火麻籽多肽对高脂饮食喂养大鼠血脂的影响

魏连会，宋淑敏,，董 艳，石 杰，王娇娇，李宝龙，孙兴荣

（1.黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江中医药大学基础医学院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江省农业科学院大庆分院，黑龙江 大庆 163316）

慢性病已成为现代人类健康的头号威胁，高脂血症是脂质异常的一种很常见的慢性疾病，能够诱发如动脉粥样硬化、冠心病、脂肪肝、中风、糖尿病、高血压、心脏猝死等一系列疾病[1-3]。高脂血症引起的心脑血管疾病，发病率高，危害大，2008年，全世界约有1 730万 人死于心血管疾病，占全球死亡人数的48%，预计到2030年心血管疾病死亡率将达到2 330万 人[4-6]。

高脂血症极大威胁着人们的健康。目前，国内外的几个经典降脂药物，如他汀类、胆汁酸螯合剂、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA）还原酶抑制剂、纤维酸类、烟酸及其衍生物在临床中广泛应用[7]。这些降脂药物效果显着，但这些药物的使用对病人产生了一些副作用，其中包括骨骼肌毒性、皮肤过敏、肾功能受损、肝脏毒性、胃肠不适，因此急需开发新的降脂疗法，以减小对病人的伤害[8]。

目前，利用天然食品原料防治高脂血症的应用方面已有许多研究，天然食品中特效功能成分可有助于防病、治病[9-11]。从药食同源植物中提取功能活性物质用于血脂异常疾病的治疗，在医药、保健品领域受到了广泛的关注。从天然产物中获取具有降脂功能的活性物质用以预防和辅助治疗高脂血症可大大减少目前利用降脂药带来的副作用，具有重要意义。

生物活性肽具有易吸收、黏度低、低致敏性、加工性好等特点，目前已成为大健康时代的生物活性成分主角之一[12-13]。生物活性肽具有降血压、抗氧化、免疫调节、抗菌、抗血栓、促进矿物质吸收、降血脂等功能活性[14-16]。近年来新型的蛋白质多肽的降脂疗效被大量报道，如大豆多肽[17]、乳清蛋白肽[18]、糙米蛋白肽[19]、荞麦肽[20]、花生肽[21]、海马胶原蛋白肽[22]、卵黄蛋白肽[23]等，研究其降血脂活性及其相关机理，取得了一定的进展。

火麻（Cannabis sativaL.subsp.sativa）也称为汉麻、大麻、线麻、黄麻等，在中国和加拿大广泛种植，是一种重要的食品、纤维和医药植物。目前我国种植的大麻为无毒品种，四氢大麻酚质量分数低于0.3%。目前火麻籽已被开发成化妆品、医药食品、营养食品、功能保健食品[24]。火麻籽是火麻纤维化利用后的副产物，含有30%以上的油脂和25%以上的优质蛋白[25]。火麻籽中含有多种不饱和的脂肪酸，特别是亚油酸（ω-6）和亚麻酸（ω-3）含量丰富。火麻籽蛋白含有所有必需氨基酸，其中精氨酸含量特别丰富，达到了世界卫生组织规定的婴幼儿对必需氨基酸的需求标准，是一种优质的蛋白质[26]。火麻籽的药学功效在2000版的《中华人民共和国药典》和2001年“药食同源”名单均有记载[27]。目前已有学者对火麻籽分离蛋白的理化性质和功能特性进行了评价，并与大豆分离蛋白进行了比较，与大豆分离蛋白相比，火麻籽肽中的赖氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸的含量较低，而其他必需氨基酸的含量略高于或近似于大豆分离蛋白中的含量。此外，用不同的蛋白酶水解得到的火麻籽多肽被报道具有抗氧化性能[28]，抗氧化肽在慢性病的预防和治疗方面存在的潜在贡献，然而，关于火麻籽多肽在降血脂方面的研究却鲜见报道。本实验研究了火麻籽多肽对高血脂大鼠的降血脂及保肝作用，为火麻籽的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

健康SD大鼠，雄性，SPF级，体质量（200±20）g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，生产许可证号：SCXK（辽）2015-0001，使用许可证号：SYXK（黑）2018-007。

火麻籽多肽粉由黑龙江省科学院大庆分院自制；基础饲料 北京科澳协力饲料有限公司；高脂饲料（SCXK（京）2018-0006） 小黍有泰（北京）生物科技有限公司。基础饲料配方：20%酪蛋白（质量分数，下同）、0.3%胱氨酸、39.7%玉米淀粉、13.2%麦芽糊精、10%蔗糖、5%纤维素、7%豆油、0.0014%叔丁基氢醌、3.5%矿物质、1.0%维生素、0.25%胆碱酒石酸盐。高脂饲料配方：20%酪蛋白、0.3%胱氨酸、29.1%玉米淀粉、10%麦芽糊精、5%纤维素、2.5%豆油、1.0%矿物质、1.0%维生素、0.1%胆碱酒石酸盐、20%猪油、1.3%磷酸二钙、1.65%酒石酸氢钾、0.55%碳酸钙。

谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）检测试剂盒南京建成生物研究所。

1.2 仪器与设备

cobas c311全自动生化分析仪 瑞士罗氏公司；08-2G磁力搅拌器 上海梅颖浦仪器有限公司；JA5003型分析天平 上海柯祁仪器设备有限公司；DT1001型电子天平 东仪精密仪器中国有限公司；VFD-6000真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 火麻籽多肽的制备及分离纯化

按照本实验室的方法制备火麻籽多肽[24]：称取一定质量的火麻籽粕，按照火麻籽粕与水的质量比为1∶5加入蒸馏水溶解，按照终质量浓度30 g/L和4 g/L分别添加中性蛋白酶和木瓜蛋白酶在70 ℃、pH 5.0条件下酶解3 h；酶解后95 ℃水浴灭酶15 min，10 000 r/min离心15 min，分离取上清液，得到火麻籽多肽混合液。将酶解得到的火麻籽多肽混合溶液通过切向流膜过滤系统进行分离纯化，采用截留分子质量为1 kDa过滤膜过滤，收集分子质量小于1 kDa火麻籽多肽，用真空冷冻干燥机冻干备用。

1.3.2 大鼠分组及处理

屏障系统内饲养室温度为20～26 ℃，相对湿度为40%～70%，换气次数大于15 次/h（GB 14925—2010《实验动物 环境及设施》），昼夜明暗交替时间：12 h/12 h（7∶00～19∶00采用动物照明控制系统）。适应性饲养1 周后，将60 只成年雄性大鼠分成正常对照组（10 只）、模型组（50 只），正常对照组给予基础饲料，模型组饲喂高脂饲料4 周进行造模。饲喂4 周后测定大鼠体质量和血清中总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的浓度。大鼠造模成功后将模型组大鼠分为高脂模型组、阳性对照组（辛伐他汀）和火麻籽多肽低、中、高剂量组（800 mL/kgmb），每组10 只大鼠，且体质量无显着差异，正常对照组饲喂基础饲料，其他组饲喂高脂饲料，每日给阳性对照组灌胃10 mL/kgmb辛伐他汀，火麻籽多肽低、中、高剂量组分别灌胃200、400、800 mg/kgmb火麻籽多肽，继续饲养4 周，每天灌胃1 次，灌胃容积为10 mL/kgmb，期间大鼠自由进食。实验期间观察大鼠的精神状态、体态特征，每周固定时间称量一次体质量、摄食量。实验各剂量组给药剂量参照[2012]107号（国食药监保化）《辅助降血脂功能评价方法》设定。

1.3.3 指标测定

1.3.3 .1 全血黏度及血清指标的测定

对造模4 周的大鼠进行眼球内眦取血0.5 mL，3 000 r/min离心10 min，取上清液血清，采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的浓度。

饲喂8 周，大鼠末次灌胃后禁食12 h（不禁水），用质量分数10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，用肝素钠采血管，腹主动脉取血，取血液4 mL，采用cobas c311全自动生化分析仪测定血浆黏度和全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度。用普通采血管将大鼠血液采净，3 000 r/min离心10 min，取上清液血清，采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C浓度，按ALT、AST检测试剂盒说明书分别测定ALT、AST活力，按式（1）计算动脉硬化指数（atherosclerosis index，AI）[29]。

1.3.3 .2 脏器指数的测定

参考文献[30]记录大鼠处死前空腹体质量m0/g，大鼠处死后，解剖大鼠，迅速取出肝脏、心脏、肾脏和脾脏，用生理盐水洗去表面的残血，并用滤纸吸干，称量脏器质量m/g。按式（2）计算大鼠的脏器指数。

1.3.3 .3 肝脏切片观察

参照He Dongye等[7]的方法，将取出的肝脏固定在质量分数10%的中性缓冲福尔马林固定液中，脱水后嵌入石蜡内，切成6 μm厚的薄片，经苏木精-伊红染色后至光学显微镜下进行病理组织观察。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 17.0统计软件处理，各项指标以平均值±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两组间比较采用t检验，P＜0.05则表示有显着性差异，P＜0.01表示有极显着性差异。

2 结果与分析

2.1 火麻籽多肽干预前大鼠血脂指标

由表1可知，与正常对照组比较，高脂模型组大鼠的TG、TC、LDL-C水平极显着升高（P＜0.01），HDL-C水平极显着下降（P＜0.01），表明高血脂模型建模成功。

表1 火麻籽多肽干预前大鼠血脂指标（n=8）Table 1 Blood lipid indexes of rats before hemp seed peptide intervention (n= 8）

2.2 实验期间大鼠的体质量、摄食量变化

体质量最能直观反映大鼠是否发生病变[8]。由表2可知，大鼠的初始体质量基本一致，无显着差异（P＞0.05），经过8 周的连续喂养，各组大鼠的体质量都有不同程度的增加，高脂模型组体质量显着高于正常对照组（P＜0.05），说明饲喂高脂饲料能增加大鼠体质量。在同等饲喂条件下，阳性对照组和火麻籽多肽高剂量组最终体质量显着低于高脂模型组（P＜0.05），火麻籽低、中剂量组与高脂模型组无显着性差异（P＞0.05），说明火麻籽多肽干预时剂量越高，大鼠体质量增加越少，火麻籽多肽对高血脂大鼠体质量增加具有一定的抑制作用。火麻籽多肽干预期间，火麻籽多肽高、中、低剂量组大鼠的平均摄食量与模型对照组和阳性对照组相比无显着差异。因此，推测火麻籽多肽对大鼠食欲无抑制作用。

表2 火麻籽多肽对大鼠体质量、摄食量的影响（n=8）Table 2 Effect of hemp seed peptide on body mass and food intake of rats (n= 8）

2.3 火麻籽多肽对大鼠脏器指数的影响

脏器指数可以反映各组大鼠营养情况和机体脏器的病变情况，当内脏受到外来物质损害时，脏器指数会上下浮动，超出正常值，脏器外观、质量等会发生改变[31]。高血脂大鼠经过饲喂干预后，除肝脏外，其余器官无肉眼可见的病理性改变。正常对照组大鼠的肝脏鲜红、光滑、边缘清晰，高脂模型组与火麻籽多肽饲喂给药组肝脏脏呈现白色，体积明显增大。如表3所示，与正常对照组比较，高脂模型组肝脏指数极显着增加（P＜0.01），其他脏器指数无显着性变化（P＞0.05）。火麻籽多肽低、中剂量组及辛伐他汀组肝脏指数显着低于高脂模型组（P＜0.05），火麻籽多肽高剂量组与高脂模型组的肝脏指数差异极显着（P＜0.01），各组心脏指数、脾脏指数、肾脏指数之间均无显着性差异（P＞0.05）。说明饲喂高脂饲料能造成肝脏脂肪堆积、增生、肥大，而对其他心脏、脾脏、肾脏的影响较小。

表3 火麻籽多肽对大鼠脏器指数的影响（n =8）Table 3 Visceral organ indexes of rats after hemp seed peptide intervention (n= 8)

2.4 火麻籽多肽对大鼠血清指标的影响

高脂血症是血脂异常所致，其主要表现为血清中TC、TG和LDL-C水平过高或HDL-C水平过低[7]，是造成脑血栓的主要危险因素。血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平是评价动脉粥样硬化的重要指标[32]，AI用于表示动脉硬化的危害性，衡量动脉硬化的程度及其心血管发病率[33]。由表4可知，大鼠高脂模型组与正常对照组比较，饲喂8 周后TG、TC、LDL-C水平及AI极显着增加（P＜0.01），HDL-C水平极显着下降（P＜0.01）。与高脂模型组比较，辛伐他汀组和火麻籽多肽中、高剂量组均能显着降低TC、TG和LDL-C水平和AI（P＜0.05），显着升高HDL-C水平（P＜0.05），火麻籽多肽低剂量组能够显着降低TC、TG和LDL-C水平（P＜0.05），但对HDL-C水平及AI影响无显着性差异（P＞0.05）。结果表明火麻籽多肽在一定的范围内，对大鼠高脂血症及动脉硬化具有一定的预防作用。

表4 火麻籽多肽对大鼠血脂水平的影响（n=8）Table 4 Effect of hemp seed peptide on blood lipid levels of rats (n= 8)

2.5 火麻籽多肽对大鼠血清ALT、AST活力的影响

肝细胞被损害时ALT和AST会渗进血液，因此血清ALT和AST水平被作为评估肝细胞损伤的重要指标[34]，可评价肝脏的受损程度。由表5可知，与正常对照组比较，大鼠高脂模型组的ALT和AST水平显着升高（P＜0.05或P＜0.01）。与高脂模型组比较，辛伐他汀组与火麻籽多肽中、高剂量组AST、ALT活力显着降低（P＜0.05）；火麻籽多肽低剂量组AST活力显着降低（P＜0.05），ALT活力无显着性变化（P＞0.05）。结果表明，火麻籽多肽对大鼠肝脏具有一定的保护作用，能缓和高血脂对肝脏的伤害。

表5 火麻籽多肽对大鼠血清ALT、AST活力的影响（n =8）Table 5 Effect of hemp seed peptide on serum ALT and AST activities in rats (n= 8)

2.6 火麻籽多肽对大鼠全血黏度的影响

全血黏度是表征血液流变学的重要指标，黏度越高，流变性越差，越容易导致组织的局部缺血。采用cobas c311全自动生化分析仪检测3 个不同切变速率（3、30、200 s－1）下的大鼠全血黏度、血浆黏度。如表6所示，高脂模型组在低、中、高切变速率下全血黏度及血浆黏度与正常对照组比较极显着升高（P＜0.01）；与高脂模型组比较，辛伐他汀组及火麻籽多肽低、中、高剂量组在不同切变速率下的大鼠全血黏度及血浆黏度显着降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.7 火麻籽多肽对大鼠肝组织病理变化的影响

如图1所示，正常对照组大鼠肝组织中肝小叶结构清晰完整，肝窦清晰可见，肝细胞排列紧密，整齐有序且形态正常，胞浆内未出现脂肪空泡、无脂肪变性和脂肪坏死等现象。高脂模型组中肝小叶结构不清晰，细胞排列松散无序，有大量脂肪空泡的出现，肝细胞体积变大且部分坏死，中央静脉附近的肝细胞排列紊乱，形态不完整，肝细胞损伤严重，呈现脂肪性肝病的组织病理学现象[35]。与高脂模型组相比，辛伐他汀组及火麻籽多肽低、中、高剂量组对肝小叶结构有不同程度的改善，肝细胞的脂肪变性程度降低，胞浆内的脂肪滴空泡减少，肝细胞排列整齐，其中火麻籽多肽中、高剂量组及辛伐他汀组改善效果最明显，说明火麻籽多肽对大鼠脂肪肝变性程度具有改善作用。

图1 火麻籽多肽对大鼠肝组织切片的影响（×400）Fig.1 Effect of hemp seed peptide on liver histomorphology in rats (× 400)

3 讨 论

本研究通过饲喂高脂饲料，建立高脂血症大鼠模型，分别灌胃阳性药物和不同剂量的火麻籽多肽，8 周后，从大鼠的体质量、脏器、理化指标方面分析火麻籽多肽对高脂饮食喂养大鼠的影响，并通过大鼠的肝脏病理切片，观察高脂饮食喂养大鼠的受损程度、阳性药物及火麻籽多肽干预后，肝脏的改善情况。

高脂血症是由脂蛋白代谢异常引起的慢性疾病，主要包括TC、TG、和LDL-C含量升高或HDL-C降低等，由于脂类物质的异常代谢使血脂异常升高而导致高脂血症，而脂类物质的代谢是要受到生物体体内多种酶的调控，其中有一些酶在脂类代谢中发挥着关键作用或起到限制代谢反应速率的作用。

TC在肝脏中的3 条主要的代谢途径为内源性TC合成、TC向胆汁酸的转化以及低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDL-R）对低密度脂蛋白的接受途径[36]。3-羟基-3-甲基-戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutharyl-coenzyme A reductase，HMGR）是胆固醇合成的限速酶，HMGR可以对胆固醇合成的前体物质——甲基二羟戊酸（methyldihydroxyvaleric acid，MVA）的形成起到催化作用，从而增加了体内胆固醇的合成[37]。高密度脂蛋白是一种抗动脉粥样硬化的脂蛋白，可以将血液中过剩的胆固醇转运至肝脏，是体内脂质的清道夫。卵磷脂胆固醇酰基转移酶是参与胆固醇逆转运过程的重要酶，它的主要功能是催化成熟的高密度脂蛋白将胆固醇以载脂蛋白的形式转运回肝脏进一步代谢[38]。乙酰辅酶A乙酰基转移酶2是催化游离胆固醇与脂蛋白结合生成胆固醇酯的关键酶，对于胆固醇在体内的储存和吸收起到重要的调控作用[38]。乙酰辅酶A乙酰基转移酶2主要在小肠和肝脏中表达，若其活性或基因的表达受到抑制会降低酯化胆固醇的生成，从而抑制胆固醇的吸收代谢。肝脏中的7α-羟化酶不仅可以促进胆固醇的代谢，同时对于胆固醇的逆向转运也具有一定的促进作用。7α-羟化酶可以通过促进体内过多的胆固醇排出体外，从而起到了减少胆固醇在体内的积累[39]。血浆中低密度脂蛋白与内源性胆固醇结合形成LDL-C，LDL-C通过与LDL-R的结合被降解和转化。LDL-R是肝脏细胞中LDL-C的受体，负责调控血液中LDL-C转运至肝脏，从而清除血液中的LDL-C。因此，通过激活LDL-R，促进机体对LDL-C的降解，可以促进胆固醇的分解代谢。摄入体内的胆固醇必需以结合脂蛋白的形式才能进入代谢循环，而LDL-R是决定LDL-C能否被降解代谢的关键因子[40]。

TG是由脂肪酸和甘油结合形成的，脂肪酸合成以乙酰辅酶A为起始原料，乙酰辅酶A在一系列酶的作用下生成脂肪酸，脂肪酸与甘油合成TG，TG合成途径中，脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）是关键酶，如果FAS基因表达量升高，脂肪酸的合成量就会增加，甘油三酯合成量也随之增加。可通过抑制脂肪酸合成通路中FAS的表达水平而抑制脂肪酸的合成，最终降低血清TG水平[41]。与高脂模型组相比，火麻籽多肽中、高剂量组均能显着降低血清中TC、TG、LDL-C水平和AI（P＜0.05），显着升高HDL-C水平（P＜0.05），可能原因是火麻籽多肽激活了TC、TG代谢通路的关键酶，进一步调节血脂代谢以达到降血脂作用。

高脂饮食可引起血脂异常，导致肝脏脂代谢紊乱，脂肪在肝脏过度堆积，出现非酒精性脂肪肝、脂肪性肝炎甚至肝硬化，其中脂质代谢紊乱是肝脏损伤的一个重要因素[42]。肝脏具有去氧化、储存肝糖原等作用，是人和动物体内的代谢中心，能参与体内的多个生理过程。肝脏中含有大量的AST与ALT，在正常状态下，AST和ALT只存在于细胞内，当细胞膜受到刺激时AST和ALT被释放到胞外，会导致血液中AST和ALT活力升高[43]。TG蓄积会导致脂质代谢障碍，加重肝损伤程度，故临床上一般通过测定血清中AST、ALT活力和肝脏中TG活力来判断肝损伤程度[44]。本研究通过测定高脂饮食喂养大鼠血清中ALT和AST的活力，分析火麻籽多肽对高脂饮食喂养大鼠的肝脏是否有保护作用。根据数据分析可知，与高脂模型组比较，阳性药物及中、高剂量的火麻籽多肽能显着降低ALT和AST活力（P＜0.05），低剂量的火麻籽多肽能显着降低AST水平（P＜0.05），但对ALT水平无显着影响（P＞0.05），可能的原因是低剂量的火麻籽多肽对高脂饮食喂养大鼠肝脏的保护作用较小，使血清中ALT水平降低不明显。通过肝脏组织病理切片观察，火麻籽多肽低、中、高剂量对肝小叶结构、肝脏脂肪变性程度有不同程度的改善，这一结果与火麻籽多肽改善肝脏中AST与ALT活力相一致，说明在一定范围内，火麻籽多肽对肝脏具有保护作用。

综上所述，火麻籽多肽能够调节喂食高脂饲料致大鼠高脂血症模型的血脂水平，减轻肝脏脂肪变性程度，有望成为安全有效的抗高脂血症保健食品，本研究为汉麻籽多肽的开发利用提供了理论依据。