补肝健膝方对膝骨关节炎模型兔软骨Wnt信号通路的影响*

罗 洁，仇湘中，匡建军，张信成，许 辉

（1.长沙市口腔医院，湖南 长沙 410004；2.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种最常见的膝关节疾病，其特征包括骨赘形成、关节软骨退化、骨质增生和滑膜炎。KOA常由遗传、年龄、肥胖或其他机械损伤等综合因素引起[1-2]。目前估计全球有超过3亿人患有KOA[3]，其经济成本预计将在未来几十年内翻倍，这将对社会造成巨大经济负担[4]。软骨退行性变是KOA发生发展过程中最显着的病理改变，包括软骨细胞凋亡和细胞外基质异常降解[5]。软骨细胞的主要功能是分泌细胞外基质，而这种基质可能会被促炎性细胞因子和金属蛋白酶破坏[6]。在人和动物的软骨细胞中，基质金属蛋白酶13（MMP13）过度表达，从而导致细胞外基质降解以致软骨退化[7]。白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的过度表达也参与KOA的发病机制[8]。

补肝健膝方是湖南省名老中医仇湘中教授治疗膝骨关节炎的经验方，临床研究发现补肝健膝方治疗KOA具有较好的疗效。为进一步阐明其作用机制，本研究探讨了补肝健膝方对KOA模型兔软骨Wnt信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂 白细胞介素-1（IL-1）ELISA试剂盒（江苏酶免实业有限公司，批号：2206061230）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（江苏酶免实业有限公司，批号：2206061390）；木瓜蛋白酶（上海源叶生物科技有限公司，批号：N08GS166292）；内参一抗（Mouse Anti-β-Actin）（北京全式金生物技术有限公司，批号：#Q21129）；内参二抗[HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG（H+L）]（Servicebio，批号：AC230602002）；目的一抗Rabbit Anti MMP-13（Proteintech，批号：00098899）；目的一抗Rabbit Anti Wnt3a（Affinity，批号：25s0136）；目的一抗Mouse Anti β catenin（Affinity，批号：10023865）；目的二抗HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（Servicebio，批号：AC23071 6005）。

1.1.2 主要仪器 BX43型显微镜（OLYMPUS公司）；WD-2012B型自动酶标仪（北京六一公司）；UltiMate3000型超高压液相色谱仪（THERMO公司）、5600 QTOF型高分辨质谱仪（AB SCIEX公司）；ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm 2.1 mm×100 mm色谱柱（Waters公司）；BA7004型超净高级封片胶（BASO公司）；IPVH00010型PVDF膜（Millipore公司）；KD-TS3S1型组织脱水机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；HistoCore Arcadia型石蜡包埋机（Leica公司）；HistoCore BIOCUT型切片机（Leica公司）；Leica HI1210型摊片机（Leica公司）；HGZF-101-1型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）；5424R型低温高速离心机（Eppendorf公司）；HH-11-2型电热恒温水浴锅（上海助蓝仪器科技有限公司）；DYY-6C型蛋白垂直电泳仪（北京市六一仪器厂）；TC-100B型恒温摇床（上海领成生物科技有限公司）；Tiss-12型全自动样品快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；Chemi DocTM XRS+型超高灵敏度化学发光成像系统[伯乐生命医学产品（上海）有限公司]。

1.2 药物 补肝健膝方：酸枣仁20 g，牛膝15 g，白芍30 g，桂枝12 g，生地黄15 g，白芷10 g，僵蚕10 g，泽泻10 g，车前子10 g，熟地黄25 g，当归10 g，木瓜15 g，炒麦芽10 g，桑枝15 g，蜈蚣1条，甘草5 g。加味独活寄生汤：独活10 g，秦艽10 g，防风10 g，桑寄生10 g，茯苓10 g，甘草6 g，杜仲10 g，白芍15 g，人参10 g，细辛3 g，桂枝10 g，熟地黄15 g，牛膝15 g，川芎10 g，当归10 g。上述药材均购自湖南省中医药研究院附属医院中药房，由湖南省中医药研究院附属医院田其学主任药师、杨莹主任药师鉴定符合2020年版《中华人民共和国药典》规定。将上述中药分别浸泡30 min，调整液面，大火煮沸后用小火煮30 min，滤出煎液，锅中加入水，再次煎煮，火候控制同前，煎煮20 min。两次药液混合，继续文火蒸馏至100 mL，加味独活寄生汤煎煮方法同补肝健膝方，分别得到补肝健膝方煎液（1 g/mL）及加味独活寄生汤煎液（1 g/mL）。4 ℃储存备用。

1.3 实验动物 36只新西兰兔，雄性，购自江西省赣州畜牧水产研究所，动物生产许可证号：SCXK（湘）2018-0009，体质量（2.0±0.5）kg。动物均在无病原体的（SPF）环境下饲养，室温为22～26 ℃，相对湿度为55%～65%，12 h明暗交替光照，标准饲料喂养，自由饮水。所有动物管理和协议均获得湖南省中医药研究院实验动物管理和使用委员会的批准（伦理号：2022040734）。

1.4 动物模型构建 36只健康雄性新西兰兔，购入后适应性饲养1周，随机分为正常组、模型组、阳性药物组、补肝健膝方低剂量组、补肝健膝方中剂量组、补肝健膝方高剂量组，每组6只。模型组、阳性药物组、补肝健膝方低剂量组、补肝健膝方中剂量组、补肝健膝方高剂量组采用木瓜蛋白酶关节腔注射制备膝骨关节炎模型。方法：将0.3 mL的4%木瓜蛋白酶生理盐水溶液注入膝关节腔，屈伸膝关节使木瓜蛋白酶充分扩散于关节腔，造模开始第1、4、7天各注射1次，总共注射3次。造模期间对所有动物进行驱赶，2次/d，30 min/次，连续4周，即可制备兔膝骨关节炎模型[9-10]。

1.5 给药 根据人与动物间药物剂量的换算方法，通过人与动物体表面积折算中药灌胃剂量，相当于临床用量3.72倍。补肝健膝方低剂量组用生药质量浓度为1.962 g/kg的补肝健膝方药液灌胃，10 mL/（kg·d）；补肝健膝方中剂量组用生药质量浓度为3.924 g/kg的补肝健膝方药液灌胃，10 mL/（kg·d）；补肝健膝方高剂量组用生药质量浓度为5.886 g/kg的补肝健膝方药液灌胃，10 mL/（kg·d）；阳性药物组用生药质量浓度为2.895 g/kg的加味独活寄生汤药液灌胃，10 mL/（kg·d）；正常组、模型组给予等量生理盐水灌胃，10 mL/（kg·d）。各组均连续灌胃4周。4周后进行取材并检测。

1.6 观察指标

1.6.1 大体观察和组织学分析 抽取各组新西兰兔的关节液，采用ELISA法检测IL-1和TNF-α表达水平，然后空气栓塞法处死各组新西兰兔，切开显露右后肢膝关节，观察膝关节结构，并拍照。切取同样大小和部位的胫骨平台软骨，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，行苏木精-伊红染色，200倍光学显微镜下观察。

1.6.2 关节软骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白表达 采用Western blotting检测关节软骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白相对表达量。取兔右后膝关节股骨髁软骨后，用PBS洗涤，取50 mg组织，加1 mL裂解液和钢珠，研磨至充分。高速离心，4 ℃，12 000 r/min（离心半径为6.26 cm），离心10 min，检测蛋白浓度，制备SDS-PAGE胶板。乙醇压胶，加浓缩胶后插齿梳，配置电泳液，加蛋白样品和Marker。电泳：60 V压缩，80 V分离。转膜后5%脱脂奶粉-PBST封闭1 h，抗体稀释比例为1∶1 000，加一抗，4 ℃孵育过夜。HRP标记的二抗，37 ℃孵育1 h。超高灵敏度化学发光成像系统显影成像，Image J定量分析蛋白表达情况。

1.7 统计学方法 采用SPSS 26.0统计学软件进行分析，计量资料以“均数±标准差”（）表示。计量资料符合正态分布且方差齐，采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用最小显着差（LSD）检验。P＜0.05为差异有统计学意义。实验数据均由GraphPad Prism 8.0软件进行绘图展示。

2 结果

2.1 各组兔关节大体观察及显微形态观察 正常组兔关节软骨表面光滑，而模型组则粗糙，光泽度降低并形成骨赘。阳性药物组、补肝健膝方低剂量组、补肝健膝方中剂量组、补肝健膝方高剂量组兔关节表面比模型组光滑。（见图1）

图1 各组兔关节大体观察

HE染色结果显示，正常组软骨细胞排列规律，而模型组软骨细胞数量明显减少。阳性药物组、补肝健膝方低剂量组、补肝健膝方中剂量组、补肝健膝方高剂量组兔软骨病变减轻，尤其是补肝健膝方中剂量组软骨结构得到了改善，软骨细胞数量增加。（见图2）

图2 各组兔关节软骨显微形态观察（HE，×200）

2.2 各组兔关节液炎症因子IL-1、TNF-α水平比较 模型组兔关节液IL-1、TNF-α水平高于正常组（P＜0.01）。阳性药物组、补肝健膝方低剂量组、补肝健膝方中剂量组、补肝健膝方高剂量组兔关节液IL-1、TNF-α水平均低于模型组（P＜0.01）。木瓜蛋白酶诱导的KOA兔的关节液中IL-1和TNF-α显着增加，且加味独活寄生汤和补肝健膝方干预后，这种趋势得到了阻断。（见图3）

图3 各组兔关节液IL-1、TNF-α 水平比较 （，n=6）

2.3 各组兔关节软骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白相对表达量比较 模型组兔关节软骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白相对表达量高于正常组（P＜0.01）。补肝健膝方高剂量组兔关节软骨Wnt3a蛋白相对表达量低于模型组（P＜0.05）。阳性药物组、补肝健膝方低剂量组、补肝健膝方中剂量组、补肝健膝方高剂量组兔关节软骨β-catenin蛋白相对表达量与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。阳性药物组、补肝健膝方中剂量组、补肝健膝方高剂量组兔关节软骨MMP-13蛋白相对表达量均低于模型组（P＜0.05）。木瓜蛋白酶诱导的KOA兔关节软骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白相对表达量显着增加，且补肝健膝方干预后，这种趋势一定程度上得到了阻断。（见图4～5）

图4 各组兔关节软骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13 蛋白表达Western blotting 图

图5 各组兔关节软骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13 蛋白相对表达量比较 （，n=6）

3 讨论

KOA的发病与外伤、衰老、无菌性炎症、代谢、免疫等诸多因素关系密切，但确切的发病机制尚未明确。目前，越来越多的研究表明KOA患者往往伴有关节软骨细胞外基质合成与降解失衡，而这就是导致关节软骨变形的重要原因之一，其中无菌性炎症因子及与软骨代谢有关的细胞因子在KOA发病中发挥着重要的作用[11]。IL-1、TNF-α大量存在于膝关节软骨组织、上层软骨细胞与基质中，可诱导并激活金属蛋白酶（MMPs）的合成并且抑制TIMPs的生成，加快胶原蛋白的降解，抑制软骨细胞的合成，致使软骨细胞凋亡，最终导致关节软骨的破坏[12-13]。软骨退变是KOA主要的病理变化，软骨细胞能够通过提供微环境来调节细胞外基质。软骨降解以软骨细胞凋亡和细胞外基质降解为特征。然而，炎症微环境可诱导软骨细胞凋亡和高表达MMPs，这可能导致细胞外基质降解。本实验中，模型组兔关节液IL-1、TNF-α水平升高，间接说明造模成功，与上述观点相符。研究发现，促炎性细胞因子和MMPs之间的相互作用也可以引起软骨退化[14]。无翅型MMTV整合位点家族是一种外分泌的糖蛋白，能够影响生长组织的形态并作为生长因子诱导细胞增殖[15]。它调节着经典的β-catenin依赖和非经典的β-catenin依赖信号通路。在经典的β-catenin依赖通路中，过度激活会增加基质金属蛋白酶（MMPs）的表达并减少胶原Ⅱ的产生[16]。对于非经典的β-catenin依赖信号通路，它可以分为Wnt/Ca2+和平面细胞极性（planar cell polarity）通路[17]。两者主要在Wnt5a中，能介导细胞骨架的变化和细胞迁移。

中医学中无KOA的病名。根据其临床特点，KOA属中医学中“膝痹”范畴。仇湘中教授认为KOA属“筋”病，与肝密切相关。其病机核心为肝虚瘀痹，为本虚标实之证。肝虚为本，瘀痹为标。《杂病源流犀烛·筋骨皮肉毛发病源流》指出“筋也者，所以束节络骨……其主则属于肝”。筋属于肝，筋的各项功能得益于肝的濡养。基于此，仇湘中教授总结出补肝健膝方。临床试验证明补肝健膝方治疗KOA安全有效。方中酸枣仁、牛膝共为君药，平补肝肾，且牛膝能引药下行，直达病所。熟地黄、当归、生地黄益肝肾之精血。重白芍而轻桂枝意在养血柔肝，滋阴缓中。桂枝得白芍之酸收和营，辛散而不耗肝阴；白芍得桂枝辛温则柔肝而不致“伐生发之气”。僵蚕、蜈蚣搜风通络，化痰散结，祛风止痛。桑枝祛风湿，利关节。白芷散寒止痛。以上九药共为臣药。泽泻、车前子利水渗湿消肿；木瓜舒筋活络，且善走下肢；炒麦芽健脾开胃，佐僵蚕、蜈蚣伤及脾胃以及生地黄、熟地黄、白芍滋补而阻滞胃之弊。以上四药共为佐药。甘草调和诸药，为使药。全方共奏补肝养血柔筋、舒筋通络止痛之效，临床疗效确切[18]。

目前，治疗KOA的常用方剂有补肾活血汤[19]、独活寄生汤[20]和加味补阳还五汤[21]等。独活寄生汤来源于《备急千金要方》，其功效主要为通脉络、补气血、补肝肾、祛风湿、止痹痛，是治疗膝痹的常用方。KOA的发病是多种因素在不同途径下协同作用导致的，独活寄生汤对于许多可导致KOA进展的途径都有一定调控作用，如调控相关炎症因子、促进软骨细胞增殖分化、抑制软骨细胞凋亡等。循证医学证据已证明独活寄生汤可延缓或改善膝骨关节炎病程[22-23]。研究[13-14]显示，独活寄生汤可通过调控KOA兔Wnt/β-catenin通路和下游因子MMP-13等相关基因表达，抑制膝关节软骨细胞凋亡。因此，本研究选择加味独活寄生汤作为阳性对照药物。

本研究结果表明，模型组兔关节软骨Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白相对表达量以及关节液IL-1、TNF-α水平均增加，符合经典β-catenin依赖的信号通路促进OA的发生这一理论。其中，高剂量补肝健膝方具有治疗作用，能减少Wnt3a、MMP-13、IL-1和TNF-α的表达，而β-catenin没有改变。这表明补肝健膝方可能通过阻断非经典β-catenin信号通路发挥其作用。此外，过度抑制Wnt信号通路也会导致KOA的进展。因此，补肝健膝方在体内过量使用可能会过度抑制Wnt信号通路，从而出现负面效应。由于过量治疗，IL-1、TNF-α和MMP-13的水平会增加，但仍低于模型组。结果表明，补肝健膝方能通过抑制Wnt信号通路，降低MMP-13、IL-1和TNF-α的表达，从而阻止KOA的进展。而补肝健膝方在体内的最佳剂量需要进一步探索。本研究为补肝健膝方对KOA模型Wnt信号通路调控作用的初步探索，研究中仅观察了干预后相关指标。后续研究将进行多时间点动态观察，进一步评估该方对KOA的作用机制，为临床运用本方治疗KOA提供依据。