罗 俊，王娜娜，庄意琼，应国红，王晓炜

（深圳市药品检验研究院，广东 深圳 518057）

洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性杆菌。作为条件致病菌，能引起多种医院感染，包括败血症、心内膜炎、肺炎、伤口感染和脓肿等，且该菌在患者和患者之间具有较强的传播能力，由于其多重耐药特性，治疗相当困难，一旦在医院内出现暴发流行很难控制[1-2]。目前该菌已经被FDA明确为不可接受微生物（objectionable microorganism）[3]，根据FDA网站数据显示，从2019年1月至2021年8月因微生物污染被召回的26批化妆品中，有8批被洋葱伯克霍尔德菌污染，占比高达31%[4]。笔者将实验室近三年来微生物检测不合格化妆品中污染菌分离鉴定后发现，洋葱伯克霍尔德菌的检出率远高于《化妆品安全技术规范》[5]中要求的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，可见目前国内化妆品被洋葱伯克霍尔德菌污染的风险较高。

在各领域现行的标准体系中，洋葱伯克霍尔德菌定性检验方法有3种：SN/T 4684—2016《进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法》[6]、SN/T 4485—2016《进出口口腔清洁类产品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法》[7]及USP＜60＞Microbiological examination of nonsterile products-test for Burkholderia cepacia complex[8]。而笔者在化妆品中分离到的一株洋葱伯克霍尔德菌，在上述3种检验方法中的选择性培养基中均无法生长，如果污染了该分离菌的样品采用这3种方法检验，则无法检出，因此提升化妆品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法的适用性很有必要。本文以该样品分离菌及3株洋葱伯克霍尔德菌标准菌株作为测试菌，选取3种标准中使用的液体培养基，开展生长特性研究；并通过测试庆大霉素对各试验菌的最低抑菌浓度，非目标菌抑制试验以及药敏试验等，分析了该分离菌无法被检出的主要原因，确定检验方法中最优的抗生素添加剂，并以此为依据对化妆品中洋葱伯克霍尔德菌的检验方法提几点改进建议。

1 仪器与材料

1.1 仪器

MSC-Advantage A2型生物安全柜，BF400恒温培养箱，GF54DA立式自动压力蒸汽灭菌器。

1.2 菌株

洋葱伯克霍尔德菌：1株为本实验室从样品中分离获得（编号A，同下文），另3株标准菌株分别为ATCC 25416、ATCC BAA-245及ATCC BAA-247，来自美国典型菌种保藏中心。

非目标菌：金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、乙型副伤寒沙门氏菌CMCC（B）50094及铜绿假单胞菌CMCC（B）10104，均来自中国医学细菌菌种保藏管理中心。

1.3 培养基及配套试剂

1.3.1 USP＜60＞培养基

pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（pH7.0），TSB以及洋葱伯克霍尔德菌选择性琼脂（BCSA++）均来自广东环凯。

1.3.2 SN/T 4684—2016培养基

含庆大霉素的洋葱伯克霍尔德菌增菌液（BCSB+），含多黏菌素B的SCDLP增菌液（SCDLP+），含多黏菌素B和庆大霉素的洋葱伯克霍尔德菌选择性琼脂（BCSA+）及含多黏菌素B和庆大霉素的麦康凯琼脂培养基（MAC+）来自青岛海博。

1.3.3 SN/T 4485—2016培养基

SCDLP，改良letheen肉汤（MLET）来自广东环凯，BCC培养基（BCA++）来自北京三药。

1.3.4 配套试剂洋葱伯克霍尔德菌选择性琼脂（BCSA）配套试剂来自广东环凯，BCC培养基配套试剂来自北京三药。

1.3.5 其他培养基TSA、麦康凯琼脂培养基（MAC）均来自广东环凯；TSA对照培养基来自中检院。

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1.4 试剂

（1）生理盐水：按GB 7918.1—1987依法配制。

（2）庆大霉素溶液（1 mg/mL）：购自青岛海博。

2 方法

2.1 不同浓度菌悬液的制备

取4株洋葱伯克霍尔德菌划线至TSA平板，置32.5℃培养24 h，配制成2.0左右麦氏浓度的菌悬原液，备用；再用无菌生理盐水稀释至含量为每1 mL含101、102、103、104cfu的菌悬液，备用。

取5株非目标菌划线至TSA平板，置32.5℃培养24 h，再用无菌生理盐水稀释至含量为每1 mL含104cfu的菌悬液，备用。

2.2 液体培养基的生长特性研究

取2.1项下4株洋葱伯克霍尔德菌的101、102、103菌悬液1 mL接种至各液体培养基中，每种浓度每种培养基制备1管，置32.5℃培养，逐日观察结果，必要时，划线至TSA培养基培养，以确认是否有菌生长。

2.3 庆大霉素对各试验菌的最低抑菌浓度（MIC）[9]测定

取1.4（2）庆大霉素溶液1 mL，用无菌TSB作为稀释液，稀释50倍至20μg/mL，再按二倍稀释法[10]，分别稀释至10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/mL，制成装量为10 mL的培养管，每个质量浓度各平行制备3管，每管接种2.1项下4株洋葱伯克霍尔德菌的菌悬原液各100 μL，取无庆大霉素的TSB管接种相应试验菌作为阳性对照管，置32.5℃培养48～72 h，用肉眼观察其浑浊度，并记录浑浊管数。

2.4 非目标菌抑制试验

按2.3项下制备的含0.625μg/mL庆大霉素的TSB管，分别接种2.1项下金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门氏菌及铜绿假单胞菌菌悬液各100 μL，取无庆大霉素的TSB管接种相应试验菌做为阳性对照管，置32.5℃培养48～72 h，用肉眼观察其浑浊度，并记录浑浊管数。

2.5 药敏试验

用无菌棉签将4株洋葱伯克霍尔德菌的TSA培养物挑取至相应的鉴定肉汤中，配制成0.5～0.6麦氏浓度的菌悬液，每株试验菌各取1支药敏肉汤，分别滴加1滴药敏指示剂，再取已制备好的各试验菌菌悬液25 μL分别转移至药敏肉汤中，混匀，将鉴定肉汤和药敏肉汤分别倒入鉴定/药敏板中，依法上机测试。

3 结果与分析

对比3种标准的培养体系，详见表1，3种标准均采用了传统的增菌后划线分离的方法，但使用的培养基各有不同。

表1 3种洋葱伯克霍尔德菌检验方法的培养基列表

3.1 液体培养基生长特性研究

为了考察菌株A在各标准培养体系中的生长情况，本研究选取了TSB、SCDLP+、BCSB+和MLET等4种液体培养基，以菌株A及3株洋葱伯克霍尔德菌标准菌株作为试验菌，开展生长特性研究。液体培养基生长特性研究结果表明，不同浓度的标准菌株在各液体培养基中均生长良好，并无显着性差别，详见表2；但各浓度的菌株A在BCSB+中均无法生长，且在培养基SCDLP+、TSB和MLET中，也出现不同程度的生长缓慢情况，为进一步探究菌株A在BCSB+中不生长的原因，对各培养基的成分表进行分析，详见表3。

表2 液体培养基生长特性研究结果

各浓度的菌株A在BCSB+均不能生长，说明该培养基缺少该菌株生长必需的某种营养成分，或该培养基中有抑制菌株A生长的成分。葡萄糖、蔗糖、乳糖及牛肉膏等为培养物提供碳源，酪蛋白胰酶消化物、蛋白胨/大豆蛋白胨、大豆粉木瓜蛋白酶消化物和酵母提取物等为培养物提供氮源，氯化钠维持渗透压，酚红为pH指示剂，结晶紫可抑制革兰氏阳性菌及部分真菌生长，庆大霉素可抑制革兰氏阴性菌及部分革兰氏阳性菌生长[11]。仔细分析表3不难发现，各培养基中的碳源、氮源及渗透压调节剂基本一致，pH并无显着性差别，可见BCSB+中并不缺少该菌株生长必需的某种营养成分，且菌株A为革兰氏阴性菌。由此推断，庆大霉素可能抑制了该菌的生长。

表3 3种检验方法涉及的液体培养基配方

3.2 庆大霉素对各试验菌的最低抑菌浓度（MIC）测定

由表4可知，3株标准菌株在含0.3125～20 μg/mL庆大霉素的TSB中均生长良好，而菌株A在含1.25～20μg/mL庆大霉素的TSB中均无法生长，仅在含0.312 5～0.625 μg/mL庆大霉素的TSB中可以生长，可见标准菌株对庆大霉素的耐受度较高，而菌株A对庆大霉素较敏感，所以庆大霉素对菌株A的MIC为0.625 μg/mL，庆大霉素对3株标准菌株的MIC均大于20 μg/mL。

表4 庆大霉素对各试验菌的MIC测定

3.3 非目标菌抑制试验

庆大霉素作为抗生素添加剂添加至选择性培养基中，是为了抑制非目标菌的生长，从而提升目标菌的检出率[11]。而庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素，主要用于治疗细菌感染，尤其是革兰氏阴性菌引起的感染，革兰阳性菌中，金黄色葡萄球菌对本品敏感[12]。故本次试验选取了对庆大霉素相对敏感的4株非目标菌，分别为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门氏菌及铜绿假单胞菌等作为试验菌。实验结果表明（表5）：该质量浓度的庆大霉素能抑制一定程度的金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌，但无法抑制大肠埃希菌和沙门氏菌。如果将培养基配方中庆大霉素的含量降低至0.625μg/mL时，则不能达到抑制非目标菌的效果。

表5 非目标菌抑制试验

3.4 药敏试验

由上文可知，洋葱伯克霍尔德菌选择性培养基中添加庆大霉素，会导致菌株A无法检出，为了筛选出更多可以替代庆大霉素的抗生素添加剂，采用全自动微生物鉴定及药敏系统，取4株洋葱伯克霍尔德菌TSA纯培养物上机测试。该设备可完成试验菌的鉴定以及各抗生素最低抑菌浓度的定量药物敏感性测试，试验结果见表6，庆大霉素对4株洋葱伯克霍尔菌的测试值与上文中MIC测试结果基本一致，3株标准菌株大于药敏板上限值（8μg/mL），菌株A低于药敏板下限值（2μg/mL）。另外，当4株菌的某种抗生素测试值均大于其上限值时，说明目标菌对这种抗生素的耐受度较高，有应用于化妆品中洋葱伯克霍尔菌的检测方法的可能性，符合条件的抗生素分别为头孢唑林、氨苄青霉素及四环素等。

表6 药敏试验结果 μg·mL-1

4 结束语

洋葱伯克霍尔德菌是洋葱伯克霍尔德菌菌群中最常见的菌株之一，该菌群有20余种[13]，菌株A对庆大霉素非常敏感，但3株标准菌株耐受度较高，可见该菌群内各菌株生长特性各异。基于此，本研究对化妆品中洋葱伯克霍尔德菌的检验方法提出几点改进建议。

首先应优化添加抗生素的种类及质量浓度，头孢唑林、氨苄青霉素及四环素等均可作为庆大霉素抗生素的替代品，但具体添加质量浓度还有待于进一步试验研究；另外李诗瑶等[14]在沙门氏菌的定性检验时，采用了多种选择性平板进行划线分离，显着提高检出率。王似锦等[15]在对凝胶剂中1株洋葱伯克霍尔德菌的生长特性研究结果表明，该菌在选择性培养基麦康凯琼脂和紫红胆盐琼脂培养基中也生长良好。可见在化妆品中洋葱伯克霍尔德菌的检验方法中，也可联用多种选择性平板作为划线分离平板，在兼顾选择性及目标菌生长特性的同时，提升检出率。