★罗畅 孙有智 赵益 赵利南（.江西中医药大学中医学院 南昌 000；2.台州市黄岩区中医院 浙江 台州 8020；.江西中医药大学中医基础理论分化发展研究中心/江西省中医病因生物学重点实验室 南昌 000；.濮阳市中医医院 河南 濮阳 5700）
乳腺癌是我国女性最常见的恶性肿瘤，且发病率逐年攀升［1］。现代医学对乳腺癌的发病机制尚不明确，认为与激素、遗传、不良生活方式和其他疾病有关［2］。中医体质学说中的体病相关理论认为，不同体质人群具有对特定病因和疾病的易感性，以及疾病传变转归中的某种倾向性。王琦院士提出体病相关在发病学中十分重要［3］。体病相关的文献计量研究指出，气郁质人群发生乳腺癌的风险更高，且气郁质在乳腺癌人群中分布比例较高［4］，由此推测气郁质对乳腺癌的发生有一定的促进作用。本实验通过DMBA灌胃诱发大鼠乳腺癌模型，观察激怒应激诱导下气郁状态大鼠的一般状况、旷场实验评分、血浆雌二醇、皮质酮含量、乳腺癌潜伏期及诱发率的变化，探讨气郁状态对乳腺癌发病的影响，为乳腺癌的中医实验研究及临床防治提供思路。
1 实验材料
1.1 实验动物SPF级未交配雌性SD大鼠136只，体重（102±8）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司（许可证号：SCXK〈湘〉2013-0004）。
1.2 试剂与仪器DMBA（7,12-dimethylbenz(a)anthra- cesne，7，12-二甲基苯蒽）（美国Sigma-Aldrich，批号：SLBM4575V）；雌二醇Elisa试剂盒（武汉优尔生，批号：L151102019）；皮质酮Elisa试剂盒（武汉优尔生，批号：L151103101）；戊巴比妥钠（南昌平海，批号：922L031）；苏木素、伊红染液（南昌雨露，批号：160601、160701）；小动物行为记录视频分析系统（西班牙Panlab）；恒温培养摇床（常州万华）；酶标仪（美国MD）；脱水机、包埋机、切片机（德国徕卡）；光学显微镜（日本尼康）。
2 实验方法
2.1 分组所有大鼠适应性喂养3 d，分组前行旷场实验，保留总评分在20~120分之间的大鼠［5］。具体方法：使用小动物行为记录视频分析系统，将100 cm×100 cm×40 cm黑色旷场敞箱等分为25个区域，记录在安静环境下3 min内每只大鼠在箱中的直立及穿格次数；将大鼠放在箱中心区域，双前肢向上抬举且两爪离地1 cm以上为1次直立，三爪以上跨入相邻区域为1次穿格；总评分=直立次数+穿格次数；每只大鼠测试结束后擦拭旷场内排泄物。剔除总评分不合格大鼠3只，剩余133只大鼠随机分为6组：空白组、DMBA模型组、8周激怒组、8周激怒+DMBA组、22周激怒组、22周激怒+DMBA组。
2.2 大鼠气郁状态实验开始后，对8周激怒组、8周激怒+DMBA组大鼠行连续8周的激怒应激后停止应激，对22周激怒组、22周激怒+DMBA组大鼠行连续22周的激怒应激直至实验结束，以造成大鼠的气郁状态。激怒应激方式：（1）棉绳束缚大鼠双后肢，2~3只倒吊于网笼盖；（2）在大鼠尾巴靠近身体约2/3处夹一个长尾夹。应激在安静环境下进行，每次30 min，两种应激方式隔天交替。两种方式均能造成同笼大鼠对峙扭打尖叫，若大鼠间出现撕咬行为则立刻调整棉绳或长尾夹位置。
2.3 建立大鼠乳腺癌模型分别于第9周首日和第10周首日对DMBA模型组、8周激怒+DMBA组、22周激怒+DMBA组大鼠行DMBA灌胃诱发乳腺癌模型（DMBA粉末以10 mg/mL浓度溶于芝麻油中，溶液10 mL/kg灌胃）。
2.4 指标监测
2.4.1 一般状况自实验开始，每天观察各组大鼠的活跃程度、情绪反应、毛色光泽度、大便等。
2.4.2 旷场实验自实验开始，每隔2周对各组大鼠行旷场实验。
2.4.3 血浆雌二醇、皮质酮含量测定对各组大鼠于第8周末行眼眶取血、第22周末行腹主动脉取血，分离血浆后使用Elisa法测定雌二醇、皮质酮含量。
2.4.4 乳腺肿瘤潜伏期第14周开始，采用手摸的方式每天检查DMBA模型组、8周激怒+DMBA组、22周激怒+DMBA组大鼠所有乳腺部位的肿瘤出现情况，以第9周首日至各大鼠出现第1个可触及体表乳腺部位肿块的时间为该大鼠乳腺肿瘤诱发的潜伏期。
2.4.5 乳腺肿瘤诱发率实验结束时DMBA模型组、8周激怒+DMBA组、22周激怒+DMBA组各组大鼠成功诱发乳腺肿瘤的数量与该组总数的百分比为该组乳腺肿瘤的诱发率。
2.4.6 乳腺癌模型评价实验结束时对DMBA模型组、8周激怒+DMBA组、22周激怒+DMBA组各组大鼠行腹腔注射麻醉（戊巴比妥钠粉末以50 mg/mL浓度溶于双蒸水中，溶液50 mg/kg腹腔注射），麻醉成功后剥离所有乳腺部位的肿瘤组织，常规固定、脱水、石蜡包埋，3 μm切片后行HE染色，显微镜下观察病理学形态。大鼠乳腺肿瘤组织病理学判读由江西省肿瘤医院病理科协助完成。
2.5 统计学方法数据分析使用SPSS 23.0软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较使用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间率的比较使用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 各组大鼠一般状态观察8周激怒组、8周激怒+DMBA组、22周激怒组、22周激怒+DMBA组大鼠在激怒应激中表现出尖叫、跳蹿挣扎、竖立对峙、扭打撕咬等激动行为。在安静状态下，激怒应激后的大鼠活动减少、喜扎堆蜷缩于饲养箱角落、易受惊吓、便溏、垫料易湿。8周激怒组、8周激怒+DMBA组大鼠在停止激怒应激后的上述表现逐渐与空白组大鼠趋于一致，而22周激怒组、22周激怒+DMBA组大鼠仍维持上述表现直至实验结束。
3.2 各组大鼠旷场实验总评分比较实验第4周及第8周，8周激怒组、8周激怒+DMBA组、22周激怒组、22周激怒+DMBA组大鼠旷场实验总评分均减低（P<0.05或P<0.01）；第12周、第16周 及 第20周，22周 激 怒 组、22周 激 怒+DMBA组大鼠旷场实验总评分均减低（P<0.05或P<0.01）。见表1。
表1 各组大鼠旷场实验总评分（±s） 分
表1 各组大鼠旷场实验总评分（±s） 分
注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与DMBA模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
组别 第1周 第4周 第8周 第12周 第16周 第20周空白组 67.6±24.2 74.3±28.2 69.8±27.1 70.8±17.4 82.3±18.5 71.3±25.8 DMBA模型组 69.3±24.3 72.0±30.0 71.8±31.7 74.9±36.3 64.1±35.1 61.7±31.2 8周激怒组 70.7±24.2 48.5±34.8# 37.9±21.9## 87.2±38.3 84.0±33.0 87.0±23.4 8周激怒+DMBA组 71.4±26.0 29.7±25.5** 33.6±24.8** 59.0±22.1 63.4±33.6 56.1±29.1 22周激怒组 64.5±27.7 39.2±29.1## 36.4±27.7## 45.2±25.3# 42.0±26.1## 38.5±27.6##22周激怒+DMBA组 68.8±24.5 32.7±31.8** 26.4±23.0** 41.0±33.8** 43.9±28.8* 38.9±30.2**
3.3 各组大鼠血浆雌二醇、皮质酮含量比较实验第8周，激怒应激后的大鼠血浆雌二醇含量降低（P<0.05），皮质酮含量升高（P<0.05或P<0.01）。第22周，22周激怒组、22周激怒+DMBA组大鼠血浆雌二醇含量仍降低（P<0.05），皮质酮含量升高（P<0.05）；但8周激怒组及8周激怒+DMBA组大鼠的雌二醇及皮质酮水平与空白组或DMBA模型组无明显区别（P>0.05）。见表2。
表2 激怒应激对大鼠血浆雌二醇和皮质酮表达的影响（ ±s） %
表2 激怒应激对大鼠血浆雌二醇和皮质酮表达的影响（ ±s） %
注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与DMBA模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
组别 雌二醇 皮质酮8周 22周 8周 22周空白组 8.13±4.41 7.74±1.78 389.52±47.69 402.84±73.95 DMBA模型组 7.89±2.54 7.96±2.35 382.86±87.01 383.82±62.74 8周激怒组 6.25±2.86 7.46±1.42 482.09±62.31##** 400.74±67.65 8周激怒+DMBA组 5.41±2.69#* 7.50±2.40 456.47±88.29#** 407.41±56.40 22周激怒组 6.59±3.44 5.93±1.76* 455.40±83.80* 445.43±57.42*22周激怒+DMBA组 5.14±2.91#* 6.05±1.99* 451.67±66.75#* 436.33±46.61*
3.4 大鼠乳腺肿瘤潜伏期本次实验中大鼠乳腺肿瘤潜伏期最短46 d，实验结束时仍有16只大鼠未诱发乳腺肿瘤。DMBA模型组12只、8周激怒+DMBA组15只、22周激怒+DMBA组16只大鼠成功诱发乳腺肿瘤。22周激怒+DMBA组大鼠乳腺肿瘤潜伏期较DMBA模型组及8周激怒+DMBA组有缩短趋势（P>0.05）。见表3。
表3 气郁状态对大鼠肿瘤潜伏期的影响（ ±s）
表3 气郁状态对大鼠肿瘤潜伏期的影响（ ±s）
组别 n 潜伏期/d DMBA模型组 12 65.3±12.8 8周激怒+DMBA组 15 66.4±13.3 22周激怒+DMBA组 16 61.5±14.4
3.5 大鼠乳腺肿瘤诱发率本次实验中大鼠乳腺肿瘤总诱发率为51.19 %，DMBA模型组42.86 %，8周激怒+DMBA组53.57 %，22周激怒+DMBA组57.14 %。随气郁状态的持续时间增加，诱发率呈增加趋势（P>0.05）。见表4。
表4 气郁状态对大鼠乳腺肿瘤诱发率的影响
3.6 大鼠乳腺癌模型评价实验结束时，成功诱发乳腺肿瘤且仍存活的大鼠共31只，其中DMBA模型组9只、8周激怒+DMBA组13只、22周激怒+DMBA组9只。通过组织病理学判读，本实验中大鼠乳腺肿瘤均为乳腺癌，病理分型分别为浸润性导管癌（48.4 %）、浸润性筛状癌（38.7 %）、乳头状癌（6.5 %）、分泌型癌（3.2 %）、髓样癌（3.2 %）。见表5。
表5 大鼠乳腺肿瘤组织病理形态 n（%）
4 讨论
通过动物实验阐释中医理论及治法疗效是中医药现代化研究的重要内容。多年来，病证结合的动物模型在中医药科研工作中广泛应用，将现代医学病理和中医病因造模相结合，既包涵现代医学的疾病病理改变，又具备中医的证候特点［6］。同时，病证结合模式也广泛应用于中医药临床工作中，在诊断、治疗、疗效评价、临床研究等方面均发挥重要作用［7］。但仍有学者认为，目前病证结合的动物模型不能较好体现疾病的动态演变和个体差异，需引入中医体质维度进行造模，因为体质是证候表现的内在基础，通过研究发病前偏颇体质对疾病发生的影响能为治未病提供思路，故中医药科研中的动物模型也应具备体质因素［8］。
气郁质是由于长期情志不畅、气机郁滞而形成，精神刺激、暴受惊恐、所欲不遂、忧郁思虑等因素是后天形成气郁质的主要原因［9］。《灵枢》曰：“忧恐忿怒伤气，气伤脏，乃病脏”“愁忧者，气闭塞而不行”，《张氏医通》曰：“郁证多缘于志虑不伸，而气先受病”，可见气郁质易因过极情志所致。过去的动物实验中多注重乳腺癌的证型研究，而对于体质状态对乳腺癌的影响少有报导。本实验在大鼠诱发乳腺癌模型之前采用激怒应激方式造成大鼠气郁状态，以模拟气郁质人群在乳腺癌发病前的体质，符合“体-病-证结合”的研究方式。所应用的双后肢倒吊激怒法和夹尾激怒法均是中医动物模型中常用的激怒应激法［10］，对大鼠进行强烈的情志刺激，使肝气失于条畅、气机失常而产生气郁，达到“怒伤肝，久则郁”的目的，且情志刺激也避免了药物造模引起的急性损伤和中毒。激怒应激后的大鼠旷场实验总评分减低，血浆中雌二醇含量降低、皮质酮含量升高。旷场实验反映大鼠的探究行为，通过记录大鼠进入陌生环境后在一定时间内的自发活动，在肝郁、抑郁等评价动物情绪变化的模型中广泛应用［11］。相关动物实验中，肝郁、气郁模型大鼠血中雌二醇水平降低［12］，皮质酮水平升高［13］；且临床实验研究中，烦躁、抑郁情绪人群血中雌二醇水平降低、皮质醇水平升高［14-15］。同时，本实验中激怒后的大鼠在安静状态下活动减少、喜扎堆蜷缩于饲养箱角落、易受惊吓，与气郁质人群性格内向不稳定、敏感、对精神刺激适应能力较差相类似［9］。
本实验中DMBA诱发的大鼠乳腺肿瘤经判读均为乳腺癌，但部分大鼠在诱导过程中死亡，且部分大鼠未能成功诱导乳腺肿瘤，因DMBA是多环芳烃类的强力致癌剂，且有一定的诱发成功率［16］。从诱发乳腺癌的潜伏期和诱发率来看，气郁状态大鼠的潜伏期有缩短的趋势，诱发率较模型组稍高，但均无统计学意义，这无论是与传统中医理论的认识，还是与截至目前国内大部分中医体质临床调查的结果并不一致。然而，近年来国外一些大样本研究并不支持情志因素与乳腺癌的发病风险存在相关性。一项纳入了14.7万多名绝经期女性、评估了800多个潜在危险因素、随访8年的调查研究显示，心理因素对乳腺癌的发病可能相对并不重要［17］。另外一项纳入了10.6万名女性的研究结果也并未显示出乳腺癌风险与过去5年内感知到的压力水平和负性生活事件相关联［18］。本实验结果与此一致，这就说明气郁状态可能并不一定促进乳腺癌的发生。本实验对大鼠血浆雌二醇、皮质酮进行检测，此两种物质为腺垂体分泌的促激素所产生的雌激素及肾上腺糖皮质激素，高水平雌激素能通过促进乳腺上皮细胞增殖及刺激雌激素受体引起乳腺癌的发生［19］，高水平糖皮质激素能通过抑制免疫降低机体对肿瘤的免疫监视及免疫应答［20］，表明雌二醇、皮质酮能在乳腺癌发生中呈促进作用。但气郁状态下，大鼠血浆皮质酮虽升高、雌二醇却降低，其原因可能与下丘脑-腺垂体-性轴/肾上腺皮质轴及神经-内分泌-免疫系统的功能紊乱有关［21］。在后期实验中，本实验组对乳腺癌组织进行基因测序后发现，气郁状态的大鼠癌组织中很多与免疫相关的基因表达均有所升高，这可能会阻止肿瘤的发生。因此我们推测，气郁状态对机体的影响是复杂的，可能既会促发利于肿瘤生长的某些因素，也会激发免疫系统阻止其发病，最终是否发病可能取决于二者相互作用的结果，其中机理有待于进一步的深入研究。
