王世凤 黄欣欣 白淘

舒尼替尼作用在晚期肾癌的疗效已非常显着，目前在《诊疗指南》[1]中明确指出：临床晚期一线用药，A类推荐。同时有报道指出：有20%～30%的局限性肾癌术后出现进展。随着影像学技术的发展、人民群众健康意识的提高，越来越多的肾癌患者被早期发现。山西地区的多中心研究[2]也证实了这一点。本研究通过动物实验，了解早期靶向药物使用的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

人肾透明细胞癌786-O细胞，雄性BALB/C裸鼠42只，舒尼替尼，穿刺针，即用型免疫组化试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 肾癌786-O细胞接种、传代培养。

1.2.2 动物模型的建立 将癌细胞悬浮于PBS中，调整细胞浓度至5×107个/ml，取0.1 ml注射入裸鼠背部皮下。

1.2.3 动物模型的检验 用活检穿刺针取肿瘤，病理证实。分别于第5、20、35天和/或死亡后穿刺活检。

1.2.4 分组 按照不同给药干预时间分三组，每组裸鼠10只，模拟早、中、晚期给药，同时设立对照组裸鼠12只。

1.2.5 给药方式 给药组按7.5 mg/（kg·d）灌食，对照组给予等体积蒸馏水，分别于对应天数测定瘤组织中相关蛋白表达与否、肿瘤大小、记录生存时间，并于每次穿刺检测后开始下一组给药。

1.2.6 相关指标的蛋白表达测定 HIF，VEGF，VEGFR，PDGFR。

1.2.7 HE染色、免疫组化染色实验步骤 步骤（Envision法）略。

1.3 统计学方法

表1 给药前四组之间各检测指标阳性率及体积比较 [n（%）]（±s）

表1 给药前四组之间各检测指标阳性率及体积比较 [n（%）]（±s）

早期给药组 10 4（40.0） 7（70.0） 7（70.0） 9（90.0） 151.60±5.38中期给药组 10 5（50.0） 7（70.0） 7（70.0） 8（80.0） 151.10±5.44晚期给药组 10 6（60.0） 6（60.0） 6（60.0） 8（80.0） 150.60±4.84对照组 12 6（50.0） 8（66.7） 7（58.3） 8（66.7） 151.42±5.38 χ2/F值 - 0.800 0.472 0.683 1.776 0.070 P值 - 0.849 1.000 0.920 0.687 0.975

表2 给药后第4次检测四组之间各检测指标阳性率及体积比较 [n（%）]（±s）

表2 给药后第4次检测四组之间各检测指标阳性率及体积比较 [n（%）]（±s）

早期给药组 10 5（50.0） 7（70.0） 4（40.0） 4（40.0） 146.20±4.46中期给药组 10 6（60.0） 6（60.0） 4（40.0） 4（40.0） 147.20±4.69晚期给药组 10 7（70.0） 9（90.0） 5（50.0） 6（60.0） 151.90±5.22对照组 12 7（58.3） 10（83.3） 9（75.0） 12（100.0） 158.58±3.58 χ2/F值 - 0.950 2.918 3.693 12.468 356.106 P值 - 0.906 0.443 0.284 0.004 ＜0.001

采用SPSS 13.0软件对数据进行分析处理，计量资料以（均数±标准差）表示，两个样本均数比较采用t检验，多于两组样本均数的比较，采用方差分析（ANOVA）；计数资料以（n，%）表示，采用χ2检验。不同指标之间相关性采用Spearman秩和检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 给药后各组之间相关因子表达情况及肿瘤大小比较

由表1可见，经χ2、Fisher’s确切概率法检验，各组之间在给药前HIF、VEGF、VEGFR、PDGFR阳性表达率对比，差异无统计学意义（P＞0.05）；经ANOVE方差分析，各组之间肿瘤体积大小对比，差异无统计学意义（F=0.070，P=0.975）。提示各组之间在给药前各指标均衡可比。

2.2 给药后各组之间相关因子表达情况及肿瘤大小比较

对各组之间第4次穿刺结果进行比较。由表2可见，各组之间PDGFR阳性表达率对比，差异有统计学意义（χ2=12.468，P=0.004），早期给药组和中期给药组阳性表达率最低。经相关分析，PDGFR阳性表达率与给药时间呈正相关（r=0.485，P=0.001）。

经ANOVE方差分析，各组之间肿瘤体积大小对比，差异有统计学意义（F=356.106，P＜0.001）。经两两比较，对照组肿瘤体积均大于各给药组，差异有统计学意义（P＜0.05）；晚期给药组肿瘤体积分别大于早期、中期给药组，差异有统计学意义（P＜0.05）；经相关性分析发现，给药时间与终期肿瘤大小呈正相关（r=0.491，P=0.006）。

3 讨论

肾癌的生长和侵袭是一个复杂的过程[3-4]。VHL-HIF-EPO通路中靶基因VEGF转录活性和表达增强，并上调了VEGFR的转录及表达[5-6]。TKI在肾癌中因其双向抑制作用，成为转移性肾癌的一线用药，特别是VEGFR3 rs307826野生纯合子型（AA型），患者进展风险降低72%，本团队在前期实验过程中，SNP检测15例患者均为AA型。本团队与国内前期检测结果[7]相似，远高于欧美83.1%检出率，众多国内外数据显示[8-9]：在苹果酸舒尼替尼基于基因水平的靶向治疗肾细胞癌方面，国人较欧美人群可获得更多收益。国内单中心研究[10-12]数据：进一步证实TKI在中国晚期肾癌中疗效确切。由于缺乏用药指标，遗憾的是尚无可推荐的标准辅助治疗方案使局部进展期和局限性肾癌手术患者获益，有20%～30% T1b～T2期患者肾癌手术后1～2年内发生转移，16%的肾癌会局部进展，术后40%肾癌会复发和远处转移[1]。

本研究结果显示，造模成功后第一次穿刺组织经多种统计方法证实：各组之间在HIF、VEGF、VEGFR、PDGFR阳性表达率及肿瘤大小对比，差异均无统计学意义（P＞0.05），提示各组之间在给药前各指标均衡可比。对各组及各组之间4次穿刺结果进行比较：早期、中期给药组较其它组显示，给药时间越长，PDGFR阳性表达率越低，肿瘤体积越小。晚期给药PDGFR、肿瘤体积变化不显着，提示早期给药较晚期给药可以更好地抑制癌细胞的进展。而HIF、VEGF及其受体的表达差异均无统计学意义（P＞0.05），与相关研究相悖，可能的原因与实验设计动物例数少有关；肿瘤体积在种植成功至第一次穿刺时变化较大，可能的原因是种植于鼠背皮下相对疏松的组织，在种植形成皮丘过程中加剧了周围组织的水肿，使得癌细胞有了更适宜的生长空间，10～15天，种植造成的水肿环境被机体代偿、吸收，所以当肿瘤体积达到150 mm时各组都出现生长相对缓慢 。

综上所述，早期靶向药物干预较晚期干预，对于控制疾病进展有明显的作用。目前摆在面前的问题是：如何将未来会有疾病进展的患者筛选出来。

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