丁红秀，高荫榆*，晁红娟，夏冬华
(1.江西师范大学生命科学学院，江西 南昌 330022；2. 南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)
毛竹叶多糖对高脂血症小鼠的降脂利肝作用
丁红秀1,2，高荫榆2,*，晁红娟2，夏冬华2
(1.江西师范大学生命科学学院，江西 南昌 330022；2. 南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)
研究毛竹叶多糖的降血脂、肝脂及促进肝损伤修复的作用。以正常小鼠作空白对照，将高脂血症脂肪肝模型小鼠分为高脂模型组、毛竹叶多糖低、中、高剂量组和血脂康阳性药物对照组，进行不同灌胃处理，测定小鼠血脂、血清谷丙转氨酶(ALT)、肝粗脂肪含量、肝指数及肝组织细胞形态变化。结果表明：毛竹叶多糖可显着降低小鼠血清总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)；对血清高密度脂蛋白(HDL)影响不明显；可显着降低肝粗脂肪含量，改善小鼠的肝功能。
毛竹叶多糖；高血脂；脂肪肝；降血脂；肝功能
血脂高于正常值上限称为高脂血症，目前认为高脂血症与动脉粥样硬化(AS)的发生密切相关，总胆固醇(TC)或低密度脂蛋白(LDL)过高是AS的主要危险因素，而高甘油三酯(TG)或血清高密度脂蛋白(HDL)浓度过低也被认为是AS的危险因素[1]。AS是导致人类心脑血管疾病的元凶，对人类健康产生巨大的危害。因此有效控制高脂血症的发生，可以减少心脑血管疾病。临床上常采用贝特类药和他汀类药预防和治疗高脂血症，效果不错，但难免有副作用[2]。因此寻找效果显着、安全可靠的降血脂药一直是人们长期研究的课题[3]。
肝脏是人体重要的代谢器官，对糖、脂类及蛋白质代谢起主要作用。食物中的甘油三酯由消化管吸收，在肝细胞内同化后经血液运输至脂肪组织中贮存，当肝功能障碍或肝脏损伤时，进入肝脏的脂肪运出受阻，大量积存于肝细胞内而形成脂肪肝[4]，引起肝细胞肿大、脂肪浸润性炎症坏死等肝损伤和功能异常。肝损伤及功能衰竭时，血清TG低于正常，血清谷丙转氨酶(ALT)活性会急剧升高。
植物多糖为天然产物，无毒副作用，研究表明一些植物多糖及真菌多糖具有明显降血脂、肝脂及促进肝损伤恢复的作用[5-12]，毛竹叶含有丰富的活性多糖成分[13-14]。本实验通过高脂饲料喂养昆明小白鼠，成功建立高血
脂、脂肪肝合并肝损伤模型小鼠，以低、中、高3个不同剂量毛竹叶多糖(polysaccharide from moso bamboo leaves，PMBL)为受试物，对照正常小鼠、病态模型小鼠及血脂康治疗小鼠，通过检测血清TG、TCHO、HDL、LDL含量；血清ALT活性；肝粗脂肪含量及肝组织形态变化等，研究PMBL对高血脂、脂肪肝合并肝损伤小鼠的降脂利肝功效，以期为PMBL的药物应用可行性提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
毛竹叶多糖 本实验室制备；普通饲料 南昌大学医学实验动物中心。
猪油(猪板油) 市售；胆固醇、牛胆盐(生化试剂)天津市大茂化学试剂厂；丙基硫氧嘧啶 上海复星朝晖药业有限公司；血脂康胶囊 北京北大维信生物科技有限公司；ALT体外诊断测试盒 日本和光纯药工业株式会社；TG、TCHO体外诊断试剂 温州津玛生物科技有限公司；HDL、LDL体外诊断试剂 日本协和メヴツヶス株式会。
高脂饲料参考文献[15-17]，设计成分为：胆固醇1%、牛胆盐0.3%、丙基硫氧嘧啶0.2%、猪油10%、普通饲料88.7%。配制方法：猪油加热融化后加入胆固醇、牛胆盐和丙基硫氧嘧啶粉末，充分混匀后趁热倒入普通饲料，迅速用手揉搓拌匀，55℃烘干备用。
1.2 仪器与设备
DTQ-100多功能提取器 湖南省衡阳市东泰医药机械制造有限公司；组合膜分离装置 湖州科滤膜技术有限公司； SP-1910UVPC紫外扫描分析仪 上海光谱仪器有限公司； 7600-020自动生化分析仪 日本日立公司；3k15台式高速冰冻离心机 美国Sigma公司；6010-紫外-可见分光光度计 安捷伦中国上海分公司； A1604电子天平 上海天平仪器厂；101-2型恒温干燥箱 上海市实验仪器厂；RE52-4旋转蒸发仪 上海沪西分析仪器厂；HH-SH-4型电热恒温水浴锅 北京长安科学仪器厂； RM2135石蜡切片机 德国Leica公司；显微摄影操作系统 日本Olympus公司。
1.3 实验动物
昆明种小白鼠，全雄性，体质量(18±2)g，由南昌大学实验动物中心提供，动物合格证号02196-02。
1.4 方法
1.4.1 毛竹叶多糖的制备及定性测定
利用DTQ-100多功能提取器于加热80℃、真空沸腾提取毛竹叶多糖，毛竹叶单次用量为2000g，固液比为1∶30，提取时间2h，提取两次，合并提取液并进行浓缩，通过组合分离膜装置分级截流纯化得纳滤回流液(截留物分子质量范围：1000～6000D)和超滤回流液(截留物分子质量＞6000D)。合并浓缩回流液，活性炭脱色干燥得精制毛竹叶多糖。将所得到的PMBL配制成实验所需浓度的溶液即可用于动物实验。
多糖的鉴别反应，苯酚-硫酸反应：糖定性反应；碘-碘化钾反应：淀粉定性；双缩脲反应：蛋白质鉴定；三氯化铁反应：多酚类物质鉴定；斐林试剂反应：还原糖测定；硫酸-咔唑反应：糖醛酸鉴定；氯化钡明胶比色法：硫酸基鉴定及含量测定。
多糖纯度测定采用硫酸-蒽酮法，具体操作如下 ：
将一定量的精制毛竹叶多糖用蒸馏水复溶，测定其多糖含量，再按下列公式计算粗多糖纯度。
1.4.2 实验动物分组及喂养
雄性昆明小鼠80只在实验环境下预饲数天。随机取20只作正常对照(正常对照I组和正常对照II组)，喂于普通饲料；其余60只作实验组喂于高脂饲料两周后，随机分为6组，每组10只。随机取1组(模型组)与正常对照组10只(正常对照I组)一起眼眶取血测定相关指标并进行肝组织病理切片检查，以检测建模成功与否。正常对照II组和其余5个实验组继续喂给普通饲料，并分别进行灌胃处理。
正常对照II组(NG)和高脂对照组(HL)，灌胃0.9%生理盐水；阳性药物治疗组(PC)，灌胃血脂康400 (mg/(kg bw·d))；低PMBL组(LPMBL)，灌胃200 (mg/(kg bw·d))PMBL；中PMBL组(MPMBL)，灌胃400(mg/(kg bw·d))PMBL；高PMBL组(HPMBL)，灌胃600(mg/(kg bw· d))PMBL；每天上午9：00灌胃给药，给药容积为0.2mL/(10g bw·d)。连续两周，实验期间动物自由饮水和摄食。
1.4.3 实验材料取样及检测方法
末次灌胃前一天晚上停食，末次灌胃1h后称质量并眼眶取血。血样于4℃，6000r/min离心20min分离血清后上机测定TG、TCHO、HDL、LDL及ALT各项指标值。同时解剖取肝脏称质量，计算肝脏指数，并取样进行肝脏组织病理学检查，肝脏组织病理学检查采用常规石蜡切片，HE染色，光学显微镜观察的方法。剩余肝脏于50℃恒温干燥至质量恒定后采用索式提取法测定肝脏粗脂肪含量。
1.4.4 统计学处理
所有数据经统计学处理后用平均值±标准差表示，组间差异采用SPSS13.0统计软件进行t检验分析。
2 结果与分析
2.1 PMBL定性及纯度测定结果
通过各项定性反应结果显示，PMBL的苯酚-硫酸反应为阳性；碘-碘化钾反应、双缩脲反应、三氯化铁反应、斐林试剂反应、硫酸-咔唑反应均为阴性；氯化钡明胶比浊反应为阳性。实验表明PMBL可能含有硫酸基，为不含糖醛酸、酚类、氨基酸或蛋白质的非淀粉类可溶的酸性多糖。纯度测定结果表明，精制的毛竹叶多糖的纯度为41.07%。
2.2 造模结果
表1 高脂饲料模型小鼠的血脂变化Table 1 Change of serum lipid in model mice with hyperlipidemia
表2 高脂饲料模型小鼠ALT、肝系数、肝粗脂肪含量变化Table 2 Change of ALT, liver index and crude fat content in liver of model mice with hyperlipidemia
图1 高脂饲料模型小鼠肝组织形态变化(HE染色)Fig.1 Histopathological change of liver tissue in model mice with hyperlipidemia
表3 PMBL对小鼠血清TG、TCHO、LDL和HDL含量的影响Table 3 Effect of PMBL on serum TG, TCHO, LDL and HDL in mice
通过造模，高脂饲料造模组小鼠与正常对照I组血脂含量及肝脏差异见表1、2和图1。
实验发现，随高脂饲料饲养时间的推移，高脂造模组小鼠精神逐渐萎靡，毛发明显变得凌乱纠结，食欲不佳且反应迟钝，粪便溏浠，体质量也出现一定差异。表1血脂测定结果表明，经高脂饲料喂养两周后，模型组小鼠的TCHO、LDL含量分别比正常对照组高出2倍多和10多倍，而TG则比正常对照组低近一半，呈极显着差异。表2肝脏指标测定结果显示，模型组ALT活力值比正常对照组高出近4倍，肝系数超出正常近3成，肝粗脂肪含量均比正常对照组高出近4倍，均具极显着差异。由图1肝病理组织切片可以看出，与正常对照组相比，高脂模型组小鼠出现了明显的弥漫性肝脂变和炎性变，以肝小叶周边最为严重。脂变肝细胞结构松散杂乱、膨大变形，细胞浆被大量的脂肪侵占导致染色不均或出现细胞质呈完全空泡状，由于脂肪的挤压导致细胞核呈不规则排列，表明模型组小鼠已呈明显的脂肪肝状态并且出现了比较严重的肝肿大、肝细胞浸润性坏死。上述实验结果表明小鼠高血脂、脂肪肝合并肝损伤模型成功建立。
2.3 给药处理结果
2.3.1 给药处理后的血脂变化
对造模成功的高血脂、脂肪肝损伤小鼠改喂普通饲料并进行给药处理后，各组病小鼠精神萎靡、毛发凌乱纠结、食欲不佳及反应迟钝等症状在短短的2d时间即得到了改善，表现日渐活跃，皮毛恢复光滑、洁白，取食也更积极。进行给药处理两周后，PMBL各剂量组小鼠血清TG、TCHO、LDL、HDL均有不同程度的变化。
从表3可知，PMBL各剂量组及PC组小鼠血清TCHO与NG组相比较仍然偏高，但差异已不显着，血清LDL仍显着高于NG组；HL组的TCHO、LDL均显着或极显着高于NG组；各实验组血清TG较灌胃处理前均有较大幅度提高，但仍显着低于NG组；PMBL各剂量组及PC 组小鼠的血清TCHO、TG、LDL显着或极显着低于HL组(P＜0.01或P＜0.05)。血清HDL均略高于HL组，
表现为促进HDL合成向好的趋势，但相互之间无显着性差异。
2.3.2 ALT活性、肝系数、肝粗脂肪含量及肝组织形态变化
对小鼠解剖取肝脏经肉眼观察发现，HL组小鼠肝脏体积与其余各组小鼠肝脏体积存在较大的差异，色泽也很淡，质地松软易碎，切面油腻，烘干至恒质量后仍较软，肝脏研磨后呈现明显的油浸状。而PMBL各剂量和PC组小鼠肝脏色泽除个别存在个体差异外，均呈现为深血红色，肝脏质地较柔韧，烘干至恒质量后比较脆硬，研磨后的粉未呈干粉状，色深。测定血清ALT、肝粗脂肪含量及计算肝指数结果如表4所示。
表4 PMBL对高血脂、脂肪肝合并肝损伤小鼠肝脏的影响Table 4 Effect of PMBL on hyperlipidemia and fatty liver associated with liver damage in mice
表4显示， PMBL各剂量组及PC组的ALT活性、肝脏系数、肝粗脂肪含量与NG组接近或相差很小，而显着或极显着低于H L组，综合作用效果依次为：HPMBL组＞MPMBL组＞PC组＞LPMBL组。
图2 各实验组小鼠肝组织切片对比图(×20，HE染色)Fig.2 Comparison of liver tissues in mice (×20，HE)
图2的肝组织病理切片显示，经药物治疗后的各组小鼠肝组织形态得到明显恢复，其中MPMBL、HPMBL组小鼠肝细胞大小、细胞及细胞核形态接近正常组小鼠，细胞浆中几乎无脂肪空泡及浸润性坏死细胞出现，LPMBL和PC组仍有少量脂肪空泡，但数量少、个体都比较小，而HL组则仍然遗留有大量个体较大的脂肪空泡细胞浸润性坏死部分。表明PMBL各剂量及阳性药物血脂康均能显着改善肝肿大、降低肝粗脂肪含量，修复肝组织结构形态及功能，有效地促进肝损伤的快速恢复，具有显着的利肝清脂、治疗脂肪肝的功效。
3 结 论
3.1 实验结果表明，PMBL对高血脂脂肪肝损伤具有显着的降脂利肝功效。不同剂量PMBL均能显着降低高血脂、脂肪肝合并肝损伤小鼠的血清T G、T C H O、LDL、ALT活性和肝粗脂肪含量，有效改善病鼠的肝功能，促进病鼠肝损伤修复。
3.2 研究结果可为PMBL的药物开发可行性提供参考。作为天然植物提取物，PMBL具有无细胞毒性及其他副作用的优点，从而使其具有成为药物基料或保健食品基料的可能，可为毛竹叶的开发利用提供理论依据。
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Effect of Polysaccharide from Moso Bamboo Leaves on Blood Lipid of Mice with Hyperlipemia
DING Hong-xiu1,2，GAO Yin-yu2,*，CHAO Hong-juan2，XIA Dong-hua2
(1. College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China；2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)
In order to investigate the functions of polysaccharide from moso bamboo leaves (PMBL) for decreasing blood lipid and liver lipid and promoting the recovery of damaged liver, the mice model with hyperlipidemia was established through the feeding of high-fat food to evaluate the effect of PMBL on lipid metabolism of mice. Totally 50 mice were divided into 5 groups designated as hyperlipidemia model group, PMBL groups at low, middle and high dosages, and positive control group. Blood lipid, serum ALT, crude fat content in liver, liver index and morphological change of liver tissues were evaluated. Results indicated PMBL could result in a significant reduction of total cholesterol, triglyceride and low-density lipoprotein in serum; however, no significant effect on high-density lipoprotein was observed. In addition, PMBL could decrease crude fat content in liver, and improve the hepatic function of mice. In a word, PMBL exhibited anti-lipidemic activity and lipid-reducing effect in liver to enhance the repairing of damaged liver in mice with hyperlipidemia at the condition of optimal dosage.
polysaccharide from moso bamboo leaves；hyperlipemia；fatty liver；blood-lipid lowering；hepatic function
Q71；O629.12
A
1002-6630(2010)09-0259-04
2009-08-04
教育部“长江学者和创新团队发展计划”项目(IRT0540)
丁红秀(1971—)，女，副教授，博士，研究方向为食物(含生物质)资源开发利用。E-mail：sd_dinghx@sina.com
*通信作者：高荫榆(1940—)，女，教授，研究方向食物(含生物质)资源开发利用。E-mail：yygaoncu@163.com
