李 阳，苏艳瑜，李国豪，李 琪，王宇翔，丁玉松

（石河子大学医学院，新疆 石河子 832000）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由胰岛素分泌缺陷和胰岛素作用障碍引起的一类慢性疾病[1-3]。在我国，DM患病人数持续增加[4-6]。有研究显示，2019年全球DM患者已达到1.16亿，预测2030年会增加到1.40亿，未来将会对社会带来巨大的经济压力和负担[7-8]。

已有大量研究表明，氧化损伤在DM中起到重要作用，氧化应激除直接对胰岛细胞造成损伤外，还影响胰岛素分泌[9-11]。因此，抗氧化治疗可能是防治DM的重要途经。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）作为目前发现的重要抗氧化应激转录因子，在应激状态下启动下游抗氧化酶体系，在DM发病中发挥关键作用[12]。伏旭等[13]研究显示，通过过表达Nrf2，诱导其下游抗氧化酶的表达，能够减轻大鼠胰腺氧化损伤，从而对胰腺产生一定的保护作用。槲皮素是一种天然的黄酮类化合物，不仅可通过清除自由基表现出直接的抗氧化作用[14]，还可以激活肝脏中的Nrf2信号通路表现出间接的抗氧化作用[15]。目前，槲皮素是否能通过激活胰腺组织中Nrf2通路以拮抗DM大鼠胰腺氧化损伤尚未明确。

本研究旨在探讨槲皮素拮抗DM大鼠胰腺氧化损伤的作用机制，通过建立2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠模型，检测由DM引起的胰腺氧化损伤，以及槲皮素干预后Nrf2信号通路及其下游关键抗氧化酶蛋白和mRNA的表达，以期为DM对胰腺组织的氧化损伤提供实验依据，并为槲皮素拮抗DM所致胰腺组织氧化损伤提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级SD大鼠（动物使用许可证号：SYXK（新）2018-005；生产许可证号：SCXK（新）2018-005），体质量（210±10）g，由新疆医科大学提供。

槲皮素上海化学试剂有限公司；链脲佐菌素美国Sigma公司；A006-2谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒、A001-3超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒、A045-3蛋白标准测定试剂盒、A015总抗氧化能力（total antioxidative capability，T-AOC）检测试剂盒和A003-1丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒南京建成生物科技有限公司；NADP(H):醌氧化还原酶1（NADP(H):quinone oxido-reductase-1，NQO1）小鼠单克隆抗体（A180）、血红素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）小鼠单克隆抗体、谷胱甘肽硫转移酶（glutathione S-transferase，GST）pi山羊多克隆抗体、兔多克隆抗体（ab137550）艾博抗（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

Accu-Check血糖检测仪罗氏诊断产品（上海）有限公司；电子天平德国赛多利斯仪器有限公司；FA2004B电子精密天平上海精密科学仪器有限公司；SHA-B恒温水浴箱上海跃进医疗仪器有限公司；TGL-16G-A高速冷冻离心机上海安亭化学仪器有限公司；Mu1iskan MK3酶标仪美国Bio-Rad公司；漩涡振荡仪上海亚荣分析仪器有限公司；手动玻璃匀浆器生工生物工程（上海）股份有限公司；EDC-810实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 灌胃溶液的配制

低剂量槲皮素混悬液：参考杨冉等[16]的方法，称取1 g槲皮素溶于50 mL去离子水中，配制质量浓度20 mg/mL的槲皮素混悬液；高剂量槲皮素混悬液：称取1 g槲皮素并溶于25 mL去离子水中，配制质量浓度为40 mg/mL的槲皮素混悬液。

1.3.2 动物模型的建立

48 只SD大鼠，体质量（210±10）g，随机选取10 只大鼠作为空白对照组，将剩余38 只大鼠进行T2DM造模。造模具体方法为每天饲喂高脂高糖饲料，饲喂2 周后腹腔注射链脲佐菌素30 mg/kgmb，每周1 次，共2 次。以大鼠随机血糖浓度不低于16.7 mmol/L作为造模成功的判断标准。剔除造模失败的8 只大鼠，将血糖水平达标的30 只大鼠按血糖浓度分层随机分为T2DM模型组、低剂量槲皮素（L-QU）干预组、高剂量槲皮素（H-QU）干预组，每组10 只。正常对照组、T2DM模型组大鼠均灌胃去离子水，L-QU、H-QU干预组大鼠分别以100、200 mg/kgmb的剂量灌胃相应槲皮素混悬液，每天1 次，干预12 周。实验期间大鼠自由饮水、摄食，每周定期测定大鼠体质量、血糖水平，观察并记录大鼠活动情况、饮水量、摄食量、尿液量。

1.3.3 血液标本采集和胰腺组织提取

大鼠麻醉后眼球取血，立即离心（3 600 r/min、10 min），收集血清。颈椎脱臼处死大鼠，即刻取出胰腺组织，用预冷生理盐水冲洗血渍，待滤纸吸干后，用精准电子天平称质量。眼科剪分取0.4 g胰腺组织，置于玻璃匀浆管口剪碎，加入9 g/100 mL生理盐水，充分研磨至无纤维状物质，制成10 g/100 mL的胰腺组织匀浆，4 ℃、3 600 r/min离心10 min，取上清液，于-20 ℃保存，使用前室温下解冻。

1.3.4 血清胰岛素水平测定

采用放射免疫法[17]检测大鼠血清胰岛素水平。胰岛素抵抗（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）指数按下式计算。

1.3.5 胰腺组织氧化和抗氧化指标测定

按照试剂盒说明书步骤，分别采用硫代巴比妥酸法测定大鼠胰腺组织MDA含量，微量酶标法测定GSH浓度和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力，WST-1法测定SOD活力，比色法测定T-AOC，考马斯亮蓝法测定蛋白含量。

1.3.6 免疫印迹检测胰腺抗氧化酶表达量

在RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置于冰上。蛋白定量后加入上样缓冲液并煮沸，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离样品并转膜。用TBST洗涤3 次后，用牛血清白蛋白封闭2 h，再用TBST洗涤3 次，加入二抗在室温下孵育，用TBST洗涤3 次，用ECL试剂显影，以GAPDH为内参，通过光密度法测定Nrf2、HO-1、GST、NQO1蛋白的相对表达量[18]。

1.3.7 实时定量PCR测定Nrf2信号通路抗氧化酶mRNA表达量

检测Nrf2、GST、HO-1、NQO1mRNA表达量。TRIzol法提取胰腺组织中总RNA，将符合条件的RNA反转录成cRNA，反应条件：25 ℃、5 min，50 ℃、15 min，85 ℃、5 min，4 ℃、10 min。cDNA进行6 倍稀释，反应体系：4 μL 6×cDNA、0.4 μL 10 μmol/L正向引物、0.4 μL 10 μmol/L反向引物、10 μL SYBR Green Master Mix、0.4 μL 50×ROX Reference Dye 2、4.8 μL超纯水。反应条件：50 ℃、2 min，95 ℃、10 min；95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，40 个循环。根据基因序列设计特异性引物，以GAPDH为内参，运用实时荧光定量PCR检测，以2-ΔΔCt进行数据分析。引物序列如表1所示。

表 1 PCR扩增基因引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR amplification of genes

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 19.0软件进行数据分析，用Graphpad Prism软件绘图。数据服从正态分布，结果以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni法。

2 结果与分析

2.1 实验期间大鼠一般情况

正常对照组大鼠一般状况良好，毛发光泽、活动迅速，摄食量、饮水量、尿液量均正常；T2DM模型组大鼠情况一般较差，精神萎靡、毛发无光泽、弓背蜷体、反应迟钝，摄食量、饮水量、尿液量均增加。与T2DM模型组相比，L-QU、H-QU干预组大鼠的上述症状有所改善。

2.2 槲皮素干预后大鼠体质量和血糖的动态变化趋势

图 1 槲皮素干预后T2DM大鼠体质量的变化趋势Fig. 1 Variation trend of body mass in T2DM rats with quercetin intervention

表 2 槲皮素干预对T2DM大鼠体质量和血糖浓度的影响Table 2 Effect of quercetin on body mass and blood glucose levels in T2DM rats

由表2可知，各组大鼠初始体质量无统计学差异（P＞0.05），经槲皮素干预12 周后，与正常对照组相比，T2DM组大鼠体质量显着下降（P＜0.05）。结合实验期间大鼠体质量的变化趋势（图1）分析，正常对照组大鼠体质量始终呈上升趋势，T2DM组大鼠体质量下降幅度最大，L-QU、H-QU干预组大鼠体质量下降幅度较T2DM组小。

由表2可知，造模结束后与正常对照组相比，T2DM模型组大鼠血糖浓度显着升高（P＜0.05）；L-QU、H-QU干预组大鼠血糖浓度与T2DM组无统计学差异（P＞0.05）；槲皮素干预12 周后，与T2DM模型组相比，L-QU、H-QU干预组大鼠血糖浓度均显着降低（P＜0.05）。以上结果表明，槲皮素可以降低T2DM大鼠血糖浓度。

2.3 槲皮素干预后大鼠血清胰岛素水平的变化

表 3 槲皮素干预对T2DM大鼠血清胰岛素含量和HOMA-IR指数的影响Table 3 Effect of quercetin on serum insulin levels and HOMA-IR index in T2DM rats

由表3可知，槲皮素干预12 周后，与正常对照组相比，T2DM模型组大鼠的血清胰岛素含量显着降低（P＜0.05），HOMA-IR指数显着升高（P＜0.05）；与T2DM模型组相比，L-QU、H-QU干预组大鼠HOMA-IR指数显着下降（P＜0.05），表明槲皮素干预可以减轻T2DM大鼠的胰岛素抵抗。

2.4 槲皮素干预后大鼠胰腺的氧化损伤变化

表 4 槲皮素干预对T2DM大鼠胰腺氧化损伤的影响Table 4 Effect of quercetin on oxidative pancreatic damage in T2DM rats

由表4可知，槲皮素干预12 周后，与T2DM模型组相比，L-QU、H-QU干预组大鼠胰腺MDA含量均显着降低（P＜0.05），SOD活力、T-AOC水平、GSH-Px活力和GSH浓度均显着上升（P＜0.05）。结果表明，低、高剂量的槲皮素干预可以减轻T2DM大鼠胰腺组织氧化损伤，可能与SOD、T-AOC、GSH-Px以及GSH水平的提高有关，机体抗氧化能力的提高使T2DM大鼠的血糖水平有所改善，并减轻胰岛素抵抗。

2.5 槲皮素干预后大鼠胰腺中Nrf2、HO-1、GST、NQO1蛋白表达的变化

由图2可知，槲皮素干预12 周后，与T2DM模型组相比，L-QU、H-QU干预组大鼠胰腺Nrf2、HO-1、GST、NQO1蛋白的相对表达量均显着上升（P＜0.05），表明槲皮素干预可以提升T2DM大鼠胰腺Nrf2蛋白的表达，从而激活下游抗氧化酶，使HO-1、GST、NQO1蛋白的表达上调，从而使T2DM大鼠胰腺内MDA含量显着降低（P＜0.05），改善胰腺氧化损伤，降低血糖水平，并减轻胰岛素抵抗。

图 2 槲皮素干预对T2DM大鼠胰腺Nrf2、NQO1、HO-1、GST蛋白表达的影响Fig. 2 Effect of quercetin on Nrf2, NQO1, HO-1 and GST protein expression in T2DM rats

2.6 槲皮素干预后大鼠胰腺中Nrf2、NQO1、GST、HO-1 mRNA表达的变化

图 3 槲皮素干预对T2DM大鼠胰腺Nrf2、NQO1、GST、HO-1 mRNA相对表达量的影响Fig. 3 Effect of quercetin on mRNA expression levels of Nrf2, NQO1,GST and HO-1 in T2DM rats

由图3可知，槲皮素干预12 周后，与T2DM模型组相比，L-QU、H-QU干预组大鼠胰腺Nrf2、HO-1、NQO1的mRNA相对表达量均显着升高（P＜0.05），L-QU干预组大鼠胰腺GSTmRNA相对表达量与T2DM模型组相比无统计学差异（P＞0.05），仅H-QU干预组大鼠的胰腺GSTmRNA相对表达量显着升高（P＜0.05）。表明槲皮素干预可能通过激活Nrf2通路，上调Nrf2mRNA表达水平，进而上调下游相关抗氧化酶表达，使T2DM大鼠胰腺内MDA含量显着下降，减轻胰腺氧化损伤。

3 讨 论

DM已经成为危害我国城乡居民健康的重大公共卫生问题，DM及其并发症的防治主要是通过降糖药物和胰岛素控制血糖，但血糖控制效果况并不理想[19-21]。长期使用降糖药物会有明显的副作用，植物化学物具有获取方便、廉价、副作用小等特点，受到研究者的青睐[22]。

多项研究表明槲皮素对DM患者具有一定的保护作用[23-25]。本研究结果表明，槲皮素干预12 周后，与T2DM模型组相比，L-QU、H-QU干预组大鼠的血糖浓度、HOMA-IR指数显着降低（P＜0.05），这一结果与Wang Zhenzhi等[26]的研究结果一致。这说明槲皮素具有降血糖作用，可以减轻T2DM大鼠的胰岛素抵抗。

氧化应激在DM发病过程中具有非常关键的作用。随着人们对氧化应激认识的不断深入，通过抗氧化途径寻找预防和治疗DM及其并发症的方法，使抗氧化治疗有望成为一种新的DM及其并发症的防治手段[27]。研究表明，氧化应激参与DM发生、发展的整个过程，减轻氧化损伤可能会阻止或延缓DM发展及其并发症的发生。DM患者由于胰岛β细胞受损，其体内抗氧化酶含量及活性相对降低，高糖聚集形成的活性氧簇也会直接损伤胰岛β细胞[28]。王建礼等[29]研究发现，与T2DM模型大鼠相比，槲皮素干预使T2DM大鼠血清MDA浓度降低，SOD活力明显上升，减轻了氧化损伤，从而发挥对胰腺的保护作用。本实验发现，与T2DM模型组相比，L-QU、H-QU干预组大鼠胰腺的MDA含量显着降低，SOD活力、T-AOC水平、GSH浓度、GSH-Px活力均显着上升，说明槲皮素干预可以减轻T2DM大鼠胰腺氧化损伤并能提高胰腺抗氧化能力。

有研究表明，Nrf2与抗氧化反应元件（anti-oxidative response element，ARE）结合，启动下游II相解毒酶、抗氧化蛋白、蛋白酶体/分子伴侣等基因转录和表达以抵抗氧化应激[30]。Nrf2/ARE信号通路是机体抵抗外界氧化的防御性转导通路，能够提高机体的抗氧化能力[31]。Nrf2通路作为重要的内源性抗氧化应激通路，与DM及其并发症的发生、发展之间有着密切联系，并有望成为极具前景的DM干预新靶标[32]。

江颖娟等[14]研究发现，槲皮素可通过激活Nrf2信号通路上调HO-1、GST、NQO1蛋白及其mRNA表达水平，进而对肝脏氧化损伤产生一定的保护作用。Wu Yuanseng等[33]研究结果显示，Nrf2信号通路被激活后，可拮抗高糖所致氧化应激诱导的胰岛β细胞损伤。伏旭等[13]研究发现，蛙皮素联合脂多糖能够诱导急性胰腺炎大鼠通过Nrf2蛋白的过表达，显着上调胰腺中HO-1、NQO1蛋白及其mRNA表达水平，从而拮抗胰腺氧化损伤。本研究结果显示，与T2DM模型组大鼠相比，L-QU、H-QU干预组大鼠胰腺Nrf2蛋白及其mRNA表达水平均显着上升，下游抗氧化酶HO-1、NQO1的蛋白及其mRNA表达量均显着上升，表明槲皮素可通过激活Nrf2通路，上调下游相关抗氧化酶表达，拮抗DM所致胰腺氧化损伤。

槲皮素作为防治DM的天然植物化学物质一直备受关注。多项研究结果表明，槲皮素具有调节血糖的作用[23-24]，但机制尚不明确。本研究结果表明，槲皮素可能是通过激活胰腺组织Nrf2信号通路，调节下游抗氧化酶表达，进而减轻胰腺氧化损伤，改善胰岛素抵抗，调节血糖水平，从而发挥防治DM的作用。