张勇 陈姝颖 赵珊 乔国洪
肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%，约75%的患者发现时已处于中晚期，5年生存率较低[1]，而铂类化疗药物是治疗晚期NSCLC 的重要药物。ERCC1 基因是第1 个被发现的人类 DNA 损伤修复基因，国内外研究表明，ERCC1 基因c.118C＞T 位点含有T 等位基因比不含有T 等位基因的患者，对铂类化疗药物更为敏感[2-5]。治疗前进行ERCC1基因多态性的检测具有重要的指导意义。HRM 技术一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，可以有效进行单核苷酸多态性分析，其具有成本低，操作简单快速，不易污染，灵敏度好等特点。本研究采用HRM 技术检测NSCLC患者ERCC1 基因c.118C ＞T 位点SNP，并探讨其临床意义。
1 材料和方法
1.1 标本收集
收集2015 年11 月—2017 年5 月间，我院收治的经病理学诊断确诊为NSCLC 的患者60 例，采集其外周血2 mL，置于EDTA抗凝采血管，并于4 h 内开始DNA 制备。其中男性患者33 例，女性患者27 例，年龄范围35～76 岁，平均年龄（55.82±8.63）岁。本研究患者均知情同意，并经医院医学伦理委员会批准。
1.2 实验方法
1.2.1 DNA 制备 采用Blood DNA Kit（美国OMEGA 公司，D3392）试剂盒，按试剂盒说明书提取外周血DNA。DNA 制备完毕，采用OneDrop 仪器对DNA 纯度及浓度进行检测。
1.2.2 HRM 法引物设计 HRM 法检测ERCC1 基因c.118C ＞T 位点SNP 引物设计如下：上游引物：GCAGAGCTCACCTGAGGAAC；下游引物：GAGGTGCAAGAAGAGGTGGA。
1.2.3 HRM法反应及分析 反应体系 2×Master Reaction Mix（Roche），0.2μM 引物，DNA 样品和DEPC 水，总体积20 uL。采用Roche 480 型荧光定量PCR 仪，扩增条件为：95℃预变性10 min，95℃10 s，60℃ 10 s，72℃ 20 s，45 个循环。扩增结束后进行HRM 分析：95℃ 1 min，40℃ 1 min，以1℃/s 的温度上升速率从70 ℃到95℃收集熔解曲线数据，40 ℃冷却。
1.2.4 Sanger 测序法验证 所有扩增产物均送至上海生工经Sanger测序法检测验证。
2 结果
HRM 技术检测NSCLC 患者ERCC1 基因c.118C ＞T 位点SNP如图1 所示，等位基因杂合程越高，则熔解温度越低，C/T 基因型最先熔解，T/T 基因型次之，C/C 基因型最后熔解。检测结果如表1 所示，60 例样本中，检测出36 例C/C 型，21 例C/T 型，3 例T/T 型，等位基因频率分别为 60%，35% 和5 % 。携带T 等位基因样本共计24 例，等位基因频率为40%。检测结果与Sanger 测序法验证结果一致。
表1 HRM 技术检测ERCC1 基因c.118C＞T 单核苷酸多态性结果
图1 HRM 技术检测ERCC1 基因c.118C＞T 单核苷酸多态性结果示意图
3 讨论
铂类化疗药物是治疗晚期NSCLC 的重要药物。而机体对抗铂类药物造成的DNA 损伤主要依赖于核苷酸切除修复（nucleotide excision repair,NER）机制[6]。ERCC1 基因在 NER 机制中起重要的调节或限速作用。ERCC1 基因c.118C＞T 突变，虽然编码的氨基酸没有发生变化，但是携带T 等位基因突变型的 ERCC1 基因表达量下降，降低了核苷酸切除修复能力，导致DNA 损伤的修复能力下降，从而使得患者对铂类的化疗反应更敏感。已有大量临床研究证实ERCC1 基因c.118C＞T 位点，携带T 等位基因的患者接受铂类化疗方案后，生存期及化疗敏感性明显高于野生型患者[4-8]。因此，加强对ERCC1 基因多态性检测方法的研究极为必要。
目前，检测SNP 的方法主要有变性高效液相色谱（DHPLC），单链构象多态性（SSCP），限制性片段长度多态性（RFLP），Taqman 探针法以及Sanger 测序法等。陈金鸣等学者采用RFLP法检测肺鳞癌患者80 例，ERCC1 基因c.118C ＞T 位点携带T等位基因的患者比例为66.25%[9]。周国仁等学者利用质谱分析的方法检测NSCLC 患者204 例，携带T 等位基因的患者比例为40.69%[7]。Kaewbubpa 等学者采用Taqman 探针法进行检测，携带T 等位基因的患者比例为42.3%[10]。徐向勇，张增利等学者采用测序法NSCLC 患者进行检测，携带T 等位基因的患者比例分别为51.00%[4]和31.94%[6]。可能由于各研究样本量较小，各检测方法检出携带T 等位基因的患者比例结果范围为31.94%～66.25%，差异较大。
HRM 技术是一种新的基因分型分析技术，其原理是扩增含突变位点基因的过程中，由于突变位点不匹配会导致双链 DNA 在升温过程中会先解开,荧光染料从局部解链的 DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在突变位点[11-12]，其是PCR 扩增技术与熔解曲线分析技术的高度结合。本研究采用HRM法对NSCLC 患者ERCC1 基因c.118C ＞T 位点进行检测，结果显示携带T 等位基因的患者比例为40%，与文献报道的其他方法检测结果范围基本一致。且检测结果与“金标准”——Sanger 测序法完全一致。HRM 法结果准确性高，还克服了前述各种检测方法操作复杂，检测周期长，检测成本高等缺点。
综上所述，HRM 技术检测NSCLC 患者ERCC1 基因单核苷酸多态性，操作简单，检测快速，准确性高，并且检测成本低，适合在临床检测中推广应用。
