高效液相色谱法测定食品中可能掺杂的16 种工业染料

钟丽琪，曹 进，钱 和，丁 宏，郭亚辉

（1.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2.中国食品药品检定研究院，北京 100050）

经济利益驱动下的食品掺假是目前食品真实性检验的重要研究方向。工业染料具有良好的稳定性，且获得方便价格便宜，在食品生产过程中，常被添加到其中改善外观和色泽。按照《食品安全法》和相关添加剂使用规定[1]，该类添加剂是食品安全重要隐患，同时会给消费者带来健康安全风险。例如苏丹红为致癌物，全球禁止将其用作食品着色剂[2]。在利益的驱使下，工业染料依旧出现于食品中，英国曾在350多种食品中发现苏丹红；欧盟在检测到从印度、巴基斯坦等国调味品中的苏丹染料后，要求出口到欧盟的食品都必须经过认证，不含工业染料[3-4]。中国也有不法商贩用罗丹明B在海虾中染色，用酸性橙等在豆制品中染色[5]。因此，为了有效地控制工业染料在食品中的滥用，建立一种快速测定和筛查食品中非法添加工业染料的检测方法非常必要。

目前，检测工业染料的方法有薄层色谱法[6]、免疫法[7]、电化学分析法[8]、高效液相色谱法[9-11]、液相色谱-串联质谱法[12-14]等，其中最常用的是液相色谱-串联质谱法和高效液相色谱法。液相色谱-串联质谱法虽灵敏度高、分辨率好，但存在较强的基质效应，对前处理要求高，且检测成本大。因此本实验选用高效液相色谱-二极管阵列检测器对16 种工业染料进行测定，以期得到一种可用于日常快速检验的方法。

糖果、巧克力、番茄酱与番茄沙司是人们常食用的食品，都具有较突出的色泽特性，而苏丹红、分散红、分散橙、分散黄类染料具有鲜明的染色特性，与上述食品对色泽的追求多有吻合之处，存在非法使用的可能。文献显示，近几年食品中违禁工业染料的测定多集中在肉制品、豆制品等基质[15-17]，有关糖果、巧克力类基质的文献相对较少。而糖果、巧克力基质的测定多集中在水溶性色素、国家允许使用的合成色素（柠檬黄、亮蓝、胭脂红等）方面[18-19]。所以未来工业染料检测的很大可能会趋向于糖果、巧克力等甜品基质的检测。如今国标中已有同时测定11 种允许添加的合成色素的高效液相色谱检测方法，但还未有同时测定多种工业染料的高效液相色谱检测方法。为此，本研究建立一种高效液相色谱-二极管阵列检测器检测和定量糖果、巧克力、番茄酱与番茄沙司中16 种工业染料的快速分析方法，可为后续制定国标方法提供一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糖果、巧克力、番茄酱、番茄沙司 市购。

乙腈（色谱纯） 美国Thermo Fisher公司；16 种工业染料标准品（分散红11（CAS：2872-48-2）、分散黄9（CAS：6373-73-5）、分散橙3（CAS：730-40-5）、分散橙11（CAS：82-28-0）、分散红1（CAS：2872-52-8）、分散红9（CAS：82-38-0）、分散黄54（CAS：7576-65-0）、分散橙37（CAS：13301-61-6）、分散橙61（CAS：12270-45-0）、苏丹红1（CAS：842-07-9）、分散黄7（CAS：6300-37-4）、分散橙149（CAS：85136-74-9）、苏丹红2（CAS：3118-97-6）、苏丹红3（CAS：85-86-9）、苏丹红7B（CAS：6368-72-5）、苏丹红4（CAS：85-83-6）） 德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 仪器与设备

Ultimate3000高效液相色谱仪 美国赛默飞公司；ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）美国Agilent公司；U-3900V紫外检测器、CR21GIII型高速冷冻离心机 日本Hitachi公司；XP205分析天平瑞士Mettler公司；VORTEX-5型涡旋混合器 其林贝尔仪器制造有限公司；N-D30S氮气浓缩装置 上海润榕科学器材有限公司；0.22 μm PTFE滤膜 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的制备

单一标准溶液的配制：每个标准溶液单独配制，质量浓度为1 mg/mL。苏丹红3、苏丹红4用二氯甲烷配制，其余标准品用乙腈配制，可于-20 ℃贮存3 个月。

混合标准中间液的配制：每种单一标准溶液取相同量混合后用乙腈稀释至50 μg/mL，可于4 ℃贮存1 个月。

1.3.2 样品的预处理

取约10 g糖果研磨成均匀粉末后装入50 mL聚四氟乙烯离心管中备用，取约10 g巧克力装入50 mL离心管中，在40 ℃水浴加热至融化并用玻璃棒搅拌3 min后，室温冷却至凝固备用。番茄酱、番茄沙司取约10 g装入50 mL离心管中用玻璃棒搅拌3 min后备用，所有样品均在4 ℃条件下贮存。

1.3.3 染料的结构分析

工业染料可分为偶氮型染料（图1A）、蒽醌型染料（图1B）、杂环型染料（图1C）。偶氮型染料含有偶氮基团，蒽醌型染料含有苯醌基团或多环酮，杂环型染料含有不同的杂环。虽然16 种工业染料的结构存在一定的差异，但都为脂溶性工业染料，能溶于有机溶剂，几乎不溶于水。张艳侠等[20]使用乙腈提取偶氮染料，钱疆等[21]使用乙腈-丙酮-氨水提取碱性及苏丹染料。路勇等[22]用乙腈提取，再用正己烷辅助提取偶氮染料和蒽醌染料。本实验参考相关文献的提取溶剂后，根据这16 种工业染料的结构特点，最终选择乙腈作为提取溶剂，并且达到了非常满意的效果。

图1 工业染料Fig.1 Chemical structures of three types of industrial dyes

1.3.4 样品的提取

取1 g经预处理的样品于15 mL聚四氟乙烯离心管中，精密加入2 mL乙腈，涡旋1 min，室温下超声提取30 min后，在10 ℃、8 000 r/min离心5 min，转移样品的上清液至新15 mL离心管内。在残渣中再加入2 mL乙腈，重复上述操作，合并上清液，最后在残渣中加入1 mL乙腈，重复上述操作，合并上清液并混匀。取1 mL上清液过0.22 μm的PTFE滤膜装入进样小瓶，备用。

1.3.5 液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；进样量20 μL；柱温35 ℃；流速0.8 mL/min。紫外检测器检测波长分别为370、440、470 nm和520 nm。流动相A为水，流动相B为乙腈。采用梯度洗脱，见表1。

表1 流动相洗脱梯度Table 1 Mobile phase composition for elution gradient

2 结果与分析

2.1 波长的选择

先用紫外检测器对16 种工业染料进行全扫描（200～800 nm）确定每种染料的最大吸收波长。结果如表2所示，最终选择370、440、470 nm和520 nm进行检测。

表2 16 种工业染料的最大吸收波长与检测波长Table 2 Maximum absorption wavelengths and detection wavelengths for 16 industrial dyes

2.2 液相色谱分离条件的优化

本方法比较乙腈-水、甲醇-水、乙酸盐等缓冲盐体系进行分离优化，分离效果并未有很大差别。同时因为在流动相中加入缓冲盐，对色谱柱以及管路系统造成一定的损伤。因此在充分评价分离效果，并以分离度、拖尾因子、色谱峰纯度等为综合指标进行分析，本方法使用乙腈-水已能完全满足分离要求，因此确定以乙腈-水作为流动相。样品检测结果见图2。

图2 番茄沙司中16 种工业染料的高效液相色谱图（470 nm, 20 mg/kg）Fig.2 HPLC chromatogram of 16 industrial dyes in tomato sauce(20 mg/kg) detected at 470 nm

在洗脱过程中，李兰等[23]用75%水相与25%的有机相开始洗脱，因为工业染料溶于有机溶剂，一般在有机相比例较高时被洗脱下来。本研究在使用75%水相洗脱时发现，由于水相比例过高导致前7 min并未有工业染料被洗脱出来。但若水相比例过低，出峰时间提早，分析物也会受到杂质的干扰，最后确定以60%的水相和40%的有机相起始洗脱。

2.3 样品提取剂的确定

在样品提取净化过程中，常用的净化方式有凝胶色谱法、固相萃取法。凝胶色谱法适用于非极性的染料，对于极性较强的分散染料并不适用。使用固相萃取柱去除杂质时发现，由于苏丹红7B没有酚羟基，在固相萃取柱上的保留性较差，当用己烷淋洗去除杂质时也会被洗脱下来；相反地极性染料却不容易被洗脱下来。冯月超等[24]使用中性氧化铝固相萃取柱除杂质后，大部分染料的回收率在70%左右。Zhao Shan等[25]用冷冻法过滤样品中的杂质，但冷冻法要花费2 h以上，前处理时间过长，不适合用在快速筛选的检测项目。固相萃取柱的使用虽然可以起到对杂质的清除效果，但是针对本研究检测的基质依然具有一定的局限，曾尝试利用反向填料、弱酸碱性填料进行净化，并不能获得较好的回收效果。Tsai等[26]直接用乙腈提取得到了较好的回收率，但样品需求量过大，不适用于快速筛选的检测项目；Tamim等[27]使用液相色谱-串联质谱法直接提取存在较强的基质效应和干扰，导致某些染料的回收率只有54%。综合分析，考虑到所检测的16 种工业染料在较宽的质量浓度范围内能完全溶于乙腈，同时所检测基质采用有机溶剂提取已经可以满足相应的杂质清除，并且可达到较好的回收率，故选择乙腈作为提取溶剂。

2.4 滤膜的选择

选择常用的尼龙、PTFE和PVDF滤膜进行对比，实验发现尼龙滤膜会对红色染料产生吸附，能在滤膜上看见明显的残留。PTFE、PVDF对红色染料都没有明显的吸附，综合考虑选用PTFE滤膜。

2.5 方法验证的结果

2.5.1 线性方程、检出限与定量限结果

如表3所示，标准曲线是利用5 个校准点（0.5、1、2、4、5 μg/mL）对分析物峰积分的峰面积值与分析物质的质量浓度进行线性回归得到的。标准曲线上所有点的值均为3 次进样的平均值。结果表明，标准曲线的R2均大于0.999 6。按照以RSN为3计算检出限（limit of detection，LOD）、以RSN为10计算定量限（limit of quantitation，LOQ），如表4所示，LOD为0.26～0.88 mg/kg，LOQ为0.82～2.52 mg/kg，实际稀释后测定也得到相似的结果。据欧洲调味品协会专家委员会的资料显示，工业染料的检出量为3～3 500 mg/kg[28]，本方法测得的LOQ与LOQ完全满足常规检测。

表3 16 种工业染料的线性范围、回归方程、相关系数及保留时间Table 3 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients and retention times for 16 industrial dyes

表416 种工业染料在4 种食品基质中的LOD和LOQTable 4 LODs and LOQs of 16 industrial dyes in four food matrices mg/kg

2.5.2 准确度、回收率与精密度结果

在线性范围内选择3 种不同加标量（2.5、10、20 mg/kg）的标准品加到空白样品中，对方法的回收率和精密度进行评估，其中低水平为线性范围的最低点。

准确度用加标水平的回收率评价。精密度以加标水平相互独立测定结果的重复性进行评价，每个加标水平进行6 次平行实验，以测出量的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示方法重复性。由表5可知，番茄酱、番茄沙司、糖果、巧克力中16 种工业染料的回收率分别为83.0%～101.4%、81.0%～98.7%、94.7%～110.3%、85.4%～109.7%；RSD分别为0.3%～4.1%、0.3%～7.4%、0.4%～7.5%、0.6%～3.6%。日间精密度是在0、4、8、12、24 h和48 h重复测定同一样品6 次，发现RSD均小于15%。结果表明，方法的准确度和精密度均基本满足定量分析的要求。

表5 16 种工业染料在4 种食品基质中的回收率与RSDTable 5 Spiked recoveries and RSDs of 16 industrial dyes in four food matrices

需要说明的是，本方法并未根据每种工业染料确定不同的线性范围和加标量以获得最佳的回收率与检出限，虽然根据单个工业染料在单个体系下优化设计的线性范围与加标量能达到最优的结果，但同时也会失去快速筛查这一优势，故采用同一线性范围及加标量。

2.5.3 方法稳定性

通过检测加标量为10 mg/kg的样品在0、24 h和48 h的含量后，以峰面积计算16 种工业染料的RSD，结果如表6所示。16 种工业染料的RSD均小于15%，表明此方法的稳定性满足定量分析的要求。

表6 加标量为10 mg/kg样品在0、24 h和48 h的含量及RSDTable 6 Average contents and RSD of the dyes in samples spiked at 10 mg/kg determined at 0, 24 and 48 h after addition

2.6 实际样品测定

在实际样品的检测中，杨立新等[29]在辣椒制品中发现了碱性橙21的阳性样。邵国建等[30]未在13 批膨化食品中发现苏丹类及碱性染料的阳性样。宋鑫等[31]未在100 批肉制品中发现苏丹类染料。本实验应用此方法对市售20 批样品（每种基质各5 批）进行测定，16 种禁用染料均未检出，其未检出可能是大型超市来源的商品大多来自正规厂商，同时也存在采样量不足的原因。

3 结 论

本研究采用了简单的一步萃取法，建立高效液相色谱-二极管阵列检测法测定糖果、巧克力、番茄酱、番茄沙司中的16 种工业染料的快速筛查方法，对样品前处理条件、线性关系、检出限和精密度等参数进行了方法学优化与验证。本方法的目标分析物涵盖了目前市场上较容易取得的食品中禁用的红橙黄色工业染料，方法稳定性好，可操作性强，提高了工作效率，降低了检测成本。这项研究的实质是创建一种分析食品中非法添加工业染料的实用方法，该方法可为打击食品非法添加剂行为的大规模监督检验计划项目提高工作效率。