禽蛋中氟苯尼考代谢物快速检测方法的建立

皮江一，胡家勇，汪 薇，刘国娇，林 津，周陶鸿*

（湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心，湖北 武汉 430075）

在我国食品安全和环保的双重要求下，水产畜禽用药提倡无抗或少抗，因此国家对抗生素的管控也更加严格，杜绝副作用大、对人和动物有危害的药物滥用[1-2]。但是在养殖环境中，积少成多的病害如果得不到及时控制，经济损失将会非常巨大，因此预防和杀菌力强、安全性高、耐药性低的药物如氟苯尼考（florfenicol，FF）深受青睐[3]。但是，药物滥用会导致畜禽及水产中有较高剂量的药物残留，人体长期摄入含有该类抗生素残留的食物易导致细菌耐药性增加、过敏反应和体内菌群失调等症状[4-5]。如不规范使用此类抗生素，这个用在动物病原体的“核武器”未来会对人类自身安全造成危害[6-7]。

FF又称氟甲砜霉素，是一种新型氯霉素（chloramphenicol，CAP）类动物专用广谱抗生素，该药物抗菌广谱，安全高效，对众多畜禽细菌性疾病的治疗效果显着，FF一般通过饲料添加或者家禽疾病治疗从而广泛在水产及畜禽体内残留并积累[8-9]。FF对鸡的生殖系统有消炎作用，但同时会轻度抑制生殖激素的产生，造成鸡蛋早期胚胎的死亡，所以235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》规定“家禽限量（产蛋禁用）”[10]。FF的主要代谢物有氟苯尼考胺（florfenicol amine，FFA）、氟苯尼考醇、氟苯尼考草氨酸等，且FFA是组织中最主要的代谢物[11-13]，因此GB 31650—2019《食品中兽药最大残留限量》以FF及FFA含量之和作为动物体内FF的残留标志物，且标准明确规定家禽产蛋期禁用。

目前国内研究动物食品中FF及其主要代谢物FFA的检测方法多为色谱、质谱、电位、酶联免疫检测[14-19]等方法，这些方法只适用于专业实验室检测，不适用于日常快速检查、重大活动保障、案件查办等；胶体金免疫层析技术[20-21]是近些年快速发展起来的一种检测方法，具有简单、快速、成本低等优点，目前FF胶体金免疫层析方法较为成熟，但是关于FF的代谢物FFA快速检测的相关研究却寥寥无几，本研究旨在通过将代谢物FFA衍生化为FF从而实现FF残留标志物的检测，进而为规范我国FF的使用，以及为食品安全监管部门提供技术支撑，满足食品安全执法“即时查、现场办”的实际需求，本实验以鸡蛋为研究对象，建立禽蛋中FF及其代谢物的免疫层析同步快速检测方法，为日常监管、案件稽查提供简便、快捷、准确的技术支撑，提高监管效率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋，监督抽检农贸市场采购。用于检测的3 种禽蛋中FF快速检测盒分别购买于武汉华美生物工程有限公司、深圳市宝安康生物技术有限公司和北京赞普生物技术有限公司。

FF、FFA、CAP、甲砜霉素（thiamphenicol，TAP）北京曼哈格生物科技有限公司；二氯乙酸酐（纯度97%） 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；硼酸缓冲液（0.2 mol/L，pH 9）、其他试剂均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

M204型电子天平 梅特勒-托利多国际贸易有限公司；WXHEY-08涡旋混合器、YPNSY-12便携式样品浓缩仪 武汉华美生物有限公司；API 5500型三重四极杆串联质谱仪、4500高效液相色谱仪 美国AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 FF残留物提取实验

根据鸡蛋中FF及FFA代谢模型[22-23]，实验将阴性鸡蛋搅拌液分为8 组，在前4 组鸡蛋搅拌液中加入一定量FF标品，后4 组蛋液中加入FFA标品，使得蛋液样品中FF及FFA含量分别为5、50、100、150 µg/kg。分别称取3 g（精确至0.01 g）蛋液于15 mL离心管内，加入体积比99%乙酸乙酯-1%氨水提取溶液2 mL，轻微颠倒30余次以充分混合样品，但要避免形成乳化物，于25 ℃、4 000 r/min离心5 min后取上清液，经便携式氮吹仪40 ℃吹干，用5.0 mL体积分数30%甲醇溶液定容，混匀，液体过0.22 μm滤膜，供液相色谱-质谱仪测定其回收率，测定条件参照SN/T 1865—2016《出口动物食品中甲砜霉素、氟甲砜霉素和FFA残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》[24]。

1.3.2 FFA衍生化及测定

吸取0.5 mL上清液，用盐酸溶液中和氨水至pH值为7.0后，加入2 μL二氯乙酸酐迅速涡旋振荡3 min，将涡旋后液体经便携式氮吹仪40 ℃吹干后加入等体积硼酸缓冲液复溶，复溶后液体经液相色谱-质谱仪和飞行时间高分辨率质谱仪检测。高分辨静电场轨道阱质谱采集参数：电喷雾电离源，喷雾电压3 kV，正离子模式；一级全扫描分辨率R=120 000，扫描范围m/z100～1 000，二级采用数据依赖扫描，达到设定阈值后触发二级碎裂，二级扫描分辨率R=60 000；自动增益控制目标离子数为5×105，质量偏差窗口为5×10－6，高能碰撞裂解碎裂能量为（40±15）%，离子源温度325 ℃，离子传输杆温度350 ℃，鞘气265 kPa，辅助气70 kPa。

1.3.3 方法检出限与结果判定

将一定浓度的FF及FFA标准品添加于10 组阴性鸡蛋液中混匀，使FF加标含量为0、1、2、3、5 µg/kg，FFA加标含量为0、1、2、3、5 µg/kg，按照上述前处理提取步骤和衍生化步骤进行处理，涡旋后的液体经衍生化及浓缩仪空气吹干后，加入等体积硼酸缓冲液复溶，使得复溶后待测液pH值在6～9之间，取150 µL样液加入胶体金免疫层析检测卡样品孔中。如试剂盒中包含有金标微孔，将150 µL样液与金标微孔中的金标抗体混匀，室温孵育2 min后再滴入至样品孔中，室温放置5～8 min后进行结果判定[25]。

1.3.4 方法特异性与加标样品检测

本方法选用的检测卡为FF检测卡，用所选用的检测卡分别检测FFA、CAP、TAP和FF加标样品，设最低样品检测浓度为Y，按下式计算测定该方法对加标样品的交叉反应率。

在阴性鸡蛋样品中分别添加10、20、50、100 µg/kg的FF单标、FFA单标、FF/FFA混标，制成3 组加标样本，用高效液相色谱-质谱联用仪对加标样本进行含量检测，液相条件及质谱条件参照SN/T 1865—2016[24]，分析其准确度和重复性。

1.4 数据统计分析

使用SPSS19.0统计软件进行数据分析处理，采用Microsoft Excel 2007进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 提取条件优化

2.1.1 提取溶剂选择

根据FF及FFA化学性质，FF在二甲基甲酰胺中极易溶解，在甲醇和冰醋酸中略溶，微溶于水，溶于有机溶剂。代谢物FFA极性强，易溶于水，不溶于有机试剂，溶解时可用少许纯净水溶解，然后加入有机溶剂溶解，国内外关于禽蛋中FF和FFA的提取方法有许多报道[26-28]，提取剂一般为乙酸乙酯、乙腈、丙酮等。所以实验选取4 种提取溶剂作比较：乙腈、99%乙酸乙酯-1%氨水、50%乙腈-50%乙酸乙酯、硼酸提取液。乙腈可沉淀蛋液中的蛋白，减少内源杂质，有利于样品的净化，由于有机溶剂无法上样检测，需用空气吹干后用复溶剂复溶后上样，而乙腈挥发较慢，且提取实验表明乙腈提取目标物质效率较差，回收率较低；乙腈-乙酸乙酯虽能有效提取样品中的FF和FFA，但同样由于残留乙腈的吹干较为缓慢，所以不适合胶体金免疫层析法的快速检测，且回收率较低；硼酸提取液可直接上样检测，但蛋液中蛋白、脂质等使得样液在样品垫上难以延展；乙酸乙酯可有效提取组织中FF，在偏碱性环境中同样有效提取FFA，且乙酸乙酯易吹干，但在提取过程中需要注意的是与样品混合过程中需轻缓摇晃，避免其形成持久乳化液。而本实验采用99%乙酸乙酯-1%氨水作为提取溶剂，其加标回收率均大于80%。FF和代谢物FFA的添加回收率及相对偏差结果见表1。

表1 鸡蛋中FF和FFA的添加回收率（n=5）Table 1Recoveries of florfenicol and florfenicol-amine from spiked egg ssamples (n= 5)

2.1.2 复溶溶剂确定

实验得出最适复溶溶剂为0.2 mol/L硼酸缓冲液（pH 9.0），加入体积分数0.4%曲拉通100，质量分数0.05%酪蛋白钠。硼砂缓冲液主要起缓冲作用，稳定整个体系的pH值；曲拉通100、酪蛋白具备良好的表面活性性能，能降低油-水界面的张力，使蛋白样液能够形成稳定的体系，以便样本能够在试纸条上均匀爬动。

2.1.3 加样量选择

分别吸取50、100、150、200、300 μL样品待测液（样品中分别添加了50 μg/kg FF、50 μg/kg FFA共2 组标准品）于胶体金加样孔中。结果表明，当取样量为150 μL时，检测结果重复性好，C线和T线颜色区分明显，利于判断，故FF及FFA的检测加样量均选择150 μL。

2.2 衍生试剂的选择

FF是CAP的结构同系物，化学名称为D(+)-苏-对甲砜基苯基-2-二氯乙酰氨基-3氟丙醇，分子式为C12H14Cl2FNSO4，相对分子质量为358.2；FFA分子式为C10H15ClFNSO3，相对分子质量为283.75。研究表明，FF的主要代谢产物有FFA、氟苯尼考醇和氟苯尼考草氨酸等[29-30]（图1），FFA是在动物肝脏中残留时间最长的代谢物[31]，因此以FFA作为休药期计算的标志残留物，且FF及其代谢产物在酸条件下水解能够全部衍生化为无活性的FFA。通过结构分析，FFA在酸性条件下可以衍生化为FF，由于二氯乙酸酐不稳定，水解后的羟基基团与FFA氨基结合，从而实现FF的衍生化，其反应机理如图2所示。

图1 FF主要代谢产物Fig.1 Metabolism of florfenicol

图2 FFA衍生化反应Fig.2 Derivatization reaction of florfenicol-amine

2.3 FFA衍生产物分析

如图3所示，FFA衍生物和FF标准品保留时间一致；将FFA衍生物进行高分辨质谱采集一级全扫和数据依赖二级扫描并与FF标准质谱图进行参考比对（图4、5），结果表明，其特征峰在m/z170、206、241、254处与FF标准品的特征峰一致。以上结果可以得出FFA衍生化实验的产物中中存在FF，且FF的衍生化效率在35%左右。

图3 FF标准溶液（a）和FFA衍生物（b）色谱图Fig.3 Chromatograms of florfenicol standard solution (a) and florfenicol-amine derivative (b)

图4 FF标准溶液色谱图（a）和质谱图（b）Fig.4 Gas chromatogram (a) and mass spectrum (b) of florfenicol standard solution

图5 FFA衍生物色谱图（a）和质谱图（b）Fig.5 Gas chromatogram (a) and mass pectrum (b) of florfenicolamine derivative

2.4 免疫层析试纸检出限与结果分析

如图6所示，用FF试纸条检测（比线法），FF含量为1 μg/kg时，C线的颜色明显比T线深，结果为阳性，因此FF检出限为1 μg/kg；FFA含量为3 μg/kg时，C线的颜色明显比T线深，为阳性结果，因此FFA检出限为3 μg/kg，与FFA衍生反应衍生化率为35%保持一致。实验检出限均低于SN/T 1865—2016[24]10 μg/kg的检出限。

图6 FF（a）和FFA（b）检出限Fig.6 Detection limits of florfenicol (a) and florfenicol-amine (b)

2.5 方法特异性及样品测定结果

2.5.1 特异性分析

如表2所示，当待检物为FFA时，交叉反应率小于0.3%。当待检物为FF、TAP和CAP时，交叉反应率分别为100.0%、20.0%和2.0%。这是由于FF是TAP的氟化物，也是CAP的第3代产物，三者都是CAP类药物，结构上比较相似，因此TAP、CAP能与FF单克隆抗体发生交叉反应，而FFA作为FF代谢物却不能与FF单克隆抗体发生交叉反应，用FF检测卡检测FFA，需先将其衍生为FF再进行检测。

表2 特异性实验结果Table 2Specificity of colloidal gold test strip

2.5.2 方法假阳性率、假阴性率

FF阴性样本40 份、模拟阳性样本40 份，FFA阴性样本40 份、模拟阳性样本40 份，其假阳性率、假阴性率测试结果见表3，其加标样品的假阳性率和假阴性率均为0%。

表3 假阳性率、假阴性率测定结果Table 3False positive and false negative rates

2.5.3 准确度与重复性分析

在空白鸡蛋样品中添加10、20、50、100 μg/kg的FF单标、FFA单标、FF/FFA混标，制成3 组加标样本，用高效液相色谱-质谱联用仪对加标样本进行含量检测，检测结果与加标理论值比较一致。按照此方法对加标样本进行快速检测，检测结果见表4，检测结果与加标样本的理论结果符合率为100%，表明该方法准确度较高。此外，20 次重复结果一致，表明此方法重复性良好。

表4 准确性与重复性评价结果（n= 20）Table 4Accuracy and repeatability of the method (n= 20)

3 结 论

本研究通过将鸡蛋中FF主要代谢产物FFA简单地预处理，并使FFA衍生为FF，为快速检测禽蛋中FF及FFA提供了理论基础和新的思路，且该处理方法可用于市面绝大部分FF检测卡，实验分别对3 种品牌的FF试纸条进行了测试，实际样品的检测结果较为理想。本方法具备操作简单，稳定性好，灵敏度高等特点，且一条试纸卡可同时满足禽蛋中FF及代谢物FFA定性的检测，避免了FF及代谢物FFA单独检测，省时省力，适合于现场大批量的快速筛查，为日常监管、案件稽查提供简便、快捷、准确的技术支撑，且具备较好的应用前景。