王 鑫，冯 星，吴 娟，胡季芳，王颖星，鲁衍强△
1.上海计生所医院检验科,上海 200032; 2.上海张江普汇转化医学研究院,上海 201314
叶酸是人体重要的营养素，叶酸摄入不足或代谢障碍会造成体内同型半胱氨酸(Hcy)升高和甲基化降低，从而导致高同型半胱氨酸血症(≥15 μmol/L)[1]的发生。同时孕期叶酸营养不足会导致神经管畸形[2]、先天性心脏病[3]、唐氏综合征[4]、唇腭裂[5]等出生缺陷，并与流产[6]、早产[7]等不良妊娠结局及妊娠期糖尿病[8]、妊娠期高血压[9]等疾病密切相关。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)是叶酸代谢通路中的关键酶，基因多态性决定了不同的酶活性及叶酸利用能力。本研究旨在分析上海市汉族育龄女性MTHFR和MTRR基因多态性分布，以及基因多态性与血清叶酸、Hcy水平的相互关系。
1 资料与方法
1.1一般资料 选取2018年3月至2020年1月在上海计生所医院进行妇科检查的女性2 651例，均为汉族、非孕期，年龄19～59岁，平均(33.77±5.27)岁。
1.2研究方法 依据知情同意原则采集口腔黏膜细胞。利用硅胶吸附法提取基因组DNA。采用荧光定量PCR技术，检测MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多态性。相关仪器、试剂均购自美国ABI公司。
抽取研究对象空腹静脉血，及时分离血清并置于-20 ℃冰箱备检。用雅培全自动化学发光免疫分析仪i2000，化学发光法测定血清叶酸水平，试剂盒购自雅培商贸(上海)有限公司；用Mindray BS-860生化分析仪以酶法测定血清Hcy 水平，试剂盒购自重庆中元生物技术有限公司。
2 结 果
2.1MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多态性分布 入组对象的MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多态性分布符合遗传平衡(P>0.05)，见表1。说明数据来自同一孟德尔群体，标本具有群体代表性。入组对象MTHFR C677T CC、CT、TT基因型多态性分布分别为33.2%、47.9%、18.9%，C、T等位基因频率分别为57.1%、42.9%；MTHFR A1298C AA、AC、CC基因型的多态性分布分别为66.6%、30.5%、2.9%，A、C等位基因频率分别为81.8%、18.2%；MTRR A66G AA、AG、GG基因型的多态性分布分别为56.4%、36.9%、6.8%，A、G等位基因频率分别为74.8%、25.2%。
2.2MTHFR C677T和A1298C连锁及单倍型分析 MTHFR C677T和A1298C两位点连锁情况见表2，有7种组合，频率最高的是CT/AA(31.9%)，没有CT/CC和TT/CC组合。MTHFR C677T和A1298C两个位点构建的单倍型存在4种组合：TA(42.7%)、CA(39.1%)、CC(18.1%)、TC(0.1%)，两位点间存在完全连锁不平衡(D′=0.984，R2=0.161)。
表2 MTHFR C677T和A1298C连锁型分布[n(%)]
2.3不同基因型与血清叶酸和Hcy水平的相关性 MTHFR C677T不同基因型的叶酸和Hcy水平差异有统计学意义(P<0.05)。TT基因型的叶酸水平低于CC基因型，TT基因型的Hcy水平比CC基因型高17.9%。MTHFR A1298C和MTRR A66G不同基因型的叶酸及Hcy水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。同时经单因素Logistic分析发现，MTHFR C677T中CT 型与 TT 型发生高Hcy血症的OR值为9.97倍(95%CI:3.81～26.05，P<0.05)，见表4。
表3 MTHFR、MTRR不同基因型女性血清叶酸和Hcy水平分析
续表3 MTHFR、MTRR不同基因型女性血清叶酸和Hcy水平分析
表4 MTHFR C677T与高Hcy血症的单因素Logistic分析
2.4Hcy与叶酸水平的相关性 将叶酸水平与Hcy水平进行单因素分析，结果显示呈线性相关关系(Y=0.079 7X+10.6，R2=0.061，P<0.01)，表明在其他因素不变的情况下，叶酸水平可解释Hcy水平个体差异的6.1%，且Hcy水平与叶酸水平呈负相关。见图1。
图1 Hcy与血清叶酸关系的散点图
3 讨 论
Hcy是蛋氨酸代谢的中间产物，俗称“邪恶氨基酸”。体内Hcy蓄积会降低甲基化水平，损伤血管内皮细胞，是心血管疾病、神经系统疾病的危险因素。Hcy水平与母婴健康密切相关，可以指导孕前保健和优生优育，作为叶酸营养评价指标及妊娠相关疾病和胎儿出生缺陷的预测指标[10-12]。在叶酸代谢通路中，MTHFR和MTRR是关键酶，在蛋氨酸转化及DNA合成过程中，Hcy发挥重要作用。MTHFR是叶酸代谢过程中的关键酶，催化5,10-亚甲基四氢叶酸生成5-甲基四氢叶酸，这是Hcy转化为甲硫氨酸的必要条件[13]。MTHFR C677T是重要的基因多态性位点，不同的基因型决定了不同的酶活性，从而影响体内的叶酸代谢能力和Hcy水平。目前对于不同地区育龄女性MTHFR、MTRR基因多态性分布的研究有很多报道[14-15]，这些研究为育龄女性补充叶酸提供重要依据。2017年方绮雯等[16]对上海地区孕妇 MTHFR C677T 基因多态性与血浆Hcy水平的关联性进行分析，该研究为筛选高危孕妇提供理论依据，但并未对MTHFR、MTRR基因多态性分布与血清叶酸和Hcy水平的关系进行研究。上海市育龄女性MTHFR C677T TT的基因型频率为18.9%，C677T T等位基因频率为42.9%，低于已有报道的山东淄博市(43.6%，65.6%)[17]、河南新乡市(38.9%，62.0%)[18]、辽宁沈阳市(31.3%，56.6%)[19]等地数据，高于浙江丽水市(14.0%、37.7%)[20]、广东佛山市(5.6%，21.5%)[21]等地，显示出明显的地域特异性。MTHFR C677T和A1298C连锁及单倍型分析，研究发现这两个位点构建的单倍型存在4种组合，频率最高的是TA(42.7%)，两位点间存在连锁不平衡(D′=0.984，R2=0.161)。MTHFR A1298C和MTRR A66G不同基因型的叶酸及Hcy水平差异无统计学意义(P>0.05)，而MTHFR C677T TT基因型女性的Hcy水平比CC基因型高17.9%，且TT基因型更易得高Hcy血症，危险性是CC型的9倍以上，因此也提示研究者需关注遗传信息，对于TT基因型人群，更应关注Hcy指标。另外，血清叶酸和Hcy也关系密切，叶酸是Hcy代谢的必需因子，能够明显降低Hcy水平，其水平和Hcy水平呈负相关，随着血清叶酸水平降低，Hcy 水平逐渐升高，在体内大量积累会进一步破坏机体凝血与纤溶之间的平衡，使得机体处于血栓前状态，容易导致自然流产的发生，也可能导致妊娠期高血压、神经管畸形、唐氏综合征等妊娠相关疾病发病率增加。
本研究可为上海市育龄女性MTHFR、MTRR基因多态性与血清叶酸和Hcy代谢相关疾病的相关性研究提供依据。截至目前，在全球公共卫生干预措施中提出孕妇在围孕期需要增补叶酸，我国的孕期保健措施为孕前3个月到孕早期3个月，每天增补叶酸0.4 mg，但是对于不同遗传体质的人群，0.4 mg叶酸并不能满足日常所需。因此在围孕期保健中，综合MTHFR C677T基因型筛查、Hcy监测，以及营养、生活方式等流行病学调查信息，建立风险人群的识别和管理系统尤为重要。针对风险人群，指导叶酸、维生素B12等营养素的个体化增补，提高孕期保健的依从性和规范性，加强产前筛查和产前诊断等，是保障围孕期健康和降低出生缺陷的重要措施，也是精准医学在妇幼保健领域的实践应用。
