壳聚糖处理对西番莲果实感病指数、抗病相关酶活性和抗病物质含量的影响

郭 欣，林育钊，林河通,*，李 倩，段睿琦，朱文婧

（1.漳州职业技术学院食品工程学院，福建 漳州 363000；2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；3.亚热带特色农产品采后生物学福建省高校重点实验室，福建 福州 350002）

西番莲（Passiflora caeruleaL.）俗称百香果、洋石榴，广泛分布于热带和亚热带地区。西番莲果实在常温下不耐贮藏，果皮失水皱缩现象严重，易发生褐变及出现病斑，导致鲜果贮藏品质下降[1-2]。其中，由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、烟草疫霉（Phytophthora nicotianaeB.de Haan）、灰霉菌（Botrytis cinerealPers.）和菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bary）等真菌侵染引起的采后果实病害是西番莲采后品质劣变发生的重要原因之一[3]。如何减少西番莲果实采后病害造成的损失已成为西番莲果实采后商品化处理、实际生产等亟待解决的问题。目前对西番莲果实采后病害的防治主要采用二氯异氰尿酸钠和丙氯灵等化学防腐剂浸泡处理。然而，化学防腐剂的滥用可能会导致果皮表面残留并增强病原菌抗药性，同时有致癌风险以及污染环境等危害[4]。因此，迫切需要研究采后西番莲果实非化学防腐剂处理的绿色保鲜技术，以控制果实采后病害发生、提高果实采后品质。

壳聚糖又称脱乙酰甲壳素，是一种天然、安全、环保的食品保鲜剂[5]。据报道，壳聚糖可通过诱导果蔬采后抗病性来有效地抑制病害的发生，从而延长采后果蔬的货架期[6-7]。有研究报道，使用壳聚糖溶液浸泡处理葡萄果实和哈密瓜，可增强果实对病原菌的抵抗能力，并且延缓果实色泽转变[8]；5 g/L的壳聚糖和壳寡糖处理能诱导生姜苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）和β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活性及影响PAL、GLU编码基因的转录水平，提高总酚含量，从而减少根茎由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）造成的腐烂[9]。荔枝果实采后经壳聚糖处理后，能提高果实PAL、几丁质酶（chitinase，CHI）、GLU等抗病相关酶活性及木质素含量，进而降低荔枝霜疫霉菌（Peronophythora litchi）所致采后病害的发生[10]。但有关壳聚糖处理对西番莲果实采后病害发生的影响效果及其作用机理尚不清楚。当前，常用粉末型的壳聚糖用于新鲜 果蔬的采后处理。但是，粉末型的壳聚糖在用于新鲜果蔬采后处理之前，应将其溶解在适当的酸溶液中，之后再用碱将壳聚糖溶液调节至适当的pH值范围，以上制备壳聚糖溶液的过程应花费数小时甚至数天才能完成，因此，粉末型的壳聚糖用于果蔬采后处理不太方便。卡多赞（Kadozan）是一种新型的液态壳聚糖，可以用水稀释得到所需浓度，而无需用酸溶解，也无需用碱调节pH值，卡多赞溶液浸泡是一种方便的新鲜果蔬采后处理方法。本课题组前期研究发现，不同浓度壳聚糖处理都能较好维持采后西番莲果实贮藏品质，提高其果实耐贮性，其中，以卡多赞稀释200 倍的保鲜处理效果最好[11]。本实验研究稀释200 倍的卡多赞处理对采后西番莲果实感病指数、抗病相关酶活性和抗病物质含量的影响，旨在阐明壳聚糖处理控制西番莲果实采后病害发生及其作用机理，为壳聚糖在西番莲果实采后保鲜中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料为福建省长泰县岩溪镇果园生产的‘福建百香果1号’西番莲，在果实九成熟采收，果实采后3 h内运至福建农林大学食品贮藏保鲜实验室，之后进行果实选别，选择色泽统一、大小均匀、无机械损伤和无病虫害的西番莲果实进行实验。

卡多赞 利统股份有限公司（上海分公司）；冰醋酸、昆布多糖、p-香豆酸、氯化钡、丙酮、四硼酸钾、3,5-二硝基水杨酸、β-巯基乙醇、抗坏血酸 南京化学试剂股份有限公司。

1.2 仪器与设备

DRX-260人工气候箱、LFP-800T型多功能粉碎机 宁波 江南仪器厂；FA1104N电子天平、ST-360酶标仪 杭州托普仪器有限公司；KH19A高速冷冻离心机 上海 美谱达仪器有限公司；电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 西番莲预处理

本课题组在预实验中采用蒸馏水（对照）和不同浓度卡多赞（稀释50、100、150、200、250 倍）的溶液浸泡处理西番莲果实5 min，之后用聚乙烯薄膜袋（厚度0.015 mm）包装，在相对湿度（relative humidity，RH）80%、（28±1）℃条件下贮藏15 d，其果实商品率分别为14%、20%、36%、46%、57%、27%，结果表明，稀释200 倍卡多赞溶液处理的西番莲果实商品率最高，保鲜效果最好[11]。因此，采用卡多赞稀释200 倍的浓度开展后续实验。

将挑选、清洗的西番莲果实随机分为壳聚糖处理组和对照组，壳聚糖处理组浸泡在稀释200 倍的卡多赞溶液中5 min；对照组浸泡在蒸馏水中5 min。将浸泡处理后的西番莲果实取出、晾干表面水分，之后用聚乙烯薄膜袋（厚度0.015 mm）包装，每袋装10 个西番莲果实，每一组处理50 袋。经包装后的西番莲果实在RH 80%、（28±1）℃的人工气候箱中贮藏。贮藏期间，每隔3 d取30 个西番莲果实（3 袋），用于测定果实感病指数、果皮抗病物质含量和抗病相关酶活力等指标。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 果实感病指数测定

参照Jiang Χuanjing等[10]的方法将果实表面病斑分为 5 个级别，按下式计算感病指数。

1.3.2.2 果皮抗病物质含量测定

木质素质量分数的测定参照鞠志国等[12]的方法；总酚含量测定参照Lin Yifen等[13]的方法，用没食子酸（gallic acid，GA）作标准曲线，结果以每千克鲜果皮中的GA质量表示，单位为g/kg。

1.3.2.3 果皮抗病相关酶活力测定

PAL活力测定参照Zhang Zhanquan等[14]的方法，肉桂酸-4-羟化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酰辅酶A（4-coumarate CoA ligase，4-CL）活力测定参照Gao Hui等[15]的方法，肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）活力测定参照宋小飞等[16]的方法，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活力测定参照王菊华等[17]的方法。CHI和GLU活力测定参照曹建康等[18]的方法。蛋白质含量参照曹建康等[18]的考马斯亮蓝G250染色法测定，以牛血清白蛋白作标准曲线。上述酶活力结果蛋白质量计。

1.4 数据处理与分析

所有指标都重复测定3 次，取平均值。采用SPSS 22.0 分析软件对数据进行处理，采用T-检验法进行显着性分析。采用Origin软件作图。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖处理对采后西番莲果实感病指数和外观品质的影响

如图1、2所示，西番莲果实感病指数、果实外观品质劣变程度和采后病害发生严重程度都随采后贮藏时间的 延长而呈上升趋势。对照组西番莲果实在采后第3天已开始出现病害症状，其果实感病指数、果实外观品质劣变程度和采后病害发生严重程度在采后整个贮藏期急剧升高。与对照组果实比较，壳聚糖处理组西番莲果实感病指数、果实外观品质劣变程度和采后病害发生严重程度在整个贮藏期间都保持在较低水平，至贮藏第15天，壳聚糖处理的果实感病指数为2.21，仅为同时期对照组果实感病指数（3.99）的55.39%。在贮藏3～15 d期间，壳聚糖处理组西番莲果实感病指数显着低于对照组果实 （P＜0.05、P＜0.01）。以上结果显示，壳聚糖处理可显着抑制采后西番莲果实病害的发生。

图1 壳聚糖处理对采后西番莲果实感病指数的影响Fig.1 Effect of chitosan treatment on disease index of harvested passion fruit

图2 壳聚糖处理对采后西番莲果实外观品质的影响Fig.2 Effect of chitosan treatment on appearance quality of harvested passion fruit

2.2 壳聚糖处理对采后西番莲果皮木质素质量分数和总酚含量的影响

从图3A可知，对照组及壳聚糖处理组西番莲果实的果皮木质素质量分数均呈先上升后下降趋势。对照组西番莲果实的果皮木质素质量分数在贮藏0～9 d内缓慢上升，9～15 d内缓慢下降。而壳聚糖处理组西番莲果实的果皮木质素质量分数在贮藏0～9 d内快速上升，9～12 d内略有下降，贮藏12 d之后快速下降。进一步比较发现，在贮藏3～15 d期间，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮木质素质量分数显着高于对照组（P＜0.05）。

图3 壳聚糖处理对采后西番莲果皮木质素质量分数（A） 和总酚含量（B）的影响Fig.3 Effect of chitosan treatment on contents of lignin (A) and total phenols (B) in pericarp of harvested passion fruit

从图3B可知，对照组及壳聚糖处理组西番莲果实的果皮总酚含量总体均呈下降趋势。但与对照组果实相比，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮总酚含量下降较缓慢，贮藏至第15天时，其果皮总酚含量与贮藏前相比仅减少23.3%，而对照组果实的果皮总酚含量则减少了56.6%。显着性分析结果表明，在贮藏3～15 d期间，壳聚糖 处理组西番莲果实的果皮总酚含量极显着高于对照组 （P＜0.01）。

2.3 壳聚糖处理对采后西番莲果皮PAL、C4H、4-CL、CAD活力的影响

如图4A所示，对照组西番莲果实的果皮PAL活力在贮藏0～3 d内快速上升，3～6 d内急剧下降，6～9 d内快速上升，但在贮藏9～15 d内缓慢下降。而壳聚糖处理组西番莲果实的果皮PAL活力在贮藏0～3 d内急剧上升，3～6 d内快速下降，但在贮藏6～12 d内缓慢上升，贮藏12 d之后则缓慢下降。与对照组果实比较，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮PAL活力在整个贮藏期间都保持在较高水平。显着性分析结果表明，在贮藏3～15 d期间，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮PAL活力极显着高于对照组（P＜0.01）。

图4 壳聚糖处理对采后西番莲果皮PAL（A）、C4H（B）、 4-CL（C）和CAD（D）活力的影响Fig.4 Effect of chitosan treatment on activities of PAL (A), C4H (B), 4-CL (C) and CAD (D) in pericarp of harvested passion fruit

如图4B所示，贮藏期间，对照组和壳聚糖处理组西番莲果实的果皮C4H活力整体均呈上升趋势。对照组西番莲果实的果皮C4H活力上升较缓慢，如贮藏至第15天时，其果皮C4H活力相比0 d仅上升45.18%。而壳聚糖处理组西番莲果实的果皮C4H活力上升较快，且在整个贮藏期间都保持在较高水平，如贮藏至第15天时，其果皮C4H活力相比0 d增幅高达168%。显着性分析结果表明，在贮藏9～15 d期间，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮C4H活力极显着高于对照组（P＜0.01）。

如图4C所示，对照组西番莲果实的果皮4-CL活力在贮藏0～6 d内略有上升，6～9 d内快速上升，但在贮藏9～12 d内快速下降，贮藏12 d之后则缓慢上升。而壳聚糖处理组西番莲果实的果皮4-CL活力在贮藏0～3 d内急剧上升，3～6 d内快速下降，6～9 d内快速上升，6～12 d内缓慢上升，贮藏12 d之后则缓慢下降。与对照组果实比较，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮4-CL活力在整个贮藏期间都保持在较高水平。显着性分析结果表明，在贮藏第3、12天和第15天时，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮4-CL活力均极显着高于对照组（P＜0.01）。

如图4D所示，对照组西番莲果实的果皮CAD活力在贮藏0～3 d内缓慢上升，3～6 d内缓慢下降，贮藏6 d之后则快速下降。而壳聚糖处理组西番莲果实的果皮CAD活力在贮藏0～3 d内快速上升，3～6 d内快速下降，贮藏6 d之后则缓慢下降。与对照组果实比较，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮CAD活力在整个贮藏期间都保持在较高水平。显着性分析结果表明，在贮藏第3天及贮藏9～15 d时，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮CAD活力都极显着高于对照组（P＜0.01）。

以上结果显示，壳聚糖处理能诱导提高采后西番莲果皮PAL、C4H、4-CL、CAD活力，促进木质素等抗病物质的合成。

2.4 壳聚糖处理对采后西番莲果皮PPO和POD活力的影响

如图5A所示，对照组西番莲果实的果皮PPO活力在贮藏0～3 d内较快下降，在贮藏3～6 d内缓慢上升，贮藏6～9 d内缓慢下降，贮藏9 d之后则较快上升。而壳聚糖处理组西番莲果实的果皮PPO活力在贮藏0～3 d内略有下降，在贮藏3～9 d内快速上升，在贮藏9～15 d内快速下降。与对照组果实比较，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮PPO活力在整个贮藏期间都保持在较高水平，如在贮藏至第9天时，其果皮PPO活力比对照组果实高53.3%。显着性分析结果表明，在贮藏6～12 d内，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮PPO活力极显着高于对 照组（P＜0.01）。

如图5B所示，对照组西番莲果实的果皮POD活力在贮藏0～3 d内略有上升，3～9 d内较快下降，贮藏9～15 d内则较快上升。而壳聚糖处理组西番莲果实的果皮POD活力在贮藏0～6 d内较快上升，6～9 d内略有下降，9～12 d内缓慢上升，贮藏12 d之后则缓慢下降。与对照组果实比较，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮POD活力在整个贮藏期间都保持在较高水平。显着性分析结果表明，在贮藏6～15 d内，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮POD活力极显着高于对照组（P＜0.01）。

图5 壳聚糖处理对采后西番莲果皮PPO（A）和POD（B）活力的影响Fig.5 Effect of chitosan treatment on activities of PPO (A) and POD (B) in pericarp of harvested passion fruit

以上结果显示，壳聚糖处理能诱导提高采后西番莲果皮参与酚类代谢的PPO、POD活力，从而提高采后西番莲果实的抗病性。

2.5 壳聚糖处理对采后西番莲果皮CHI和GLU活力的影响

如图6A所示，贮藏期间，对照组和壳聚糖处理组西番莲果实的果皮CHI活力整体均呈上升趋势。对照组西番莲果实的果皮CHI活力上升较缓慢。与对照组果实比较，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮CHI活力上升较快，且在整个贮藏期间都保持在较高水平。显着性分析结果表明，在贮藏9～15 d期间，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮CHI活力显着高于对照组（P＜0.05）。

如图6B所示，对照组西番莲果实的果皮GLU活力在贮藏0～3 d内略有上升，3～6 d内快速上升，贮藏6 d之后则快速下降。而壳聚糖处理组西番莲果实的果皮GLU活力在贮藏0～6 d内急剧上升，6～9 d内略有下降， 贮藏9 d之后则急剧下降。与对照组果实比较，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮GLU活力在整个贮藏期间都保持在较高水平。显着性分析结果表明，在贮藏3～12 d内，壳聚糖处理组西番莲果实的果皮GLU活力显着高于对照组（P＜0.05）。

图6 壳聚糖处理对采后西番莲果皮CHI（A）和GLU（B）活力的影响Fig.6 Effect of chitosan treatment on activities of CHI (A) and GLU (B) in pericarp of harvested passion fruit

以上结果显示，壳聚糖处理能诱导提高采后西番莲果皮病源相关蛋白家族CHI、GLU活力，从而提高采后西番莲果实的抗病性。

3 讨 论

3.1 壳聚糖处理减缓西番莲果实采后病害发生与木质素、总酚含量的关系

当果蔬受到外界病菌侵染时，自身会进行一系列防御反应，激活果蔬抗病相关酶活力，提高抗病性物质的合成。酚类物质和木质素是植物中的重要抗病物质，它们在植物抗病性中起重要作用[4,10,19]。其中酚类物质对病原菌有抑制作用；而构成植物细胞壁的木质素可增加病原菌侵入细胞的阻力，从而起到抗病作用[20-21]。 本实验研究表明，对照组西番莲果实采后病害严重程度和果实感病指数随采后贮藏时间的延长而逐渐增加 （图1、2），果皮木质素质量分数在采后贮藏0～9 d内呈现上升趋势，在贮藏第9天时出现峰值，之后下降（图3A）。 据此推断，采后西番莲果实在贮藏初期因病原菌侵染而产生应激反应，激发果皮木质素的合成，以此提高自身抵御能力；而在贮藏后期，由于抗病性物质木质素质量分数下降而导致西番莲果实采后抗病性下降，从而导致果实病害大量爆发。此外，对照组西番莲果实的果皮 总酚含量随着采后贮藏时间的延长而不断降低（图3B）。以上结果表明，西番莲果实采后病害发生与其果皮木质素、总酚等抗病物质含量下降所致果实抗病性下降有关。

进一步比较发现，与对照组果实比较，壳聚糖处理能显着降低西番莲采后贮藏期间的果实感病指数，保持较高的果皮木质素质量分数和总酚含量。据此认为，壳聚糖处理能通过保持较高的果皮木质素质量分数和总酚等抗病物质含量而增强果实抗病性，从而减缓西番莲果实采后病害发生。

3.2 壳聚糖处理减缓西番莲果实采后病害发生与抗病相关酶活力的关系

苯丙烷代谢途径是植物最重要的次生代谢途径之一，在植物抗病过程中起关键作用。PAL、C4H和4-CL是植物苯丙烷代谢途径的关键酶，能促进木质素和酚类物质等抗病物质的合成[20,22]。PAL催化L-苯丙氨酸脱氨产生反式肉桂酸[23]；C4H参与合成香豆酸、咖啡酸等可直接毒杀病原物的酚酸物质；4-CL则参与主导苯丙烷的分支途径，控制苯丙烷类化合物生物代谢向不同方向进行[24-25]。木质素是由许多苯丙烷单体聚合在一起的交联分子，CAD是催化木质素单体合成最后一步反应的关键酶，能催化芥子酸、松柏醛及香豆酸还原成相应的醇[26]， CAD活力与木质素含量密切相关[19,21]。赵亚婷等[27]研究发现，采前水杨酸处理降低采后杏果实病斑直径和发病率与其能显着提高杏果实中PAL、C4H、4-CL等抗病相关酶活力有关。Liu Yaoyao等[28]研究报道，苯并噻二唑增强采后甜瓜抗病性、减少采后病害发生与其激活甜瓜果实中PAL、C4H等苯丙烷代谢相关酶活力有关。本实验研究发现，与对照组西番莲果实比较，壳聚糖处理能诱导西番莲果皮保持较高的PAL、C4H、4-CL、CAD等抗病相关酶活力（图4）。

PPO和POD协同催化酚类物质氧化形成对病原菌具有高毒性的醌类物质，能阻止病原菌的进一步侵入[29-30]。本课题组前期研究发现，1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）能有效提高采后‘油㮈’果实的PPO和POD活力，降低采后果实腐烂率[31]。杨书珍等[32]研究发现，蜂胶提取物延缓采后柑橘果实病害发生与其诱导柑橘果实PPO、POD活力增强有关。本实验研究发现，与对照组西番莲果实比较，壳聚糖处理能诱导西番莲果实保持较高的果皮PPO、POD活力 （图5）。据此认为，壳聚糖处理提高西番莲果实采后抗病性、降低西番莲果实采后病害发生，与其提高西番莲果皮PPO、POD活力有关。

CHI和GLU是植物体内两种最重要的病程相关蛋白，分别通过降解病原菌细胞壁的几丁质和β-1,3葡聚糖而破坏病原菌的细胞结构[33]。本课题组前期研究发现，1-MCP处理能有效降低采后杨桃[23]、‘油㮈’[31]、台湾青枣[34]等果实腐烂和果实病害发生，这与1-MCP处理提高采后果实CHI、GLU活力有关[23,31]。本实验研究发现，与对照组西番莲果实比较，壳聚糖处理能诱导西番莲果实保持较高的果皮CHI、GLU活力（图6）。据此认为，壳聚糖处理提高西番莲果实采后抗病性、降低西番莲果实采后病害发生，这与壳聚糖处理提高西番莲果皮CHI、GLU活力，从而有利于降解导致西番莲果实采后腐烂病原菌细胞壁的几丁质和β-1,3葡聚糖及破坏病原菌的细胞结构有关。

综上所述，稀释200 倍的卡多赞溶液处理能够增强采后西番莲果实的自身防御系统，通过诱导PAL、C4H、4-CL、CAD、PPO和POD等抗病相关酶类活力的上升，激活苯丙烷代谢途径，促进木质素和总酚的生成和积累，加快果实细胞壁物理屏障的形成。与对照组相比，壳聚糖处理还显着提高了西番莲果皮CHI和GLU活力，直接抑制西番莲果实病原菌的生长。因此，壳聚糖处理可增强采后西番莲果皮抗病相关酶活力以提高抗病物质的合成，进而增强果实采后抗病性，减少病害发生所引起的果实采后损伤，延长果实采后贮藏保鲜期。