基于环糊精的食品级Pickering乳液构建

刘忠博，耿 升，蒋兆景，杨 伟，刘本国

（河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003）

Pickering乳液是以固体颗粒替代传统乳液中表面活性物质，利用颗粒在油滴表面的吸附实现体系稳定的一种乳液[1]。与由传统的表面活性剂稳定的乳液相比，它不仅有经典乳液的基本性质，还具有较好的稳定性，更高的安全性和更广的应用范围，因而受到越来越多的关注。近几十年来，以无机粒子或有机高分子为颗粒乳化剂制备Pickering乳液的研究较多，但这些颗粒存在着生物相容性低、可降解性差等缺点，使其在食品、药品和化妆品等领域的应用受到一定限制，因而食品级天然固体颗粒乳化剂逐渐成为研究热点[2-3]。目前，相关的研究主要集中于纤维素[4]、淀粉[5]、蛋白质[6]等。环糊精（cyclodextrin，CD）是环糊精葡萄糖基转移酶作用于直链淀粉产生的一系列具有锥形中空环状结构的低聚糖（如α-CD、β-CD和γ-CD）[7-8]。CD具有内腔疏水而外壁亲水的独特结构，使得其可通过范德华力、氢键及疏水作用包合疏水性分子形成主客体型超分子复合物[9-10]。有报道指出CD可用于Pickering乳液构建。Choi等[11]构建了β-CD稳定的鱼油基O/W型Pickering乳液，发现油/水界面处形成的β-CD/鱼油超分子包合物对乳液稳定有重要作用。Shimada等[12]比较了α-、β-和γ-CD乳化大豆油的能力，发现β-CD表现突出，其在添加量为0.25%时就能稳定乳液。Inoue等[13]考察了油相中烷烃链长对CD乳化能力的影响，发现稳定效果如下：十六烷＞十二烷＞辛烷。当前食品级天然固体颗粒乳化剂研究仍集中在蛋白、多糖等天然生物大分子上，对基于CD的Pickering乳液研究仍然较少，且现有研究大多集中在特定CD乳液的结构表征上，而未系统考察CD结构对乳液性质的影响，相关研究也缺乏理论计算支持，有鉴于此，本研究拟以各型CD为乳化剂，构建食品级Pickering乳液体系，考察CD结构，CD质量浓度、油相类型、油水比等因素对O/W型Pickering乳液形成的影响，并重点比较α-、β-及γ-CD稳定的中链脂肪酸甘油三酯（medium-chain triglyceride，MCT）基Pickering乳液的微观结构、微流变性质及稳定性，结合分子对接方法，模拟CD/MCT包合物的形成，以期揭示造成三者乳化能力差异的原因。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

α-CD、β-CD、γ-CD、甲基-β-CD（M-β-CD）、2,6-二-O-甲基-β-CD（diM-β-CD）、(2-羟丙基)-β-CD（HP-β-CD）、MCT 上海源叶生物科技有限公司；尼罗蓝、尼罗红 美国Sigma-Aldrich公司；玉米油山东鲁花集团；葵花籽油、菜籽油、花生油、大豆油益海嘉里集团；乙醇、丙二醇等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Ultra-Turrax T18高速剪切机 德国IKA公司；DCAT 21表面/界面张力仪 德国DataPhysics公司； Rheolaser LAB 6光学微流变仪 法国Formulaction公司；BH200P偏光显微镜 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；LSM780激光共聚焦显微镜 德国Carl Zeiss公司；ME104E/02型电子天平、PL1001-L型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DZKW-D-2型电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 油相类型对Pickering乳液的影响考察

将200 mg CD（α-、β-、γ-，M-β-、diM-β-、HP-β-CD），加入8 mL去离子水中，所得溶液在室温15 000 r/min高速剪切下，分别与2 mL食用油（大豆油、花生油、玉米油、葵花油、MCT）混合，剪切3 min，制备Pickering乳液，静置1 d后进行观察。

1.3.2 油水比对Pickering乳液的影响考察

将200 mg CD（α-、β-、γ-CD）分别加入9、8、7、6、5 mL去离子水中，所得溶液在室温15 000 r/min高速剪切下，分别与1、2、3、4、5 mL MCT混合，剪切3 min，制备Pickering乳液，静置1 d后进行观察。

1.3.3 CD质量浓度对Pickering乳液的影响考察

将50、100、150、200、250 mg CD（α-、β-、γ-CD），加入5 mL去离子水中，所得溶液在室温15 000 r/min高速剪切下，分别与5 mL MCT混合，剪切3 min，制备Pickering乳液，静置1 d和30 d后进行观察。

1.3.4 界面张力测定

使用吊片法测定α-、β-、γ-CD溶液在MCT中的界面张力[14]。铂金片用去离子水清洗后，用酒精灯灼烧至微红，冷却后放入界面张力仪待用。根据测定程序，将20 mL的MCT倒入仪器升降台中测定，再将30 mg/mL的CD溶液20 mL倒入升降台测定，最后将20 mL的MCT添加到20 mL 30 mg/mL的CD溶液中进行油水界面张力的测量，空白为去离子水，测定温度为25 ℃。

1.3.5 乳液贮藏稳定性测定

参照Shao Ping等[15]的方法考察乳液贮藏稳定性。乳液剪切后立即将其转入20 mL玻璃瓶中。瓶子用塑料盖密封防止水分挥发。将乳液样品在25 ℃静置储存。稳定性以乳化指数（emulsifying index，ES）和乳液稳定指数（stability index，SI）表示：

式中：He为观察到的乳化层体积（即非澄清部分）；Ht为体系总体积，即油相、添加颗粒和连续相的总和。ES1d和ES30d分别为第1、30天的乳液的ES值。

1.3.6 乳液形貌观察

吸取Pickering乳液20 μL至载玻片上，压片后，用配有数码相机的光学显微镜观察乳液的形貌，并运用ImageJ软件测定乳液的粒径分布[16]。

1.3.7 激光共聚焦显微观察

参照Yusoff等[17]的方法，使用尼罗蓝（0.1%）和尼罗红（0.01%）溶液分别对CD和MCT染色24 h，再混合剪切制备Pickering乳液，吸取Pickering乳液20 μL至载玻片上，使用激光共聚焦显微镜200 倍下观察，在488 nm和633 nm波长下分别激发尼罗红和尼罗蓝染料，以1 024×1 024像素的分辨率拍摄，并使用图像分析软件ZEN 3.0进行处理。

1.3.8 乳液微流变测定

使用Rheolaser Master光学微流变仪对CD（α-、β-CD）质量浓度为5、15、25 mg/mL的乳液进行微流变分析。将静置24 h的乳液样品20 mL装入到25 mL测试瓶中，置于Rheolaser腔室中，在25 ℃通过CCD探测器监测6 h，由Rheosoft Master 1.4.0.0软件同步测定并记录乳液的弹性指数（elasticity index，EI）和宏观黏度指数（macroscopic viscosity index，MVI）[18]。

1.3.9 分子对接方法

在Hyperchem 8.0软件中构造MCT分子，MCT的3 条脂肪链分别为辛酸、癸酸和辛酸，先用分子力学MM+法和半经验的量子化学AM1法对MCT结构进行预优化，然后运用Guassian 09软件的B3LYP/6-31G(d)法进行结构优化[19]。α-、β-、γ-CD的结构分别来自PDB数据库的3L2M、4YEF和1D3C文件。CD和MCT的分子对接采用AUTODOCK4.2软件进行[20-21]，设定autogrid box参数为60 Å×60 Å×60 Å，grid spacing为0.375 Å，计算方法为Lamarckian genetic algorithm，其他参数默认设置，对接20 次[22]。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 油相类型对乳液的影响

油相可影响Pickering乳液的类型，非极性油相使颗粒更亲水，易倾向于形成O/W型Pickering乳液；极性油相使颗粒更亲油，易形成W/O型Pickering乳液[23]。本研究考察了以大豆油、花生油、玉米油、葵花油、MCT为油相时，CD乳液的形成情况（图1）。当CD质量浓度为20 mg/mL，油水体积比2∶8时，α-、β-CD形成的乳化层较高，γ-CD和β-CD衍生物（M-β-CD、diM-β-CD、HP-β-CD）几乎没有乳化层。且当油相为MCT时，α-CD与β-CD乳化层高度接近，而在其他油相中α-CD的乳化层高度明显高于β-CD；表明CD的结构及油相类型对乳液的形成有显着影响，α-CD的乳化稳定性更好。Yu等[24]采用α-、β-和γ-CD为乳化剂稳定油相，在0 d和22 d对乳液结构进行表征，也发现α-和β-CD具有稳定乳液的能力，而γ-CD乳化稳定性不佳。

图 1 CD种类和油相类型对Pickering乳液的影响Fig. 1 Effects of cyclodextrin type and oil phase type on appearance of Pickering emulsion

2.2 油水比对乳液的影响

MCT天然存在于棕榈仁油、椰子油等食品和母乳中，是膳食脂肪的来源之一，主要成分是辛、癸酸甘油酯。MCT由饱和脂肪酸构成，凝固点低、黏度小、氧化稳定性好，且在高温和低温下特别稳定，被广泛用于食品脂溶性活性成分的递送体系构建[25]。鉴于α-和β-CD对MCT具有相近的乳化稳定性，因而其被挑选用于后续实验。在2.1节基础上，为进一步考察CD空腔体积对乳化稳定性的影响，选择α-、β-、γ-CD为乳化剂。如图2所示，当CD质量浓度为20 mg/mL，油相为MCT时，α-、β-和γ-CD的乳化稳定性均随油水比的增加而增强，适当增加油水比，可提高乳化稳定性，这与Chevalier等[26]的结果一致，但过高的油水比可能会造成破乳现象[15]。

图 2 油水比对Pickering乳液的影响Fig. 2 Effect of oil-to-water ratio on appearance of Pickering emulsion

2.3 CD质量浓度对乳液的影响

图 3 CD质量浓度对Pickering乳液的影响Fig. 3 Effect of amount of CD added on appearance of Pickering emulsion

如图3所示，在油相为MCT，油水比5∶5的乳液中，α-CD的乳化稳定性随其质量浓度的增加而显着提高，在质量浓度15 mg/mL（α-15）时，α-CD乳化层高度基本不再增加，其乳化层高度和25 mg/mL（α-25）时乳化层高度接近。β-CD在质量浓度为5 mg/mL（β-5）时无法形成稳定乳液，但随质量浓度的增加，β-CD形成的乳化层高度迅速提高，在15 mg/mL（β-15）时则能形成均一稳定乳液。在低质量浓度下α-CD的乳化稳定性显着高于β-CD，而在高质量浓度下β-CD的乳化稳定性更好，且二者形成的乳液30 d，仍可保持稳定。而γ-CD的乳化稳定性随质量浓度的增加没有显着变化，形成的乳化层与α-、β-CD相比，较稀薄、不够均一，30 d后会出现分层现象。CD的乳化稳定性随质量浓度的增加而增强，这归因于体系中CD的增加可降低界面张力，并增强界面的厚度与强度[27-28]。但CD结构对乳液形成和稳定有显着差异，需进一步研究。

2.4 界面张力

固体颗粒通过在油滴表面驻留稳定乳液，该机理不同于传统表面活性剂，其是基于水和油对固体颗粒表面的部分润湿作用。界面张力可反映乳化剂的乳化能力，是衡量颗粒乳化能力的重要手段。本研究测定了CD对MCT/水界面张力的影响，以进一步比较它们的乳化稳定性。如图4所示，与空白相比（25.23 mN/m），CD能降低油水界面的界面张力，α-CD（8.96 mN/m）和β-CD（9.81 mN/m）降低效果明显，且结果接近，而γ-CD（24.53 mN/m）效果不佳，表明α-和β-CD颗粒具有更好的表面活性，形成Pickering乳液的能力更强，这与前面的实验现象一致。

图 4 CD对油/水界面张力的影响Fig. 4 Effect of CDs on O/W interfacial tension

2.5 乳液微观结构

图5为油相为MCT，油水比为5∶5时，α-和β-CD质量浓度（5～25 mg/mL）对乳液微观结构的影响。当质量浓度为5 mg/mL时，α-CD可形成稳定的Pickering乳液，粒径为（44.16±1.39）μm，而此时β-CD不能形成稳定的Pickering乳液。表明α-CD在油/水界面处与MCT结合紧密，界面驻留能力强，在较低质量浓度就可形成稳定乳液，而β-CD与MCT结合弱，界面驻留能力不强，需更高质量浓度稳定乳液。

图 5 CD稳定的Pickering乳液的光学显微图Fig. 5 Optical micrograph images of Pickering emulsions stabilized by CDs

在15 mg/mL时，α-CD形成的Pickering乳液粒径为（26.58±1.67）μm，而β-CD形成的Pickering乳液粒径为（8.94±0.82）μm，α-CD形成稳定的Pickering乳液粒径较大；在25 mg/mL时，α-CD形成稳定的Pickering乳液粒径为（13.28±0.73）μm，而β-CD形成稳定的Pickering乳液粒径为（5.50±0.47）μm，α-CD形成稳定的Pickering乳液粒径仍较大。这是可能由于β-CD水溶性远低于α-CD[29]，其沉淀在水相中更易聚集，可更好地阻止了油滴合并，因而由其形成的Pickering乳液的油滴粒径更小。图6为质量浓度为15 mg/mL时，α、β-CD所稳定乳液的激光共聚焦显微图，MCT用尼罗红染色标记为蓝色，CD用尼罗蓝染色标记为红色。由图6可知，乳液液滴为圆形，被红色环所包裹，表明α、β-CD颗粒包裹MCT构成的油滴，构成了O/W型Pickering乳液。

图 6 CD稳定的Pickering乳液的激光扫描共聚焦显微图Fig. 6 Laser-scanning confocal micrograph images of Pickering emulsions stabilized by CDs

2.6 乳液贮藏稳定性

当油相为MCT，油水比为5∶5时，α-CD和β-CD质量浓度（5～25 mg/mL）对反映乳液贮藏稳定性的ES和SI的影响如图7和表1所示。CD质量浓度为5 mg/mL时，α-CD可形成Pickering乳液，而β-CD则不行。当质量浓度为15 mg/mL和25 mg/mL时，α-CD和β-CD均可形成乳液，且β-CD的ES高于α-CD，这与2.5节中β-CD乳液粒径小于α-CD的现象一致。当贮藏30 d后，α-CD的ES均显着降低，而β-CD的ES保持稳定。随着CD质量浓度的增加，二者的SI都显着提高，即由高质量浓度CD形成的乳液稳定性更好。这是由于随着CD质量浓度的增加，其在油水界面的驻留量增大，在油相和水相间形成物理屏障，阻止液滴之间相互靠拢、聚集，从而提高乳液稳定性[30]。而且颗粒浓度的增大会提高Pickering乳液黏度，阻碍液滴间的碰撞和凝聚，从而增强乳液的稳定性[31]。

图 7 不同质量浓度Pickering乳液贮藏1 d（A）和30 d（B）的稳定性Fig. 7 Stability of Pickering emulsions at different mass concentrations after 1 d (A) and 30 d (B) of storage

表 1 CD稳定的Pickering乳液的贮藏稳定性比较Table 1 Comparison of storage stability of Pickering emulsions stabilized by CDs

2.7 乳液微流变分析

光学微流变是一种基于扩散波光谱的流变测定方法，它通过向乳液发射一束相干激光，利用激光跟踪粒子的布朗运动，从激光信号变化测定样品的黏弹性参数[32]。与机械流变相比，微流变法是在零剪切情况下进行测量，可监测乳液的布朗运动，并从微观的角度对其进行了解释。本研究运用光学微流变法考察了CD质量浓度对EI和MVI的影响（图8）。EI可描述体系弹性强弱，而MVI是样品在零剪切状态下的黏度，能反映体系的质构、流动性、长期稳定性等[33]。如图8所示，α-和β-CD乳液的EI均随CD质量浓度的增加而增大，α-5大于β-5、β-15略微大于α-15、β-25大于α-25。表明在低质量浓度下α-CD乳液的弹性大于β-CD的弹性，在高质量浓度下β-CD乳液的EI更强。在黏性分析中，α-和β-CD的MVI值均随CD质量浓度的增加而升高，α-5大于β-5，α-15略微大于β-15、β-25大于α-25。这表明在低CD质量浓度下α-CD乳液的黏性大于β-CD的黏性，在高CD质量浓度下β-CD乳液的黏性更强。在弹性分析中α-CD和β-CD乳液的弹性值EI均随时间的变化比较稳定，而在黏性测定中二者的MVI值随时间都有一定的波动，且β-CD的MVI值波动显着高于α-CD，这可能是由于α-CD在油水界面具有更强的驻留性，而β-CD在油水界面的驻留性不强，其在油水界面吸附同时，还在溶液中沉淀聚集，二者随时间相互转换，造成黏性随时间出现较大波动。

图 8 CD稳定的Pickering乳液的微流变结果Fig. 8 Microrheological results of Pickering emulsions stabilized by CDs

2.8 分子对接

CD稳定Pickering乳液被归因于连续相中CD与甘油三酯在油/水界面自组装形成具有类似表面活性剂作用的两亲性超分子，降低油/水界面张力，并在界面形成稳定的膜结构。本研究中，α-、β-和γ-CD具有相近分子大小，在条件合适时，均可形成O/W型的Pickering乳液，但低质量浓度时，α-CD表现最好，而β-CD和γ-CD次之，表明CD空腔的尺寸对其与MCT结合有显着影响，并最终导致了三者乳化稳定性的差异。为更好解析实验结果，本研究引入分子对接方法，系统比较三者与MCT分子形成包合物的难易。如图9所示，MCT均可进入各CD空腔内，其脂肪链均指向CD外侧，形成两亲性超分子。但表征包合物形成难易的结合能（EBinding）却存在显着差异，α-CD与MCT形成复合物的能力最强（EBinding＝-8.32 kcal/mol），β-CD次之（EBinding＝-7.14 kcal/mol），γ-CD最低（EBinding＝-7.07 kcal/mol），这较好解释了乳化实验中观察到的现象。

图 9 CD与MCT的分子对接结果Fig. 9 Molecular docking results between CDs and MCT

3 结 论

本研究以CD为乳化剂，考察CD结构、质量浓度、油相类型、油水比等因素对O/W型Pickering乳液形成和稳定性的影响，结果表明α-和β-CD有较好的乳化性，其乳化稳定性随油水比和质量浓度的增加而增大，油相类型对乳化稳定性也有显着影响。α-和β-CD均能显着降低油/水界面张力，且效果接近。但在乳液微观结构和贮藏稳定性实验中，α-CD在低质量浓度（5 mg/mL）时其乳液稳定性最好，而β-CD则在高质量浓度（15、25 mg/mL）时其乳液液滴粒径更小、更均一，且乳液稳定性表现更佳。结合微流变和分子对接分析，认为这归因于α-CD与MCT分子间结合作用强，易于形成两亲性超分子，因而其在低浓度时的乳化稳定性优于β-CD。β-CD虽然在油水界面的驻留性略逊于α-CD，但在高浓度时其不仅可在油/水界面发挥乳化作用，还可通过水相中的沉淀聚集，阻碍油滴间的碰撞和凝聚，提高乳液稳定性。