苯乳酸抑制链格孢霉作用靶位的分析

郭明媚，孔艳辉，李晓贺，杜志磊，范新光，贡汉生,*

（1.鲁东大学食品工程学院，山东 烟台 264025；2.烟台市园林建设养护中心，山东 烟台 264000）

链格孢霉（Alternariasp.）在自然界的土壤、粪便、禾草及空气等环境中广泛存在[1]，大多数种类兼性寄生于植物上，易引起多种经济植物病害，造成田间和产后损失。链格孢毒素是由链格孢属类真菌产生的一类有毒次级代谢产物[2]，链格孢毒素可污染粮食、水果、蔬菜等多种农产品[3]，严重威胁食品安全、危害人体健康[4]。在我国，每年由链格孢霉引起的水果腐烂都会造成巨大经济损失[5]，且其潜在的毒性是威胁农产品质量安全的风险之一[6]。本实验室从腐烂樱桃中分离出霉菌60 株，其中链格孢霉14 株，这说明链格孢霉是引起甜樱桃腐败的主要菌种之一[7]。

当前可用于水果保鲜的天然抑制霉菌物质较少，乳酸菌等微生物产生的苯乳酸有很好的应用潜力。苯乳酸全名为2-羟基-3-苯基丙酸，又名β-苯基乳酸和3-苯基乳酸，是近年来发现的一种新型天然有机酸。苯乳酸具有广谱的抑菌作用[8-9]，对于毛霉、链格孢霉等真菌及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、肠球菌以及沙门氏菌等细菌均具有抑菌活性[10-11]。苯乳酸可由大多数乳酸菌通过苯丙氨酸代谢途径发酵产生，安全无毒[12]，这使得苯乳酸在生物防腐方面受到广泛关注[13]。

苯乳酸可以抑制引起甜樱桃腐烂的链格孢霉的生长，有用于制备樱桃保鲜剂的潜力。本实验室利用苯乳酸与海藻酸钠制备了涂膜保鲜剂保鲜甜樱桃，涂膜后的甜樱桃腐烂率明显降低且可延缓成熟和衰老，保鲜期明显延长[14]。

当前苯乳酸对于细菌的抑制作用机理研究较多，如宁亚维等[15]发现苯乳酸通过破坏细胞膜的完整性抑制荧光假单胞菌正常的生长繁殖。苯乳酸对于真菌的抑制作用机理研究较少，然而霉菌是引起水果腐败的主要原因[7]，为促进苯乳酸在果蔬保鲜中的应用，有必要研究苯乳酸抑制霉菌的作用机理。苯乳酸抑制霉菌的作用机理与抑制细菌的作用机理有所不同，目前尚未找到苯乳酸抑制霉菌的主要作用靶位，不能消除人们对其安全性的顾虑，极大影响了苯乳酸在水果贮运保鲜领域的应用[16]。通过卡尔科弗卢尔荧光增白剂染液（calcofluor white stain，CFW）染色观察链格孢霉菌丝顶端形态、扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察链格孢霉菌丝超微结构、测定苯乳酸作用前后链格孢霉上清液中N-乙酰葡萄糖胺质量浓度变化、荧光双染色法等实验方法来寻找苯乳酸抑制链格孢霉的作用靶位，进而明确苯乳酸抑制霉菌作用机理，从而指导和促进苯乳酸在水果保鲜领域的应用，开发基于苯乳酸的水果保鲜剂，延长易腐水果的保鲜期，提高我国水果销售品质，扩大销售范围。同时，明确苯乳酸抑制链格孢霉作用机理后，可联合与其有相似作用机理的其他方法组成栅栏技术进行易腐水果的防腐保鲜，为苯乳酸在水果保鲜领域中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

供试菌株：链格孢霉（Alternariasp.）LD3.0086，从腐败樱桃（‘美早’樱桃）中分离得到，鉴定后保藏于鲁东大学食品工程学院实验中心。

苯乳酸（CAS号：20312-36-1） 美国Sigma-Aldrich公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）荧光染料生工生物（上海）股份有限公司；双乙酸荧光素（fluorescein diacetate，FDA）荧光染料 上海迪柏化学品技术有限公司；CFW 北京酷来搏科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

JEM-1230透射电子显微镜 日本JEOL公司；MERLIN扫描电子显微镜 德国ZEISS公司；TH4-200倒置荧光显微镜 日本Olympus公司；Epoch酶标仪 美国BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 链格孢霉孢子悬浮液、菌丝的制备

采用Lachhab等[17]的方法，将链格孢霉接种到察氏培养基平皿上，28 ℃培养10 d，以无菌生理盐水洗下孢子，并用6 层纱布过滤除去菌丝。采用血细胞计数板对孢子进行计数，调整孢子悬浮液的孢子浓度为1×106个/mL，现用现制。

吸取孢子悬浮液1 mL加入到100 mL察氏液体培养基中，静置培养24 h，获得链格孢霉新鲜菌丝，备用。

1.3.2 苯乳酸对链格孢霉抑制能力的测定

分别称取一定量的苯乳酸，溶于察氏液体培养基中，使其浓度分别为12.5、25.0、37.5、50.0、62.5、75.0、87.5、100.0 mmol/L。向96 孔板孔内加入200 μL浓度为1×106个/mL的孢子液，并分别加入50 μL上述苯乳酸溶液使其终浓度分别达到2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 mmol/L。以不加苯乳酸及菌液的空白培养基作为空白对照，以不加苯乳酸的菌液作为生长对照。置于28 ℃恒温培养箱中培养，于48 h时用酶标仪检测OD600nm，以表征苯乳酸对链格孢霉的抑制能力。

1.3.3 链格孢霉菌丝顶端生长细胞形态的观察

选取经12.5 mmol/L的苯乳酸（处理组）或无菌水（对照组）处理8 h的菌丝，将备检菌丝置于干净载玻片，滴一滴CFW染色剂和一滴质量分数10%氢氧化钾溶液，将盖玻片置于样本上，静置染色1 min，置于倒置荧光显微镜下进行观察并拍照[18]。

1.3.4 链格孢霉菌丝形态的观察

取适量湿菌丝，用12.5 mmol/L苯乳酸溶液（处理组）或无菌水（对照组）处理24 h后用无菌水清洗菌丝3 次，除去苯乳酸，按照扫描电子显微镜样品制备方法制备样品[19]。用0.01 mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液反复冲洗菌丝3 次，置于体积分数2.5%戊二醛溶液中4 ℃下过夜固定。将固定好的菌丝用磷酸盐缓冲液漂洗3 次，每次静置10 min，除去戊二醛；将样品依次置于系列体积分数为30%、50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液中脱水置换，每次15 min。脱水后临界点干燥，将干燥的菌体固定到金属台上，用离子溅射仪对金属台喷金、镀膜，进行扫描电子显微镜观察。

1.3.5 链格孢霉菌丝的超微结构观察

将1.3.4节中乙醇脱水后的样品，继续用丙酮脱水3 次，用Epon 812固定剂进行包埋，超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅双染色后，采用透射电子显微镜进行观察和图像采集[20]。

1.3.6 链格孢霉菌丝细胞壁完整性的分析

取适量湿菌丝用12.5 mmol/L苯乳酸溶液（处理组）或无菌水（对照组）处理24 h，每隔2 h取样，1 0 000 r/min离心5 min后取1 mL上清液，置于试管内，在试管内，加入0.1 mL 0.5 mol/L碳酸钠溶液，沸水浴中加热5 min，冷却后添加冰醋酸溶液至2 mL，加入对二甲氨基苯甲醛试剂1 mL，用乙酸补足10 mL。充分混匀，静置后使用分光光度计于540 nm波长处测定吸光度。利用取N-乙酰葡糖胺标准溶液进行梯度稀释，取1 mL标准溶液代替上清液作相同处理，测定540 nm波长处的吸光度，得到标准曲线方程，利用标准曲线方程计算溶液中N-乙酰葡糖胺的质量浓度[21]。

1.3.7 链格孢霉菌丝细胞膜完整性的分析

取适量湿菌丝用12.5 mmol/L的苯乳酸溶液（处理组）或无菌水（对照组）分别处理0、4 h和8 h，取处理好的菌丝重悬于无菌水中得到菌丝悬浮液，在1 mL菌丝悬浮液中加入1 mL质量浓度为1 mg/mL FDA荧光探针，37 ℃避光孵育20 min后，再加入1 mL质量浓度为1 mg/mL荧光探针PI，室温避光反应10 min。用无菌水漂洗多余探针后置于倒置荧光显微镜下观察并拍照[22]。

1.4 数据统计与分析

所有实验均重复3 次，结果取平均值，采用Origin 2018软件分析数据并作图。

2 结果与分析

2.1 苯乳酸对链格孢霉的最小抑菌浓度

苯乳酸作用48 h时测定96 孔板的OD600nm，结果如图1A所示，OD600nm随苯乳酸浓度的增加先升高后逐渐下降。因此，苯乳酸对链格孢霉的作用效果为较低浓度促进生长，高浓度抑制生长。苯乳酸随浓度升高抑制作用逐渐增强，且抑制作用呈现一定的剂量效应。如图1B所示，空白对照组培养基清澈；可明显看出生长对照组菌丝生长旺盛，在苯乳酸浓度为2.5、5.0 mmol/L时，苯乳酸对链格孢霉存在一定的生长促进作用，苯乳酸浓度超过7.5 mmol/L后抑制其生长，当苯乳酸浓度达到12.5 mmol/L时，所在微孔的液体澄清，无菌丝生长，且更高浓度的微孔内均无菌丝生长，初步认定苯乳酸对链格孢霉的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentratio，MIC）为12.5 mmol/L，后面的实验均在该浓度下进行。

图1 苯乳酸对链格孢霉的抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect of phenyllactic acid on Alternaria sp.

2.2 苯乳酸作用前后链格孢霉菌丝顶端生长细胞的形态变化

CFW是一种荧光染料，它与真菌细胞壁的几丁质有很强的亲和力，在一定的长波紫外光照射下，经CFW染色的真菌会发出亮蓝色荧光。由图2可清晰看出，未经苯乳酸处理的对照组菌丝顶端较为平整，颜色均匀统一，经苯乳酸处理8 h后的菌丝顶端依然平整光滑，未见明显形变，这说明苯乳酸对链格孢霉菌丝顶端生长细胞基本没有明显破坏作用。

图2 链格孢霉菌丝顶端生长细胞的形态Fig. 2 Effect of phenyllactic acid on morphology of hyphal tip-growing cells of Alternaria alternata

2.3 苯乳酸对链格孢霉菌丝形态的影响

通过扫描电子显微镜观察苯乳酸对链格孢霉菌丝形态的影响（图3），对照组菌丝表面形态光滑饱满（图3A1～A3），与对照组相比，12.5 mmol/L的苯乳酸处理24 h后的链格孢霉菌丝表面形态出现了部分凹陷及褶皱（图3B1、B2）；菌丝周边有少量内容物泄漏（图3B3），菌丝有聚集的倾向。但总体来看，菌丝并未发生明显的形态变化。

图3 链格孢霉菌丝扫描电子显微镜图Fig. 3 Scanning electron microscopic image of Alternaria sp. hyphae

2.4 苯乳酸对链格孢霉超微结构的影响

透射电子显微镜下观察苯乳酸对链格孢霉超微结果的变化影响，结果如图4所示。未经苯乳酸处理的链格孢霉细胞规则，细胞壁完整，细胞膜完整光滑，细胞结构致密，细胞膜紧贴细胞壁，细胞质均匀，液泡等细胞器清晰可见（图4A1～A3）；而经12.5 mmol/L苯乳酸处理24 h后，菌丝细胞壁未发现明显破损（图4B1），细胞膜边缘不再清晰，细胞内部结构发生明显变化，细胞内隔膜消失，细胞质出现无序化并固缩成颗粒状、碎片状（图4B1～B3）。由此可见，苯乳酸处理24 h后，细胞壁未发生明显破损，细胞膜稍有损伤，细胞内部细胞质及细胞器的变化较大，这说明细胞内部的细胞质或细胞器可能是苯乳酸的主要作用靶位。

图4 链格孢霉菌丝透射电子显微镜图Fig. 4 Transmission electron microscopic image of Alternaria sp. hyphae

2.5 苯乳酸对链格孢霉细胞壁的影响

霉菌细胞壁的主要成分为几丁质，是由N-乙酰葡萄糖胺通过β-1,4-糖苷键连接而成的链状结构。若苯乳酸破坏霉菌的细胞壁结构或抑制几丁质的合成，将会有大量N-乙酰葡萄糖胺释放到胞外。如图5所示，随苯乳酸处理时间延长，链格孢霉上清液中N-乙酰葡萄糖胺的质量浓度先升高再降低后升高，随后趋于平稳，与未经苯乳酸处理的链格孢霉上清液（对照）相比，处理组N-乙酰葡萄糖胺的质量浓度变化趋势基本相同，两组N-乙酰葡萄糖胺的质量浓度无明显差异。可以说明苯乳酸对霉菌细胞壁没有明显的破坏作用，霉菌细胞壁不是苯乳酸的主要作用靶位。

图5 苯乳酸作用前后链格孢霉上清液中N-乙酰葡萄糖胺质量浓度的变化Fig. 5 Concentrations of N-acetylglucosamine in the culture supernatant of Alternaria sp. before and after treatment with phenyllactic acid

2.6 苯乳酸对链格孢霉细胞膜的影响

FDA可进入细胞，在活细胞内被酯酶水解产生荧光物质，并能在荧光显微镜下发出绿色荧光，应用FDA染色可以检测细胞的活性。PI是核酸染料，不能透过完整细胞膜，只能进入膜破损的细胞而使细胞核染色，并在荧光显微镜下发出红色荧光。应用FDA/PI荧光双染色法可以检测菌丝细胞的活性和细胞膜的完整性[23-24]。由图6可知，未经苯乳酸作用的链格孢霉，在蓝紫光激发下可见明亮绿色，在绿光激发下未见到明显的亮红色，这说明未经苯乳酸作用的链格孢霉菌丝为活体，细胞膜完整。苯乳酸处理组刚开始时（0 h）菌丝在蓝紫光激发下呈现明显的绿色，在绿光激发下未见明显红色。苯乳酸作用4 h后，菌丝大部分部位仍然呈现明显的绿色，稍有红色，与水处理组相比差异不大，这说明苯乳酸短时间作用后的链格孢霉菌丝细胞膜仍完整；随着作用时间进一步延长（8 h），经苯乳酸作用后的菌丝亮绿色基本消失，菌丝基本都呈现红色，这说明链格孢霉的细胞膜已发生破损，PI已进入细胞内部使细胞核染色。

图6 苯乳酸对链格孢霉细胞膜的影响Fig. 6 Effect of phenyllactic acid on the cell membrane of Alternaria sp.

3 讨 论

本研究结果显示苯乳酸对链格孢霉的MIC为12.5 mmol/L（2 mg/mL），与Prema等[25]研究中提到苯乳酸对真菌的MIC对比，对链格孢霉的MIC更小。通过CFW染色、扫描电子显微镜观察、透射电子显微镜观察、菌丝上清液中N-乙酰葡萄糖胺的质量浓度测定及FDA/PI荧光双染色法等对苯乳酸抑制链格孢霉LD3.0086的作用靶位进行了初步探索。

苯乳酸对于链格孢霉的菌丝细胞顶端生长并未造成明显影响。此前Virágh等[26]研究发现新萨氏菌抗真菌蛋白（Neosartorya fischeriantifungal protein，NFAP）作用于构巢曲霉（Aspergillus nidulans）后，通过CFW染色观察到菌丝顶端发生了明显的形变，说明NFAP对构巢曲霉菌丝顶端生长造成了影响。然与其对比可发现，苯乳酸作用前后，CFW染色结果显示菌丝顶端细胞外边缘仍较为顺滑，并无明显缺失或凸起，即苯乳酸不是通过影响链格孢霉菌丝顶端生长来抑制链格孢霉。

苯乳酸在抑制链格孢霉时未破坏细胞壁结构。本研究通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察发现，经苯乳酸处理后链格孢霉菌丝细胞壁没有明显破损和缺失，之后检测发现苯乳酸作用前后霉菌上清液中N-乙酰葡萄糖胺质量浓度没有发生明显变化，以上结果说明苯乳酸对于真菌链格孢霉的主要作用靶位不是细胞壁。此前一些研究显示苯乳酸对细菌的抑制中细胞壁是主要作用靶位，如袁景环等[27]发现苯乳酸作用于金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的主要作用靶位是细胞壁；Dieulevenx等[28]认为苯乳酸对肠膜明串珠菌（Leuconostoc monocytogenes）的作用位点之一是细胞壁。王凤婷[29]发现苯乳酸对阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）的作用方式主要是破坏细胞壁的形态，改变细胞膜通透性，进而改变细胞内外电势，最后内容物流出导致细胞死亡。与细菌相比，细胞壁不是苯乳酸抑制真菌的主要作用靶位。

苯乳酸对于链格孢霉的细胞膜并没有直接造成明显损伤。FDA/PI染色结果显示苯乳酸作用4 h时细胞膜仍较为完整，作用8 h后细胞膜明显破损，菌丝全部染成红色，菌体死亡。Ning Yawei等[30]在研究苯乳酸和乳酸对蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）协同抗菌机理时，发现经苯乳酸处理2 h后的细菌细胞膜完整性已受到严重破坏。黄云坡等[31]通过荧光探针标记法发现苯乳酸对L. monocytogenes10403s的细胞膜通透性和完整性在1 h时已有严重破坏，这说明若是直接破坏细胞膜，在较短时间内即会出现细胞膜破损现象，对比发现，苯乳酸作用于链格孢霉短时间内（4 h）细胞膜并未造成明显破坏，而在8 h时损伤严重，这说明苯乳酸并非通过直接破坏链格孢霉细胞膜的完整性抑制霉菌，推测其破坏了霉菌的内部结构，霉菌产生自溶酶等进一步破坏了霉菌的细胞膜。

通过透射电子显微镜可清晰观察到链格孢霉细胞内部较为明显的变化，例如苯乳酸作用后细胞内细胞质的无序化，固缩成颗粒状等现象均说明苯乳酸进入链格孢霉菌丝内部，破坏了其内部结构。

4 结 论

本实验通过CFW染色实验发现苯乳酸未抑制菌丝顶端细胞生长；通过检测苯乳酸作用前后链格孢霉上清液中N-乙酰葡萄糖胺的质量浓度变化、扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察得出苯乳酸抑制链格孢霉的主要作用靶位不是细胞壁；通过FDA/PI染色实验得出苯乳酸并非通过直接破坏链格孢霉的细胞膜发挥抑制作用。推测苯乳酸进入细胞后破坏细胞器结构或引起细胞内一系列的生化反应，从而发挥抑菌作用。