/mL的硒标准溶液0、2、4、6、8、10 mL，置于125 mL分液漏斗中，用水稀释成40 mL，调pH值至2.0，加入EDTA-Na2溶液2 mL，加入3,3’-二氨基联苯胺溶液2 mL，摇匀。于暗处反应50 min，取出，调pH值至7.0，加入10 mL甲苯，振摇2 min，静置分层，在420 nm波长处测定甲苯层吸光度。
样品中硒含量的测定：吸取消化处理好的样品20 mL，置于分液漏斗中，按照标准曲线进行操作。根据样品测得的吸光度，按式（1）计算硒含量：
式中：ρ为从标准曲线中查得相当于硒的标准质量浓度（μg/mL）；V为甲苯萃取所得的样品体积/mL；M为样品质量/g；N为用于测定的样品占总定容后样品的体积分数/%。
1.3.7 鳕鱼皮明胶肽硒复合物结构表征
1.3.7.1 紫外-可见光谱分析
将鳕鱼皮明胶肽与肽硒复合物粉末样品溶于超纯水中，配成1 mg/mL溶液，用紫外-可见分光光度计在200～800 nm波长范围内进行紫外吸收光谱扫描[20]。
1.3.7.2 荧光光谱分析
将鳕鱼皮明胶肽与肽硒复合物冻干粉溶于超纯水中，配制成10 mg/mL溶液，采用荧光光谱仪测定，激发波长为280 nm，发射波长为290～520 nm波长范围内荧光值的变化[21]。
1.3.7.3 粒径分布
采用激光粒度仪测定鳕鱼皮明胶肽及肽硒复合物的平均粒径。用纯净水清洗样品池直至背景清晰。将处理好的待测样品缓慢加入样液池中，测试温度为25 ℃，每个样品扫描3 次，取平均值[22]。
1.3.7.4 原子力显微镜分析
用原子力显微镜观察鳕鱼皮明胶肽及肽硒复合物的表面形态。将10 μL样品置于新鲜剥离的云母上，室温下干燥。原子力显微镜在轻敲模式下工作，扫描驱动频率为340 kHz[23]。
1.3.7.5 扫描电子显微镜分析
将适量的多肽粉末与肽硒复合物的冻干粉末样品分别均匀涂抹于样品盘，喷金镀膜处理，施加电压聚焦清晰后，放大5 000 倍和30 000 倍获取图像[24]。
1.3.7.6 X射线衍射分析
取一定量的样品放在样品槽中，在加速电压40 kV、加速电流40 mA、扫描范围（2θ）10°～70°、扫描速度0.02°/0.2 s的条件下对样品进行扫描，利用X射线衍射图谱分析其结构[25]。
1.3.7.7 红外光谱分析
将鳕鱼皮明胶肽及肽硒复合物冻干粉各2 mg混入200 mg干燥的KBr粉末，于玛瑙研钵中研磨均匀，压片，后进行红外光谱扫描，扫描范围4 000～400 cm－1。扫描图谱通过软件进行分析[26]。
1.3.7.8 拉曼光谱分析
将样品平铺在玻璃载玻片上，在532 nm波长激发下进行拉曼光谱分析。鳕鱼皮明胶肽及肽硒复合物的扫描范围为800～4 000 cm－1。光谱基线校正和峰分配采用labspec 6软件进行分析[27]。
1.3.7.9 圆二色谱分析
用超纯水配制1 mg/mL的鳕鱼皮明胶肽及肽硒复合物溶液，室温下1 cm的路径，波长范围为190～260 nm，每个样品扫描3 次，取平均值[28]。
1.4 数据处理与分析
运用SPSS 19.0统计软件进行显着性差异分析，P＜0.05，差异显着。采用Origin 2018软件进行作图，以表示，每个样品做3 个平行。
2 结果与分析
2.1 鳕鱼皮明胶的氨基酸组成分析
表1 鳕鱼皮明胶的氨基酸组成分析Table 1 Amino acid composition of hoki skin gelatin
由表1可知，鳕鱼皮明胶具有典型的明胶氨基酸组成的特点，甘氨酸含量最多，占总氨基酸含量24.64%，表明鳕鱼皮明胶分子结构中存在(Gly-X-Y)n的重复结构，这种氨基酸组成对维持明胶分子的结构稳定性具有重要作用[29]。亚氨酸（脯氨酸和羟脯氨酸）是明胶的特征氨基酸，质量分数为16.55%。酪氨酸、组氨酸、异亮氨酸含量较低，且不含有胱氨酸。谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸质量分数分别为10.26%、7.77%、6.31%、4.79%和4.62%。
2.2 硒含量的测定结果
分别采用胰蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶酶解鳕鱼皮明胶得到3 种鳕鱼皮明胶肽，以亚硒酸钠为硒源，制备出3 种肽硒复合物，测定其中硒结合量。如图1所示，胰蛋白酶酶解物的硒结合量达到4.84 μg/mg，而胃蛋白酶酶解物的硒结合量为13.61 μg/mg，风味蛋白酶酶解物的硒结合量13.05 μg/mg。胰蛋白酶酶解物的硒结合量显着低于胃蛋白酶酶解物和风味蛋白酶酶解物（P＜0.05），胃蛋白酶酶解物和胰蛋白酶酶解物的硒结合量之间没有显着性差异（P＞0.05）。胃蛋白酶属于消化性蛋白酶，由胃部的胃黏膜主细胞分泌。因此，用胃蛋白酶酶解所得的鳕鱼皮明胶肽硒复合物在消化道中较为稳定。综上所述，选用胃蛋白酶酶解所得的鳕鱼皮明胶肽及肽硒复合物进行后续实验。
图1 不同酶酶解获得的鳕鱼皮明胶肽与硒的结合量Fig.1 Selenium-binding capacity of hoki skin gelatin hydrolysates produced with different enzymes
2.3 鳕鱼皮明胶肽及肽硒复合物紫外-可见光谱和荧光光谱分析
图2 鳕鱼皮明胶肽及肽硒复合物的紫外-可见光谱图（A）和荧光光谱图（B）Fig.2 UV-Vis spectra (A) and fluorescence spectra (B) of hoki skin gelatin peptide and its selenium complex
如图2A所示，280 nm波长附近的吸收带与芳香氨基酸残基的吸光度有关。硒离子与鳕鱼皮明胶肽结合后，波长280 nm左右的吸收带强度明显增大且红移。这可能与发色团（—C＝O，—COOH）和助色团（—OH，ü NH2）的偏振有关。因此推测鳕鱼皮明胶肽与硒结合生成了新物质而导致其吸收峰变化。通常复合物的生成会使其配位体对光吸收性能发生改变，说明鳕鱼皮明胶肽和硒结合发生了价电子跃迁，证明两者之间发生了结合反应。
色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香氨基酸可在特定的激发波长产生内源性荧光[20]。由图2B鳕鱼皮明胶肽及肽硒复合物荧光光谱图发现，鳕鱼皮明胶肽的最大吸收峰为311 nm，这与酪氨酸残基有关。肽硒结合后，肽硒复合物的吸收峰迁移至355 nm，荧光强度显着减弱，可能是由于硒离子的荧光猝灭作用。Sun Na等[30]的研究表明，矿物质离子能够引起肽的折叠。因此，水溶液中的硒离子可能会引起肽的折叠，形成肽硒复合物，这种现象的产生与矿物质离子和蛋白肽反应导致荧光强度降低类似的结果类似。
2.4 鳕鱼皮明胶肽及肽硒复合物的粒径分析
将粒径分布分为3 种粒径范围：＜5 0 0 n m、500～1 000 nm、＞1 000 nm，并计算其峰面积，分析各粒径范围所占比例。如图3所示，鳕鱼皮明胶肽的大小分布由649.4 nm和1 553.5 nm两个峰组成，鳕鱼皮明胶肽与硒相互作用后，大小分布集中在一个峰上，其粒径为296.2 nm。粒径的变化归因于结合反应过程中鳕鱼皮明胶肽与硒离子之间发生了结构折叠，这与Ye Qianwen等[31]的研究结果类似，大豆肽硒螯合后粒径由连续分子质量分布的肽减小成大小一致的颗粒。同时，这一结果也进一步证实了荧光光谱的结论，硒离子的存在引起肽折叠聚集而形成鳕鱼皮明胶肽硒复合物。此外，颗粒的尺寸分布证明结合反应后得到均匀的复合物。
图3 鳕鱼皮明胶肽及肽硒复合物的粒径分析Fig.3 Particle size distribution of hoki skin gelatin peptide and its selenium complex
2.5 鳕鱼皮明胶肽及肽硒复合物微观结构分析
图4A1、B1显示了鳕鱼皮明胶肽及肽硒复合物的表面形态，可以看出精确的颗粒大小分布。图4A2、B2显示了三维图像，在水溶液中羧基通过分子间氢键在肽链上聚集，形成小簇或大簇。由图4A1、A2可知，鳕鱼皮明胶肽表现出相对均匀均一的颗粒，高度近似100 nm。图4B1、B2可知，肽硒复合物表现出类似花状的大小不一的簇状结构，可能是硒的存在发生了结合反应，引起了肽的聚集。与Cui Pengbo等[32]报道肽钙复合物的结果类似。
图4 原子力显微镜分析Fig.4 Atomic force microscopic analysis
分别用5 000 倍和30 000 倍的扫描电子显微镜观察鳕鱼皮明胶肽及肽硒复合物，如图5所示。鳕鱼皮明胶肽表现为平整的片状结构，5 000 倍数下可以看到凹凸不平的圆弧，这应该是鳕鱼皮明胶多肽经冷冻干燥后留下的亲水区的痕迹；肽硒复合物比多肽结构更紧密，结合反应导致大团块的形成，具有更多的褶皱和晶体结构，微观结构的变化表明，鳕鱼皮明胶肽与硒离子结合形成致密的纳米颗粒。Sun Na等[17]报道了肽铁螯合物同样具有球状颗粒的褶皱和晶体结构。
图5 扫描电子显微镜分析Fig.5 Scanning electron microscopic analysis
图6 X射线衍射图Fig.6 X-ray diffraction patterns
由图6可知，鳕鱼皮明胶多肽在2θ为23°附近出现衍射吸收峰，吸收峰的强度不大，本底较大，说明胶原多肽基本上是无规则的非晶型结构。而形成复合物后，X射线衍射图出现多个强峰和弱峰，图谱的衍射峰高而尖锐，强度大，说明晶型较好，与孙博[33]的结论类似。硒的存在增加了鳕鱼皮明胶肽硒复合物晶体的结晶度，说明鳕鱼皮明胶肽与硒发生了反应，生成一种新的物质。
2.6 鳕鱼皮明胶肽与硒的结合位点分析
如图7A所示，3 434 cm-1主要由Nü H的伸缩振动所致，1 641 cm-1主要由C＝O的伸缩振动引起，1 454 cm-1主要由ü COO-引起；当多肽与硒离子结合后，Nü H的吸收峰移动到3 422 cm-1；指纹区C＝O的吸收峰移动到1 648 cm-1；ü COO-的吸收峰移动到了1 450 cm-1。这与赵立娜等[14]的结论类似，鳕鱼皮明胶肽与硒结合前后的红外光谱表明，多肽的氨基和羧基参与了硒离子的配位。
如图7 B 所示，类似于红外光谱，鳕鱼皮明胶肽与硒的结合也导致了拉曼光谱的变化，3 4 1 4、1 643、1 402 cm-1波数分别移至3 417、1 633 cm-1和1 402 cm-1。拉曼光谱3 414 cm-1，是由鳕鱼皮明胶肽Nü H振动引起，当肽与硒离子结合后，波峰移动了2 cm-1。约1 643 cm-1的条带对应酰胺I带，主要是由于C＝O的伸缩振动，肽硒复合后，移动至1 633 cm-1。鳕鱼皮明胶肽的拉曼光谱在1 402 cm-1处的峰值对应于氨基酸侧链的COO-官能团的对称伸缩振动，肽与硒离子结合后，其峰移动至1 372 cm-1。拉曼光谱进一步验证了红外光谱的结果，鳕鱼皮明胶肽的硒结合位点可能位于羧基和氨基。
图7 鳕鱼皮明胶肽与硒的结合位点分析Fig.7 Analysis of binding sites of hoki skin gelatin peptide with selenium
2.7 鳕鱼皮明胶肽及肽硒复合物的二级结构分析
图8 鳕鱼皮明胶肽及肽硒复合物的圆二色谱Fig.8 CD spectra of hoki skin gelatin peptide and its selenium complex
由图8可知，鳕鱼皮明胶肽的二级结构主要为β-折叠（28.1%）、无规卷曲（70.36%），同时含有较少的β-转角（1.57%），当多肽与硒结合后，新生成了α-螺旋结构，含量为1.1%，β-转角增加至3.3%，β-折叠减少至25.7%，而无规卷曲无显着性变化，这与姜丹丹等[34]报道的无规卷曲基本不受锌离子影响的结果类似。结果表明，鳕鱼皮明胶肽与硒结合后，肽链的二级结构发生了显着的转变，由β-折叠转变为了α-螺旋和β-转角，结构更加有序和紧凑，这与Sun Na等[20]的结论一致。
3 结 论
本研究从鳕鱼皮中提取明胶，氨基酸分析证明明胶是良好的原料，将酶解后的鳕鱼皮明胶多肽与硒离子进行结合反应，以硒结合量为指标，筛选出胃蛋白酶为最适酶，其酶解物的平均硒结合量为13.61 μg/mg。鳕鱼皮明胶肽与硒结合后，紫外光谱吸收峰强度增大且红移，荧光光谱吸收峰由311 nm迁移到355 nm且荧光强度减弱，说明鳕鱼皮明胶肽与硒结合产生新的物质；通过激光粒径仪、原子力显微镜、扫描电子显微镜以及X射线衍射对其进行微观结构分析，发现鳕鱼皮明胶肽与硒结合后粒径减小，形成更为聚集的簇状结构，并呈现为晶体结构；圆二色谱分析表明鳕鱼皮明胶肽上的羧基和氨基可能与硒发生了结合反应，使得β-折叠结构转变为α-螺旋结构和β-转角结构，形成结构更为紧凑的肽硒复合物。本研究为海洋鱼皮资源的高值化利用以及新型补硒产品的开发提供了理论依据。
