榆干离褶伞溶栓酶对酒精诱导大鼠肝损伤的保护作用

李芳芳，张蕊萌，丛 贺，沈明花*

（延边大学医学院，吉林 延吉 133000）

酒精性肝病是长期大量饮酒引起的肝脏损伤性疾病。适量的饮酒可以促进机体的新陈代谢，但长期大量饮酒会引起肝脏的损伤[1-2]、脂质代谢的紊乱及心血管意外的发生[3-4]。经消化道吸收的酒精90%以上在肝脏进行代谢[5]，因此肝脏是酒精代谢的主要器官。酒精在乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的催化作用下转变为乙酸[6]，后者进一步被氧化成二氧化碳和水。当摄入的酒精量超过机体的代谢能力时，酒精及其代谢产物可在体内蓄积，引起肝组织的损伤[7-8]。研究表明，酒精代谢紊乱引起的氧化应激和炎症反应是酒精性肝病的主要诱因[9-11]。因此，通过提高机体的抗氧化和抗炎能力，可以抑制或减轻酒精性肝损伤。

榆干离褶伞溶栓酶（Lyophyllum ulmariumfibrinolytic enzyme，LUFE）是从榆干离褶伞菌丝体中分离纯化的分子质量为50 kDa的溶栓酶[12]，具有抗氧化[13]、抗血栓[14]和抑制血小板活化[15]等作用。前期研究结果表明，LUFE能够通过降低细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平来抑制酒精诱导的血管内皮细胞的损伤[13]，并通过抗炎作用减轻脂多糖引起的大鼠肝组织的损伤[16]。所以推测LUFE有可能对酒精性肝损伤也具有保护作用，其目前鲜见相关的研究报道。因此，本实验以酒精诱导大鼠肝损伤模型探讨LUFE对酒精性肝损伤的保护作用，为榆干离褶伞的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

LUFE由延边大学医学院生物化学与分子生物学教研室提供。40 只SD大鼠（生产许可证号：SCXK（吉）2017-0003；使用许可证号：SYXK（吉）2020-0010），雌雄各半，体质量180～220 g，由延边大学动物实验中心提供。

丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、清蛋白（albumin，Alb）、γ-谷氨酰转移酶（γ-glutamyltranspeptidase，γ-GT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、总胆红素（total bilirubin，T-BIL）、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，T-CHO）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素6（interleukin 6，IL-6）试剂盒 南京建成生物有限公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；核转录因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-кB）p65抗体、p-NF-κB p65抗体 英国Abcam公司；抑制性-κBα（inhibitory kappa B-alpha，I-κBα）抗体 上海艾博抗体贸易有限公司；β-actin抗体 美国 Sigma公司；乙醇 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BX53F光学显微镜 日本OLYMPUS株式会社；RT-2100型酶标仪 深圳雷杜公司；凝交成像仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组及处理

将40 只SD大鼠随机分为4 组，即正常对照组、模型组、LUFE低剂量组和LUFE高剂量组，每组10 只。每日上午8时，除正常对照组以外的其余组按10 mL/kgmb灌胃体积分数40%的酒精，诱导肝损伤，正常对照组以等量生理盐水代替。于每日下午4时，LUFE低、高剂量组分别按100 mg/kgmb和400 mg/kgmb灌胃LUFE，正常对照组和模型组以等量生理盐水代替。连续灌胃28 d后将大鼠禁食禁水。于次日将大鼠处死，采血并取肝，用于血清学指标的检测、肝组织形态学观察和Western blot检测。

1.3.2 肝组织形态观察

取约0.2 g左右的肝组织，用体积分数10%中性福尔马林溶液固定，将经脱水、浸腊、包埋处理后的切片进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光学显微镜下观察肝组织的形态。

1.3.3 血清学指标检测

采用比色法检测血清中AST、ALT、Alb、γ-GT、ALP、T-BIL、TG、T-CHO、HDL-C、LDL-C、T-AOC、SOD及MDA水平，检测方法按照试剂盒说明书进行。血清TNF-α、IL-6水平按酶联免疫吸附测定试剂盒说明书测定。

1.3.4 Western blot法检测肝组织I-κBα和p-NF-κB蛋白表达水平

用RIPA裂解液处理肝匀浆液30 min，以4 000 r/min离心10 min后取上清液。将上清液用BCA法蛋白定量后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝交电泳。经电泳分离的蛋白质转移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用脱脂奶粉封闭1 h后加入相应的一抗（I-κBα、NF-κB p65抗体、p-NF-κB p65抗体），在4 ℃下孵育过夜。次日洗涤、加入二抗并室温孵育2 h，用凝交成像仪进行分析。

1.4 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 LUFE对大鼠肝组织形态的影响

如图1所示，正常对照组大鼠的肝细胞排列整齐，肝索以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞形态及结构正常。经酒精诱导以后可见肝细胞排列紊乱，肝索及肝细胞结构被破坏，大量肝细胞发生脂肪变性，部分肝细胞发生坏死等病理改变。与模型组相比，LUFE高、低剂量组肝细胞的病理损伤明显减轻，细胞排列比较整齐，肝细胞变性、坏死灶减少，但局部仍可见变性的肝细胞。

图1 大鼠肝组织的形态（200×）Fig.1 Morphology of liver tissues in rats (200 ×)

2.2 LUFE对大鼠血清AST、ALT活力和Alb水平的影响

AST和ALT在肝细胞受损时逸出到血液中，导致血清中其活力升高[17]，因此血清AST和ALT活力可作为肝功能检测指标[18]。Alb主要在肝脏合成，血清中的Alb质量浓度可反映肝功能受损程度[19]。在酒精性肝损伤过程中细胞受到ROS和炎症反应的影响，其通透性增加，引起血清ALT、AST水平升高[20]。如表1所示，与正常对照组比较，模型组的AST和ALT活力极显着升高，而Alb质量浓度极显着降低（P＜0.01），说明酒精引起了肝组织的损伤。与模型组相比，LUFE高剂量组AST和ALT活力极显着降低（P＜0.01），而Alb质量浓度显着升高（P＜0.05），提示LUFE对肝细胞有一定的保护作用。

表1 LUFE对大鼠血清AST、ALT活力和Alb质量浓度的影响Table 1 Effect of LUFE on AST and ALT activity and Alb concentration in the serum of rats

2.3 LUFE对大鼠血清γ-GT、ALP活力和T-BIL水平的影响

γ-GT活力作为诊断酒精性肝病的较敏感指标，在一定程度上可以反映肝细胞的受损程度。ALP活力是肝脏重要的酶学指标，发生酒精性肝损伤时血清中γ-GT和ALP活力明显升高[21-22]。血红素代谢过程中产生的胆红素经肝脏的生物转化作用转变为结合胆红素，并随胆汁排入肠道后进一步代谢。当肝细胞损伤时肝脏的生物转化能力下降，导致血液中胆红素含量增多。大量研究表明，酒精所致的肝损伤中T-BIL水平显着升高[21]。由表2可知，与正常对照组相比，经酒精诱导后模型组大鼠血清γ-GTP、ALP和T-BIL水平极显着升高（P＜0.01）。与模型组相比，LUFE高剂量组γ-GTP、ALP和T-BIL水平均极显着降低（P＜0.01），说明LUFE可以抑制酒精所致的γ-GTP、ALP和T-BIL水平升高。

表2 LUFE对大鼠血清γ-GT、ALP活力和T-BIL水平的影响Table 2 Effect of LUFE on γ-GT and ALP activity and T-BIL concentration in the serum of rats

2.4 LUFE对大鼠血清TG、T-CHO、HDL-C和LDL-C浓度的影响

肝脏是脂类和胆固醇代谢的主要脏器。摄入大量酒精后会伴有肝脏脂类和胆固醇代谢的异常，这也是酒精性肝损伤的早期表现之一[23-24]。由表3可知，与正常对照组比较，模型组大鼠的TG、T-CHO和LDL-C浓度显着升高（P＜0.05，P＜0.01）。LUFE高、低剂量组的大鼠血清TG和T-CHO浓度极显着低于模型组（P＜0.01），说明LUFE一定程度上抑制酒精所致的脂类和胆固醇代谢的紊乱。

表3 LUFE对大鼠TG、T-CHO、HDL-C和LDL-C浓度的影响Table 3 Effect of LUFE on TG, T-CHO, LDL-C and HDL-C concentrations in the serum of rats

2.5 LUFE对大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-6质量浓度的影响

酒精刺激肝脏Kupffer细胞，激活NF-κB信号通路，进而促进TNF-α、IL-6等致炎因子的表达，引起肝细胞变性、坏死和纤维增生[25]。由表4可知，与正常对照组相比，模型组大鼠TNF-α和IL-6质量浓度极显着升高（P＜0.01），与Mandrekar等[26]的研究结果一致，说明酒精或其代谢产物可引起机体的炎症反应。与模型组比较，LUFE高剂量组TNF-α、IL-6质量浓度极显着降低（P＜0.01），提示LUFE具有一定的抗炎作用。

表4 LUFE对大鼠血清TNF-α和IL-6质量浓度的影响Table 4 Effect of LUFE on TNF-α and IL-6 levels in the serum of rats

2.6 LUFE对大鼠血清T-AOC、SOD活力及MDA水平的影响

大量酒精被摄入后，其代谢过程中产生的自由基会引起肝细胞的损伤[27]。体内的SOD等抗氧化酶可以清除自由基，从而减轻脂质过氧化反应。MDA作为脂质过氧化反应的产物，其含量可间接反映机体的自由基水平和脂质过氧化程度[28]。为了研究LUFE对酒精所致氧化应激反应的影响，本实验中测定了T-AOC、SOD活力和MDA水平。如表5所示，与正常对照组比较，模型组大鼠血清T-AOC、SOD水平极显着降低，而MDA浓度极显着升高（P＜0.01）。与模型组相比，LUFE高剂量组T-AOC和SOD水平极显着提高，而MDA浓度极显着下降（P＜0.01），说明LUFE具有抗氧化作用。

表5 LUFE对大鼠血清T-AOC、SOD活力及MDA水平的影响Table 5 Effect of LUFE on total antioxidant capacity, superoxide dismutase and malondialdehyde levels in the serum of rats

2.7 LUFE对NF-κB信号通路的影响

NF-κB是一种多功能转录因子，参与氧化应激、炎症等反应过程[29]。NF-κB与酒精性肝病的发生、发展关系密切[30]。为了探讨LUFE的保肝作用机制，检测了其对NF-kB信号通路中的I-κBα蛋白的表达和NF-κB磷酸化水平的影响。如图2所示，与正常对照组相比，模型组I-κBα相对表达量极显着降低，而NF-κB的磷酸化水平极显着升高（P＜0.01），提示酒精可激活NF-κB信号通路。与模型组相比，LUFE高剂量组大鼠肝组织的I-κBα相对表达量显着升高，p-NF-κB相对表达量极显着下降，提示LUFE对酒精所致NF-κB信号通路的激活有抑制作用。

图2 LUFE对I-κBα和p-NF-κB蛋白表达的影响Fig.2 Effect of LUFE on the expression of I-κBα and p-NF-κB in the liver of rats

3 讨 论

摄入大量酒精可引起肝损伤[20,27]。为了观察LUFE对酒精性肝损伤的保护作用，本研究以酒精灌胃的方法建立了大鼠酒精性肝损伤模型。实验结果表明，经酒精诱导后大鼠的正常肝组织结构发生肝索排列紊乱、细胞发生脂肪变性、部分细胞坏死等病理变化。生化指标的检测结果显示，与正常对照组相比，模型组大鼠血清AST、ALT、Alb、γ-TG、T-CHO水平极显着升高，与肝脏病理形态改变结果相符。同时，模型组大鼠氧化应激指标——MDA水平和促炎因子水平极显着升高，提示酒精性肝损伤模型建立成功。

本研究结果表明，LUFE可以减轻酒精或其代谢产物对肝脏的损伤，对酒精性肝损伤有一定的保护作用。酒精性肝损伤与酒精代谢过程中产生的ROS有关[31]。与模型组相比，LUFE能提高大鼠SOD水平，减少MDA的生成，其中LUFE高剂量组改善效果显着，提示LUFE通过降低氧化应激水平来保护肝细胞。酒精性肝损伤除氧化应激外，还表现为炎症反应。酒精及其代谢产物可诱导促炎因子的释放，从而加剧肝脏的炎症反应[32]。本实验结果显示，与模型组相比，高剂量LUFE能极显着降低TNF-α、IL-6促炎因子的水平，减轻肝脏的炎性损伤，这可能与LUFE对NF-κB信号通路的调控有关。在静息状态下，由p50和p65二聚体组成的NF-κB在胞浆中与I-κBα结合成无活性的p50-p65-IκB三聚体形式。但在某种诱因的作用下，NF-κB信号通路中的I-κBα被磷酸化、降解，释放p65，后者发生磷酸化并进行核转移而被激活，促进TNF-α和IL-6等促炎因子的表达。研究表明，乙醇代谢过程中生成的乙醛可以激活I-κBα激酶，促进I-κBα的磷酸化和降解，从而上调NF-κB p65的表达[33]。本实验中，与正常对照组相比，经酒精诱导后I-κBα的表达量降低，NF-κB p65磷酸化水平升高，这与Novitskiy等[33]的研究结相符。与模型组相比，经LUFE干预后能抑制I-κBα的降解和NF-κB p65磷酸化，提示与模型组相比，LUFE能下调NF-κB信号通路，进而抑制促炎因子的表达。本实验结果还显示，LUFE干预会抑制酒精所致的TG、T-CHO、T-BIL、γ-GT等生化指标水平的升高，这可能与LUFE的保肝作用有关。

综上，LUFE对酒精所致的肝损伤有保护作用，其机制可能与抗氧化、抗炎作用有关。