黄世超，王丙武，陈向阳

1徐州医科大学附属医院骨科，江苏 徐州221000

2徐州医科大学临床医学系，江苏 徐州2210000

骨肉瘤是一种常见的骨原发恶性肿瘤，有侵袭力强、转移率高等特点，治疗难度较大[1]。化疗是目前治疗该病的常见方法，该方法虽然大大提高了患者的生活质量，但仍有约一半的患者因化疗后转移死亡[2]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种促血管生成因子，是影响恶性肿瘤新生血管形成的重要因素之一。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是一类内肽酶，在肿瘤的发展以及血管的生成过程中发挥了重要作用[3-4]。VEGF和MMP[主要是基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）]是抗血管生成治疗的两个重要靶因子，广泛参与肿瘤的恶性侵袭和转移。VEGF和MMP多集中表达于上皮源性肿瘤，有关VEGF和MMP与骨肉瘤关系的报道较少。为此，本研究探讨VEGF和MMP在骨肉瘤中的表达及临床意义，以指导骨肉瘤抗血管生成治疗，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年5月至2017年7月徐州医科大学附属医院接诊的骨肉瘤患者的病历资料。纳入标准：符合世界卫生组织（WHO）关于骨肉瘤的诊断标准[5]，且经病理学检查确诊。排除标准：合并其他器官恶性肿瘤者。根据纳入、排除标准共纳入80例骨肉瘤患者，其中男43例，女37例；年龄18～50岁，平均（23.9±8.2）岁；肿瘤部位：四肢54例，躯干26例；肿瘤大小：≤4 cm 47例，＞4 cm 33例；Enneking分期[6]：Ⅱ期44例，Ⅲ期36例；有软组织浸润52例，无软组织浸润28例。所有患者均取手术切除骨肉瘤标本。选取同期在徐州医科大学附属医院治疗的50例非瘤性骨折患者作为对照，用活检夹取黏膜下层组织，其中男28例，女22例；年龄16～51岁，平均（22.3±7.7）岁。骨肉瘤与非瘤性骨折患者的性别和年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 检测方法

二氨基联苯胺显色剂购自上海嵘崴达实业有限公司。所有的待检测组织标本均经中性福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm连续切片。根据免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（streptavidin-perosidase，SP）试剂盒（购自上海天呈医流科技股份有限公司）说明书，检测骨肉瘤和非瘤性骨组织中VEGF、MMP2和MMP9蛋白表达情况，以磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作为阴性对照，以已知的VEGF、MMP2、MMP9阳性切片作为阳性对照。

结果判定：以细胞膜黄染和（或）细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，计数5个高倍镜视野，避开出血、坏死和肿瘤细胞变性区域。MMP2和MMP9仅作定性分析，阳性细胞所占百分比＞5%为阳性；VEGF作半定量分析，阳性细胞所占百分比＜10%为阴性（-），≥10%且＜50%为弱阳性（+），≥50%且＜80%为中等阳性（++），≥80%为强阳性（+++），除阴性（-）外，均为阳性。

1.3 观察指标

①比较骨肉瘤组织与非瘤性骨组织中VEGF、MMP2和MMP9的阳性表达率；②分析骨肉瘤组织中VEGF、MMP2和MMP9的表达情况与肿瘤大小、肿瘤部位、Enneking分期和有无软组织浸润的关系；③分析骨肉瘤组织中MMP2、MMP9与VEGF表达的相关性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关分析法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF、MMP 2和MMP 9阳性表达情况的比较

骨肉瘤组织中VEGF、MMP2和MMP9的阳性表达率均明显高于非瘤性骨组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 骨肉瘤组织与非瘤性骨组织中VEGF、MMP 2和MMP 9阳性表达情况的比较[ n（%）]

2.2 VEGF、MMP 2和MMP 9的表达与临床特征的关系

不同肿瘤大小、肿瘤部位的骨肉瘤患者的骨肉瘤组织中VEGF、MMP2和MMP9阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。Enneking分期为Ⅲ期、有软组织浸润的骨肉瘤患者的骨肉瘤组织中VEGF、MMP2和MMP9阳性表达率均高于Enneking分期为Ⅱ期、无软组织浸润的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 不同临床特征骨肉瘤患者的骨肉瘤组织中VEGF、MMP 2和MMP 9的阳性表达情况（ n=80）

2.3 MMP 2、MMP 9与VEGF表达的相关性

骨肉瘤组织中MMP2、MMP9与VEGF表达均呈显着正相关（r=0.657、0.510，P＜0.01）。

3 讨论

骨肉瘤是一种好发于青少年的恶性骨肿瘤，会导致患者骨骼畸形，进而造成肢体残疾，严重者会危及生命。骨肉瘤的生长、浸润以及转移的过程受到诸多因素的影响，多种基因和蛋白参与其中[7]。近年来，影像学和病理学技术取得了较快的发展，骨肉瘤的诊断和治疗方法也有了显着的进展和突破。目前，骨肉瘤的诊断一般通过病理学检查，治疗方法通常是手术切除辅以化疗和靶向治疗等，但其确诊的难度和复发问题仍未完全解决。骨肉瘤发展和转移的过程与肿瘤新生血管的形成和细胞外基质的降解密切相关[8-9]。

VEGF是一种促血管生成因子，在多种实体瘤的进展中发挥着关键作用。在各种多肽类血管生长因子中，VEGF针对血管内皮的特异度最高[10]。VEGF能够促进血管内皮细胞的增殖和血管的新生，增强其通透性。实体瘤的血管新生与肿瘤细胞分泌的多种血管生长因子有关[11-12]。MMP是一类蛋白水解酶，能够降解所有的细胞外基质，在骨肉瘤的发生与发展过程中的各个环节起关键作用。健康人的MMP表达水平通常较低，而恶性肿瘤患者的MMP表达水平明显高于健康人。MMP2通常存在于多种恶性肿瘤中，以酶原的形式分泌至细胞外基质中，促进肿瘤细胞进入血管或淋巴管[13-14]。MMP2还可诱导血管生成，进而促进肿瘤细胞的增殖和转移[15]。MMP9可以调节肿瘤细胞的生长环境和血管生长，促进肿瘤细胞的侵袭和转移以及血管内皮细胞的迁移，生成新的血管[16]。

本研究结果显示，骨肉瘤组织中VEGF、MMP2和MMP9的阳性表达率分别为62.5%、70.0%和65.0%，均明显高于非瘤性骨组织的10.0%、14.0%和14.0%，表明三者在骨肉瘤组织中高表达，在骨肉瘤的进展过程中发挥了重要作用，此结果也符合上述结论。本研究分析了骨肉瘤组织中VEGF、MMP2和MMP9的表达与临床特征的关系，结果显示，不同肿瘤大小、肿瘤部位的骨肉瘤患者的骨肉瘤组织中VEGF、MMP2和MMP9阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。Enneking分期为Ⅲ期、有软组织浸润的骨肉瘤患者的骨肉瘤组织中VEGF、MMP2和MMP9阳性表达率均高于Enneking分期为Ⅱ期、无软组织浸润的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明VEGF、MMP2和MMP9的表达与软组织浸润和Enneking分期有关。有研究报道，细胞外基质和基底膜的降解为肿瘤周围浸润的生物学基础，MMP在细胞外基质和基底膜的降解中承担着重要作用[17]，因而MMP广泛参与肿瘤组织的浸润及转移，这与本研究结果吻合。软组织浸润和Enneking分期均与骨肉瘤的预后有关，因此，可以认为VEGF、MMP2和MMP9的高表达会给患者带来较差的预后。本研究分析了骨肉瘤组织中VEGF与MMP2、MMP9表达的相关性，结果显示MMP2、MMP9与VEGF的表达均呈显着正相关。提示VEGF与MMP2、MMP9在骨肉瘤的侵袭生长和转移过程中有正向调节作用，协同参与骨肉瘤的发生和发展，而且三者的表达情况可以作为判断肿瘤侵袭能力的标志。有研究认为在此过程中MMP9作为重要调节因子，在信号转导通路中处于VEGF上游位置[18]。综上所述，VEGF、MMP2和MMP9在骨肉瘤组织中高表达，且其表达均与患者的软组织浸润和Enneking分期有关，三者协同参与了骨肉瘤的发生和发展。