程晓亮 朱寅荣 于南南 戴丽芬 曹立君
2型糖尿病伴或不伴胃肠神经功能紊乱患者肠道双歧杆菌的差异
程晓亮 朱寅荣 于南南 戴丽芬 曹立君
【摘要】目的 研究2型糖尿病伴或不伴胃肠神经功能紊乱患者肠道双歧杆菌是否存在差异。方法 选取30例2型糖尿病不伴胃肠神经功能紊乱（对照组）患者及30例2型糖尿病伴胃肠神经功能紊乱（实验组）患者，收集粪便样品，提取样品中细菌DNA，根据双歧杆菌总菌的16SrRNA序列设计特异性引物，并应用实时荧光定量PCR技术对60例粪便样品中的双歧杆菌总菌进行定量检测。结果 实验组肠道双歧杆菌总菌较对照组减少（P＜0.05）。结论 2型糖尿病伴胃肠神经功能紊乱患者肠道双歧杆菌总菌数量减少，可能与2型糖尿病患者胃肠神经功能紊乱的发生发展存在相关性。
【关键词】2型糖尿病；胃肠功能紊乱；双歧杆菌
2型糖尿病是由环境及遗传等多种复合病因引起的综合征，其发病机制尚未完全阐明［1-3］。目前对于2型糖尿病伴或不伴胃肠神经功能紊乱患者肠道双歧杆菌差异尚无研究，本研究以实时荧光PCR定量技术测定2型糖尿病伴或不伴胃肠神经功能紊乱患者肠道双歧杆菌总菌数量的变化，为研究糖尿病胃肠神经功能紊乱与肠道菌群的关系提供依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象及标本采集
选取2014年3～9月在昆明医科大学第二附属医院内分泌科住院，年龄50～70岁的患者作为研究对象，纳入2型糖尿病不伴胃肠神经功能紊乱的患者30例为对照组，男20例，女10例，平均年龄（61.23±9.04）岁；30例2型糖尿病伴胃肠神经功能紊乱患者为实验组，男20例，女10例，平均年龄（62.50±8.15）岁。两组研究对象一般资料差异无统计学意义。采集60名患者的粪便样品。
1.2 主要实验试剂和仪器
细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANampBacterria DNA Kit）、PBS液（0.01 mol/L，pH 7.4）、质粒提取试剂盒（TIANGEN 100次质粒小提）、琼脂糖、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司，SYBR Green荧光染料、dNTP、TaqDNA聚合酶、DNA分子标准Marker、T载体试剂盒（TAKARA pMD19T simple），均购自宝生物工程（大连）有限公司，实验所用引物、GlodViewⅠ染料购自生工生物工程（上海）有限公司，PCR仪（ABI，USA）、凝胶成像系统、荧光定量PCR仪BIORAD CFX96。
1.3 实验方法
取湿重粪便样品1 g加10 ml灭菌PBS（0.01 mol/L，pH 7.4），充分振荡混匀10 min，随之低速离心（3 000 r/min）5 min，留取上清，上述过程重复3次。将所收集到的上清液高速离心（12 000 r/min）10 min，然后弃上清，收集沉淀，并用10 ml PBS悬浮，12 000 r/min离心5 min，沉淀重复洗涤3次，所得菌体用1 ml无菌水悬浮混匀，装至1.5 ml EP管中，并以12 000 r/min 离心5 min。得到的菌体沉淀保存于-20℃。使用细菌基因组DNA提取试剂盒，并严格按照说明书步骤进行提取。选用的引所物序列如下：双歧杆菌总菌：上游：AGAACCTTACCTGGGCTTGA；下游：CCTTCCTCCGAGTTGACCC，片段大小208 bp。以2型糖尿病不伴胃肠神经功能紊乱患者粪便样本提取的细菌基因组DNA为模板进行常规PCR反应，制备质粒标准品，通过实时荧光定量得出双歧杆菌总菌的拷贝数。
1.4 统计学分析
所得数据应用SPSS17.0软件处理，双歧杆菌总菌计量资料结果均经正态性检验，以（均数±标准差）表示，对照组与实验组组间差异用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
对照组双歧杆菌总菌数量为（9.11±0.62）log10 copies/g，实验组双歧杆菌总菌数量为（8.35±0.69）log10 copies/g。与对照组相比，实验组肠道双歧杆菌数量减少，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。
3 讨论
人体肠道中生存着大约1 800个属，至少40 000种细菌，其数量多达1 014个。随着科技的发展，被人类所识别的菌种已超过1 250个［4］。近年来，越来越多的学者认为肠道菌群是控制体质和能量代谢的一个重要因素，并且与肥胖、2型糖尿病等代谢性疾病密切相关［5］。双歧杆菌作为人体肠道菌群中的优势菌属，对维持肠道菌群与宿主之间相互作用的稳定发挥着重要的作用，其数量的改变，可影响整个肠道菌群及肠道微生态平衡，从而影响宿主的健康状态。有研究表明，2型糖尿病患者存在肠道菌群的失调，表现为肠杆菌科细菌含量增加，类杆菌含量减少等［6］。
在本实验中，通过PCR进行双歧杆菌总菌绝对定量，结果显示，2型糖尿病伴胃肠神经功能紊乱患者肠道双歧杆菌总数较2型糖尿病不伴胃肠神经功能紊乱患者明显减少。由此可以推测糖尿病胃肠神经与双歧杆菌数量改变之间可能存在相关性，这也许为肠道菌群改变与糖尿病性胃肠神经功能紊乱间相互作用提供了一些依据。可能的机制：（1）肠道菌群发生紊乱后引起肠道屏障功能破坏、渗透压改变、肠菌代谢物改变、信号传导递质改变，导致肠道神经元及微血管对高糖刺激敏感性改变，影响了正常的消化道功能。（2）脑-肠-微生物作用［7］。肠道菌群不仅能够直接影响植物传入神经影响消化道功能，也能通过其产物作用于肠上皮细胞相应受体，产生信号分子，或是通过对一些机体所不能利用的酶，对免疫因子的赋活作用，来改变肠道运动及渗透压，调节免疫功能，影响肠激素如GLP1、GLP2、PYY的分泌［8］，在中枢神经系统与肠道的交互作用中扮演着信号传递者的角色。
本研究对2型糖尿病伴胃肠神经病变患者与2型糖尿病不伴胃肠神经病变患者之间肠道双歧杆菌的差异进行了初步的探讨，为进一步研究肠道菌群与2型糖尿病胃肠神经病变之间的关系提供重要线索，并为其治疗靶点提供一些有价值的资料。
参考文献
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［2］ Zhang X，Shen D，Fang Z，et al. Human gut microbiota changes reveal the progression of glucose intolerance［J］. PLoS One，2013，8 （8）： e71108.
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［6］ 肖党生，王招娣，杨云梅，等. 糖尿病患者肠道菌群研究［J］. 中国微生态学杂志，2006，18（4）：275-276.
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【中图分类号】R587
【文献标识码】A
【文章编号】1674-9308（2016）15-0068-02
doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2016.15.043
基金项目：云南省教育厅项目（2013Y294）
作者单位：昆明医科大学第二附属医院内分泌科，云南 昆明 650101
Differences Between the Intestinal Bifidobacteria for the Type 2 Diabetes Patients With or Without Gastrointestinal Dysfunction
CHENG Xiaoliang ZHU Yinrong YU Nannan DAI Lifen CAO Lijun
Department of Endocrinology， The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming Yunnan 650101， China
［Abstract］Objective To distinguish the differences between the intestinal bifidobacteria for the type 2 diabetes patients with or without gastrointestinal dysfunction. Methods Select 30 cases of type 2 diabetes patients without gastrointestinal dysfunction （control group） and 30 cases with gastrointestinal dysfunction （experimental group）. Extract the bacterial DNA of the fecal samples， and design the specific primer of bifidobacteria according to the bacterial 16SrRNA sequence. Apply the real-time PCR technology to detect quantitatively the total bacteria of bifidobacteria， which is taken from two different group of samples. Results The total number of bifidobacteria for the experimental group is less than the control group significantly （P＜0.05）. Conclusion The total number of bifidobacteria for the type 2 diabetes patients with gastrointestinal dysfunction decreased，and reducing the number of intestinal bifidobacterium may interact with thedevelopment of gastrointestinal disorders in patients with type 2 diabetes.
［Key words］Type 2 diabetes， Gastrointestinal disorders， Bifidobacteria
