覃祖火 樊 强 马楚卿 田子恒 王 娟*
1.海南医学院基础医学与生命科学学院 海南海口 571199;2.青岛市即墨人民医院 山东青岛 266299;3.海南医学院第二临床学院 海南海口 571199;4.济宁医学院临床医学院 山东济宁 272002
组织工程也称为“再生医学”,是指利用生物活性物质,通过体外培养或构建的方法,再造或者修复器官及组织的技术。“组织工程”是由美国国家科学基金委员会在1987年提出,近年来正在兴起的一门新学科,属于生物高技术范畴,是生命科学领域的一门重要专业课程[1]。组织工程的实验教学对于培养学生的实践能力和科研思维至关重要。目前,国内已有不少高等院校开设了组织工程学实验课程,但课程内容的系统性和连续性有待提高[2-4]。
我校开设的组织工程实验课内容主要涉及种子细胞培养和支架材料体外重建等方面,主讲教师根据学情分析,从课程内容、课程设置等方面进行了系列改革。组织工程及其实验课程安排在大三上学期,该阶段学生已学习了细胞生物学、分子生物学、发育生物学、生物材料学、细胞工程等课程。2021年,主讲教师对组织工程实验课程内容进行了调整,培养人源脂肪干细胞(human Adipose Derived Stem Cells,hADSCs)作为种子细胞,构建麦胚凝集素(Wheat Germ Agglutinin,WGA)慢病毒载体并感染hADSCs,并将感染后的hADSCs注入小鼠的脑卒中模型的大脑损伤部位,观察hADSCs对脑卒中的疗效。该实验将为hADSCs对脑损伤的临床治疗提供技术参考。该实验整合后为综合性设计性实验,可以将学生的多学科理论知识有效地融合起来,培养学生的创新能力和团队协作能力。
1 WGA实验教学方案
1.1 实验原理
麦胚凝集素是一种可以从多种谷类作物中提取的蛋白质[5]。WGA通过诱导细胞膜表面上的糖类和蛋白质的相互作用,从而参与宿主细胞被细菌或病毒感染的初始过程,对免疫学、组织器官学等医学研究具有重要意义[6]。WGA是研究细胞表面结构受体的重要探针,对脂肪代谢、细胞膜通透性、成纤维细胞增殖抑制、免疫反应等都有调节作用[7]。
有研究用小鼠和果蝇作为模式生物,将WGA-cDNA片段转入质粒载体中,腺病毒包装后感染细胞,当神经元特异启动子表达后,导入的目的基因即可表达,从而通过观察WGA,便能达到示踪的效果[8]。在神经退行性疾病如阿尔兹海默病、肌萎缩侧索硬化等的研究和治疗中,对相关的神经元进行示踪显得至关重要[9]。
该实验是将WGA转入慢病毒载体Plvx-IRES-ZsGreen1中进行包装,再将构建好的质粒和其他三种包装质粒(RPEV、PRRE、VSVG)共转染293T细胞,收集病毒后感染人源脂肪干细胞(hADSCs),用hADSCs移植治疗小鼠脑卒中模型的大脑损伤区。治疗两周后,取小鼠的脑损伤部位制作冰冻切片,免疫荧光鉴定示踪hADSCs的迁移能力。该实验为干细胞治疗脑卒中,提供显色示踪的方法。
1.2 实验目的
本实验以WGA为研究对象,实验内容包括重组慢病毒表达载体Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1的构建、293T细胞及hADSCs的培养、共转染、干细胞移植治疗等内容。干细胞治疗技术是一门先进的医学技术,2009年卫生部将干细胞技术归入“第三类医疗技术”。学生自主设计实验,参与到实验的每一个环节,该综合性、设计性实验激发了他们的学习兴趣,提高了创新思维能力和动手操作能力。
1.3 实验材料
生物材料与试剂:感受态细胞、293T细胞(人胚肾细胞)、WGA-d质粒、plvx-ires-ZsGreen1载体质粒、hADSCs(人源脂肪干细胞)、DMEM/F12培养基、胎牛血清等。
实验仪器:高速冷冻离心机、CO2培养箱、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等。
1.4 实验方法
(1)构建重组慢病毒表达载体Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1。用限制性内切酶EcoRⅠ分别酶切目的片段模板质粒WGA-d和慢病毒载体质粒Plvx-IRES-ZsGreen1。琼脂糖凝胶电泳分离后,回收纯化目的条带,用DNA连接酶将纯化的WGA片段与Plvx-IRES-ZsGreen1载体片段连接。连接产物转化DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆,酶切并测序鉴定。
(2)培养293T细胞及hADSCs。293T细胞培养体系:DMEM+10%FBS;0.075%I型胶原酶37℃消化人健康抽脂手术来源脂肪50min,离心后去上清,DMEM/F12+10%FBS重悬沉淀,37℃、5%CO2恒温培养箱接种培养293T细胞及hADSCs。
(3)Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1、RPEV、PRRE及VSVG四种质粒共转染293T细胞,37℃、5%CO2恒温培养箱中过夜培养,24h后换液,继续培养48h后,荧光显微镜下观察病毒包装结果。
(4)感染293T细胞72h后,收集293T细胞的培养液,并用0.45μm微孔滤器过滤。向生长状态良好、汇合率达80%左右的hADSCs中,加入原培养液体积的病毒液,进行病毒感染。
(5)感染效果检测。弃去24孔板细胞的培养液,加入4%多聚甲醛溶液500μL,固定20min;1mL0.2%吐温-20℃处理10min;封闭液处理60min;加入一抗anti-WGA 500μL,4℃敷育过夜;PBS洗涤3次后,加入500μL二抗,室温敷育2h;避光加入DAPI(1μg/mL)500μL,室温敷育15min。荧光显微镜观察结果。
(6)hADSCs移植治疗小鼠MCAO模型,制作脑冰冻切片并进行免疫组织化学染色。制备C57/BL6雌性小鼠大脑中动脉阻塞MCAO模型。MCAO术后7d,用WGA慢病毒感染的hADSCs移植治疗小鼠MCAO模型。采用原位注射的方式,将hADSCs(108细胞/只)均匀多点注入脑梗死损伤区域,缓慢退针,以防止细胞悬液外溢。一个月后,取小鼠脑损伤区制作冰冻切片,免疫组织化学染色后,示踪hADSCs在体内的存活及增殖情况。
1.5 实验结果
Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1感染的hADSCs移植治疗小鼠MCAO模型一个月后,取脑梗死区域制备冰冻切片,免疫组织化学染色示踪hADSCs在小鼠体内的存活、迁移及增殖情况。WGA蛋白显示红色荧光(下图A),Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1重组载体表达绿色荧光蛋白ZsGreen1(下图B),细胞核经DAPI染色后显示蓝色(下图C),下图D为合并后结果。实验结果表明hADSCs在小鼠体内存活、迁移并大量增殖。
免疫染色追踪MCAO小鼠模型脑损伤区的hADSCs图
2 教学效果
与传统的实验相比,引入的WGA实验具有明显的综合性、设计性、创新性的特点,将六个独立的小实验整合成一个系统性的大实验。在实验过程中,学生自主设计实验,操作实验,认真参与到实验的每一个具体环节中。这六个小实验,环环相扣,前一个实验是后一个实验的基础,其结果决定了后一个实验能否成功。当学生发现Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1感染的hADSCs移植治疗小鼠MCAO模型后,小鼠的脑功能得到恢复,hADSCs在小鼠体内存活并增殖,学生非常兴奋。学生们彼此之间团队协作,共同完成所有实验,实验达到预期结果,他们的成就感和满足感油然而生。也有部分学生最终没有观察到小鼠脑卒中症状的减轻,需要引导他们找出实验失败的原因。学生们从该实验中得到了多方面的锻炼,既开阔了思路,提高了动手能力,又进一步理解并巩固了理论知识[10]。
结语
Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1感染的hADSCs移植治疗小鼠MCAO模型,该实验具有综合性、设计性和创新性的特点。将该实验技术引入组织工程实验教学中,大大提高了学生的主动学习能力和实践能力[11]。学生们可以在实验过程中巩固生物学基本原理,拓展创新思维,提高科研能力,为他们今后的工作或深造打下坚实基础[12]。
