曹静，路鹏霏，万学峰#

新疆医科大学第一附属医院1皮肤科，2肿瘤中心，乌鲁木齐 830000

恶性黑色素瘤简称恶黑，是一种来源于黑色素细胞的恶性肿瘤，主要发生于皮肤，也见于皮肤-黏膜交界处、眼脉络膜和软脑膜等部位，具有恶性程度高、进展快、转移早、预后差及病死率高等特点。皮肤恶性黑色素瘤约占皮肤恶性肿瘤的1%，病死例数占皮肤恶性肿瘤病死例数的80%以上[1]。近年来，恶性黑色素瘤的发病率在全世界呈上升趋势，在西方国家中尤为显着，目前已成为白种人最常见的恶性肿瘤之一[2]。近些年中国恶性黑色素瘤的发病率也逐渐上升，目前每年新发病例数2万余例[3]。喹啉酸磷酸核糖基转移酶（quinolinate phosphoribosyltransferase，QPRT）基因位于16 号染色体短臂，由35 421 个碱基对组成。QPRT 蛋白由297 个氨基酸组成，分子量为30 846 Da，是由3 个二聚体结合而成的六聚体，它是参与喹啉酸分解代谢的Ⅱ型磷酸核糖基转移酶家族成员[4]。喹啉酸是色氨酸-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸途径的中间产物，也是一种对神经元作用很强的内源性神经毒素，QPRT 对维持喹啉酸在大脑中的稳态必不可少[5]。有研究表明，QPRT 对神经退行性改变的反应增加，与癫痫、阿尔茨海默病和亨廷顿病等神经退行性疾病的发病机制有关[6]。有文献报道，QPRT基因在甲状腺肿瘤、肝细胞肿瘤及血液系统肿瘤等肿瘤性疾病中发挥作用[7-9]。本研究通过生物信息学方法分析QPRT基因在恶性黑色素瘤中的表达及潜在生物学功能，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料收集

应用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（http://cancergenome.nih.gov/）和基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）检索恶性黑色素瘤患者的临床资料，如基本特征、治疗过程、临床分期、病理类型、生存情况以及组织标本中QPRTmRNA 及蛋白表达情况等。

1.2 QPRT mRNA 表达水平分析

利用基因表达谱互动分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）数据库对TCGA 数据库中恶性黑色素瘤组织和正常皮肤组织中QPRTmRNA 表达水平进行分析。利用UALCAN 数据库（http://ualcan.path.uab.edu/）对TCGA数据库中不同临床分期恶性黑色素瘤患者恶性黑色素瘤组织中QPRTmRNA 的表达水平进行分析。

1.3 生存分析

应用GEPIA 数据库分析不同QPRTmRNA 表达情况恶性黑色素瘤患者的预后。

1.4 QPRT 蛋白表达情况分析

应用人类蛋白质参考数据库（Human Protein Reference Database，HPRD）分析正常皮肤组织、原发性黑色素瘤组织及转移性黑色素瘤组织中QPRT 蛋白的表达情况。

1.5 蛋白质相互作用网络

应用GeneMANIA 数据库查找与QPRT 相互作用的蛋白。

1.6 基因功能分析

WebGestalt 是一个基因功能富集分析的在线网站，将与QPRT 相互作用的关键基因利用Web-Gestalt 进行基因本体（Gene Ontology，GO）分析，了解其参与的细胞组分、生物过程、生物功能。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，组间比较采用Logrank 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 恶性黑色素瘤组织和正常皮肤组织中QPRT mRNA 表达水平的比较

通过GEPIA 数据库在线分析TCGA 数据库中461 例恶性黑色素瘤组织和558 例正常皮肤组织中QPRTmRNA 表达水平，结果发现，恶性黑色素瘤组织中QPRTmRNA 表达水平明显高于正常皮肤组织，差异有统计学意义（P＜0.01）。（图1）

2.2 不同临床分期恶性黑色素瘤患者恶性黑色素瘤组织中QPRT mRNA 表达水平的比较

基于UALCAN 数据库分析不同临床分期恶性黑色素瘤患者恶性黑色素瘤组织中QPRTmRNA表达水平，结果显示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期恶性黑色素瘤患者恶性黑色素瘤组织中QPRTmRNA 表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（图2）

图2 不同临床分期恶性黑色素瘤患者恶性黑色素瘤组织中QPRT mRNA表达水平

2.3 不同QPRT mRNA 表达情况恶性黑色素瘤患者预后的比较

应用GEPIA 数据库分析不同QPRTmRNA 表达情况恶性黑色素瘤患者的预后，以QPRTmRNA表达水平的中位数为界将458 例恶性黑色素瘤患者分为QPRT 高表达组（n=229）和QPRT 低表达组（n=229），结果显示，QPRT 低表达组患者的总生存情况和无病生存情况均优于QPRT 高表达组，差异均有统计学意义（HR=1.3、1.3，P＜0.05）。（图3）

图3 不同QPRT表达情况恶性黑色素瘤患者的无病生存曲线和总生存曲线

2.4 恶性黑色素瘤组织中QPRT 蛋白表达情况

免疫组织化学检测结果显示，在正常皮肤组织中，QPRT 蛋白阴性表达（黑色素细胞中也为阴性），在恶性黑色素瘤组织中QPRT 蛋白呈强阳性表达，QPRT 蛋白主要在细胞质内均匀分布，呈棕褐色。在原发性黑色素瘤组织与转移性黑色素瘤组织中，QPRT 蛋白均为强阳性表达。（图4）

图4 正常皮肤组织和恶性黑色素瘤组织中QPRT蛋白表达情况（免疫组化染色，×400）

2.5 QPRT 蛋白相互作用网络预测及功能分析

GeneMANIA 数据库共筛选出20 个与QPRT 相互作用的蛋白质：AC009133.22、支链α-酮酸脱氢酶（branched chain alpha-keto acid dehydrogenase kinase，BCKDK）、丙酮酸脱氢酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）、载脂蛋白C1（apolipoprotein C1，APOC1）、组织蛋白酶D（cathepsin D，CTSD）、PTB 结合核蛋白2（ribonucleoprotein,PTB binding 2，RAVER2）、加工前体4（processing of precursor 4，POP4）、ATP 结合盒转运蛋白亚家族C 成员1（ATP binding cassette subfamily C member 1，ABCC1）、PAT1 同源物1（PAT1 homolog 1，PATL1）、神经连接蛋白3（neuroligin 3，NLGN3）、抗氧化剂1 铜伴侣蛋白（antioxidant 1 copper chaperone，ATOX1）、TRAF3 结合蛋白2（TRAF3 interacting protein 2，TRAF3IP2）、甘氨酸脱氢酶（glycine decarboxylase，GLDC）、核蛋白1（nuclear protein 1，NUPR1）、纹蛋白4（striatin 4，STRN4）、核质蛋白α6（karyopherin subunit alpha 6，KPNA6）、核质蛋白β1（karyopherin subunit beta 1，KPNB1）、异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）、烟碱酸磷酸核糖基转移酶（nicotinate phosphoribosyltransferase，NAPRT）、烟酰胺磷酸核糖基转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT），相互作用关系包括物理相互作用、共表达、共享蛋白质结构域、共定位等。（图5）

图5 GeneMANIA数据库分析QPRT相互作用蛋白

2.6 GO 功能分析

对上述基因参与的生物过程、细胞组分、分子功能进行分析发现，这些蛋白主要参与了代谢过程、生物调节、定位等生物过程；QPRT相关基因位于多种细胞组分中，包括细胞质、细胞膜、细胞外间隙、内膜系统等；分子功能包括蛋白结合、离子结合、核酸结合、参与转运体活动等。（图6）

图6 与QPRT相互作用关键基因的GO功能富集分析

3 讨论

随着高通量测序技术及微阵列杂交技术的迅速发展，产生了大量基因数据，包含肿瘤表观组、基因组及转录组等信息。为了满足研究人员信息共享的需求，多个基因数据库应运而生，目前已广泛应用于基因表达定量分析，为肿瘤研究提供了良好的平台。本研究分析TCGA 数据库中的芯片数据，探索恶性黑色素瘤中QPRT的表达水平。高通量测序技术具有自动化、低成本等特点，研究结果可靠，可用于发现新的具有较大意义的基因。近年来，RNA、蛋白质等在肿瘤中异常表达的研究较多，然而QPRT 在恶性黑色素瘤中的作用尚不清楚。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD，又称NAD+），曾称为二磷酸吡啶核苷酸或辅脱氢酶Ⅰ或氧化型辅酶Ⅰ，可传递电子，是体内很多脱氢酶的辅酶，连接三羧酸循环和呼吸链，其功能是将代谢过程中脱下来的氢传递给黄素蛋白，参与多种代谢活动[10]。QPRT 可催化喹啉酸生成烟酸单核苷酸，是辅酶NAD 从头合成的前体，故QPRT 是调控三羧酸循环及呼吸链的重要酶。喹啉酸具有内源性神经毒性，既往研究已明确QPRT 在神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、亨廷顿病等疾病中发挥重要作用。又有学者在孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）患者中发现QPRT基因变异，通过观察抑制QPRT功能后神经母细胞瘤细胞的变化得出，QPRT 对SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞分化具有很强的调控作用，且存在因果关系，提示QPRT 在ASD 的发病机制中起重要作用[11]。

近年来，除神经系统疾病外，QPRT 在肿瘤相关疾病中的作用也逐渐被发现。Hinsch 等[7]对甲状腺肿瘤患者的基因表达情况进行分析，结果发现，QPRT在滤泡性甲状腺腺瘤和滤泡性甲状腺癌中表达不同，并通过免疫组化法进行验证，得出65%的滤泡性甲状腺癌表达QPRT 蛋白，仅22%的滤泡性甲状腺腺瘤表达QPRT 蛋白，提示QPRT 参与甲状腺肿瘤的发生、发展过程，可能成为免疫组织化学筛查滤泡性甲状腺结节的潜在标志物。Sahm 等[12]对脑胶质瘤的研究发现，QPRT 不仅在神经退行性疾病中发挥作用，也参与胶质瘤的进展，肿瘤恶性程度越高，QPRT 的表达水平也越高，并且在放化疗后复发的胶质母细胞瘤中，QPRT 表达升高与预后不良有关。进一步研究发现，QPRT 高表达可增强肿瘤细胞对放化疗诱导的氧化应激的抵抗力，发挥抗凋亡作用，从而导致预后较差，提示QPRT 可能成为脑胶质瘤的潜在治疗靶点[13]。Wilms 肿瘤基因1（Wilms tumor gene 1，WT1）是一种转录因子，被认为是白血病的癌基因，QPRT是与WT1相关性最高的基因之一。Ullmark 等[8]研究QPRT 是否在白血病的发病中发挥作用，通过在白血病K562 细胞中过表达QPRT，发现细胞对抗白血病药物伊马替尼产生部分耐药性，也提示QPRT可能具有抗凋亡功能，这与上述关于胶质瘤细胞的报道一致。有研究发现，QPRT可能是乳腺癌的促癌基因，可通过影响肌球蛋白轻链磷酸化促进乳腺癌侵袭[14]。另有研究发现，QPRT 在乳腺癌中表达上调，尤其是在人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性乳腺癌中，明确了QPRT 是浸润性乳腺癌的独立预后因素，并且与免疫细胞浸润息息相关[15-16]。在结肠癌中同样发现QPRT 高表达与预后不良相关[17]。有研究发现，QPRT 蛋白在肝细胞癌患者组织间隙液中的表达水平明显低于健康者，提示该蛋白参与了肝细胞癌的发生过程，但具体作用机制尚需研究[9]。此外，也有基因表达分析的研究显示，QPRT基因在子宫平滑肌瘤中高表达，是正常子宫平滑肌的3.6倍[18]。

学者们逐渐开始关注QPRT基因在肿瘤相关疾病，尤其是恶性肿瘤相关疾病中的作用，但是在恶性黑色素瘤中的作用尚未有相关报道。本文通过整合公共数据库发现QPRT 在恶性黑色素瘤组织中高表达，且QPRT 高表达与预后不良相关，虽然QPRT基因表达水平在不同临床分期恶性黑色素瘤组织中未见明显差异，但仍可能是区分肿瘤良恶性的重要标志物。虽然目前现有数据提示QPRT基因与肿瘤临床分期、恶性程度无明确相关性，但其可对恶性黑色素瘤的诊断及预后评估提供参考，对肿瘤疗效评价的作用仍需进一步探讨。以上结果均提示QPRT基因参与恶性黑色素瘤的发生并发挥重要作用，猜测其可能的机制如下：①恶性黑色素瘤的恶性程度高，易发生侵袭、转移等恶性生物学行为，这正是肿瘤细胞增殖活跃的表现，该基因参与调控三羧酸循环及呼吸链反应，为机体提供能量，参与机体新陈代谢，因此有可能通过QPRT基因表达上调为肿瘤细胞提供更多能量，使肿瘤细胞增殖活跃，促进其快速进展、转移，导致预后不良。②结合既往学者研究，QPRT 高表达可增加肿瘤细胞对放疗、化疗的抵抗力，发挥抗凋亡作用，但其具体作用机制仍需进一步研究。

目前恶性黑色素瘤的治疗仍以手术为主，同时积极探索新的治疗方法，如免疫治疗和靶向治疗等。中国恶性黑色素瘤患者对靶向治疗的反应与西方人群类似，但对免疫治疗的反应不如西方人群[3]，因此国内也在积极开展恶性黑色素瘤方面的研究，以打破传统治疗的束缚。本文通过生物信息学分析发现，QPRT基因在恶性黑色素瘤中明显高表达，可能成为潜在的治疗靶点；免疫组化法检测显示，QPRT在恶性黑色素瘤组织中呈强阳性表达，提示该蛋白有望成为筛查恶性黑色素瘤的生物标志物；同时QPRT基因高表达与预后不良相关，可为恶性黑色素瘤的预后判断提供新的参考依据。

综上所述，QPRT基因在恶性黑色素瘤中高表达，其高表达与恶性黑色素瘤患者的预后不良相关，可能成为筛查恶性黑色素瘤的标志物及治疗靶点。QPRT 可为恶性黑色素瘤的筛查诊断、靶向治疗及预后评估提供新的探索方向。由于本研究参考的数据库源于国外，而恶性黑色素瘤在不同人种、地区的发病率及类型差异较大，本课题组后续将进一步研究及验证QPRT基因在中国恶性黑色素瘤患者中的表达情况。