许振伟，许 钟，杨宪时,*，郭全友，李学英
(1.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306)
鱼类腐败菌腐败能力测定方法
许振伟1,2，许 钟1，杨宪时1,*，郭全友1，李学英1
(1.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306)
通过分析比较接种腐败菌的大黄鱼无菌鱼块和灭菌鱼汁，在贮藏中感官、挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen，TVBN)、三甲胺(trimethylamine，TMA)和腐败菌的变化，以及腐败菌生长动力学参数和腐败代谢产物的产量因子(YTVBN/CFU和YTMA/CFU)，探讨无菌鱼块和灭菌鱼汁两种腐败能力的测定方法。结果表明：接种腐败希瓦氏菌的无菌鱼块和灭菌鱼汁的货架期分别为162h和132h，此时的TVBN含量分别为32.16mg/100g和29.64mg/100mL，TMA含量为9.31mg/100g和0.99mg/100mL，腐败希瓦氏菌菌数为8.67 lg(CFU/g)和8.56 lg(CFU/mL)，产量因子YTVBN/CFU为2.58×10-10mg TVBN/CFU和1.98×10-10mL TVBN/CFU，产量因子YTMA/CFU 为2.12×10-10mg TMA/CFU和1.27 ×10-11mL TMA/CFU。TMA作为接种鱼汁的理化指标是不可靠的，而TVBN可以作为接种鱼汁的理化指标。接种腐败希瓦氏菌的无菌鱼块和灭菌鱼汁产量因子YTVBN/CFU的相对误差为23.64%，因此灭菌鱼汁作为腐败菌腐败能力测定方法具有一定的可靠性。
腐败菌；腐败能力；测定方法；无菌鱼块；灭菌鱼汁
鱼类腐败是个极其复杂的过程，微生物是导致腐败变质的主要因素。由于鱼种、生活水域、捕获季节、贮藏条件等的不同，微生物组成复杂多样，但只有部分微生物参与腐败过程，即特定腐败菌 (specific spoilage organism，SSO)[1]，例如磷发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)引起冷藏真空或气调包装水产品腐败，希瓦氏菌(Shewanella)和(或)假单胞菌(Pseudomonas spp)引起有氧冷藏鲜鱼腐败。特定腐败菌比其他微生物生长快，并且腐败能力强。
SSO是造成腐败的主要因素，而SSO的鉴别必须测定腐败菌的腐败能力。通过分析接种腐败菌的无菌鱼块在贮藏中的腐败菌生长与代谢产物生成情况，测定腐败菌腐败能力的方法已有报道[2]，但无菌鱼块腐败能力测定方法操作较繁杂。灭菌鱼汁的测定方法可以用比浊法测定细菌的数量，与平板菌落计数相比，操作简便，可在短时间内获得大量数据。本实验利用比浊法探讨腐败希瓦氏菌菌悬液和光密度间的关系，分析比较无菌鱼块和灭菌鱼汁两种腐败菌腐败能力测定方法，为研究鱼类特定腐败菌和开发鱼类保鲜技术提供研究基础[3]。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
活大黄鱼购于上海铜川路水产市场，充氧保活运送到实验室。立即敲击头部致死，去鳞、去鳍、去内脏、清洗，用于制备无菌鱼块和灭菌鱼汁。
营养琼脂培养基、铁琼脂培养基 上海中科昆虫生物技术开发有限公司；假单胞菌专用培养基 英国OXOID公司；盐酸标准溶液 上海市计量测试技术研究院；L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸 上海国药试剂公司；磷酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氧化三甲胺、三氯乙酸、苦味酸、盐酸三甲胺、氧化镁、硼酸、硫代硫酸钠等试剂均为分析纯。
721型分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；0.5Mcfarland Standard麦氏标准管 英国TREK Diagnostic Systems有限公司；Sanyo MIR 153高精度低温培养箱 日本三洋电器集团；半微量定氮仪 国药集团化学试剂有限公司；SEX-TJ净化工作台 上海整新电子设备；L550低速台式离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 腐败希瓦氏菌菌悬液的制备
挑取实验室保存的有氧冷藏养殖大黄鱼货架期终点分离、纯化、鉴定的腐败希瓦氏菌(S h e w a n e l l a putrefaciens)纯菌株[4]，营养琼脂培养基划线，25℃有氧培养。24h内，挑取单菌落于5mL去离子水中，使其浓度达到0.5Mcfarland麦氏标准管中间绿灯处，约108CFU/mL。取300μL上述菌液于300mL灭菌营养肉汤中，25℃培养。菌液浓度达到108CFU/mL后，用灭菌生理盐水稀释至106CFU/mL，用于无菌鱼块和灭菌鱼汁的接种。
1.2.2 无菌鱼块的制备
依据Herbert[5]的方法，并参照文献[2]的方法，无菌操作制备无菌鱼块。
1.2.3 灭菌鱼汁的制备
参照Dalgaard[6]的方法制备灭菌鱼汁。大黄鱼去鳞、去内脏、清洗，将鱼片剪成细条，组织捣碎机打浆，煮沸、过滤，弃去鱼渣。滤液4200r/min离心30min，取上清液再次过滤，滤液加入0.1mol/L磷酸缓冲液、0.056mol/L KH2PO4和0.044mol/L K2HPO4缓冲液，用NaOH/HCl调pH值为 6.60。每升鱼汁中加入1.6g氧化三甲胺(TMAO)、40mg L-半胱氨酸和40mg L-甲硫氨酸。121℃灭菌15min。
1.2.4 接种与贮藏实验
无菌鱼块的腐败希瓦氏菌接种参照文献[2]中的接种方法。灭菌鱼汁的腐败希瓦氏菌接种，无菌操作取0.1mL腐败希瓦氏菌菌液(浓度106CFU/mL)加入到200mL灭菌鱼汁中。接种腐败希瓦氏菌的无菌鱼块和灭菌鱼汁贮藏于(5±0.1)℃，每隔12h分别取出进行感官评价，挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen，TVBN)、三甲胺(trimethylamine，TMA)测定和腐败希瓦氏菌菌落计数。
1.3 方法
1.3.1 菌液浓度的定量测定
根据郎伯-比尔定律[7]，在微生物生长过程中对同一菌液同时测OD值和平板菌落计数，将平板菌落计数所得菌液浓度作为细菌标准浓度。每隔12h无菌操作取出接种的鱼汁于比色杯中，以未接种腐败菌的灭菌鱼汁为参比，在600nm下测定菌液的OD值。
1.3.2 感官评价
参照文献[2]中的感官评价方法，其中灭菌鱼汁的感官评价只对气味和味道进行评价，并与未接种的空白灭菌鱼汁进行对比。
1.3.3 TVBN测定
参照GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》中半微量定氮法测定。结果表示为mg/100g鱼肉和mg/100mL鱼汁。
1.3.4 TMA测定
参照GB/T 5009.179—2003《火腿中三甲胺氮的测定》和许龙福等[8]的方法修改，采用苦味酸法测定。结果表示为mg/100g鱼肉和mg/100mL鱼汁。
1.3.5 微生物计数
接种腐败希瓦氏菌的无菌鱼块和灭菌鱼汁的微生物计数参照GB/T 4789.2—2008《食品卫生微生物学检验：菌落总数测定》进行测定。腐败希瓦氏菌菌落计数选择铁琼脂培养基，25℃有氧培养24h，全部黑色菌落计数。
1.3.6 腐败菌腐败能力的定量分析
参照文献[2]把产生异臭味时单位腐败菌产生腐败代谢产物的量，即产量因子YTVBN/CFU和YTMA/CFU作为腐败菌腐败能力的定量指标。
式中：YTVBN/CFU为单位腐败菌产生TVBN的量/(mg TVBN/CFU)；YTMA/CFU为单位腐败菌产生TMA的量/(mg TMA/CFU)；N0为初始菌数；NS为货架期终点时的腐败菌数即最小腐败菌数；(TVBN)0、(TVBN)S为初始点和货架期终点时的TVBN量；(TMA)0、(TMA)S为初始点和货架期终点时的TMA量。
1.4 数据处理
OD值、感官、TVBN和TMA的变化用Microsoft Excel进行多项式回归分析，微生物生长采用Zwietering等[9]修正的Gompertz方程描述，用Statistica 6.5进行非线性回归分析。
2 结果与分析
2.1 菌液浓度和OD值的关系
图1 灭菌鱼汁腐败希瓦氏菌浓度和OD值的关系Fig.1 Plot of optical density versus bacterial count of Shewanella putrefaciens in sterilized fish juice
灭菌鱼汁腐败希瓦氏菌浓度和OD值的关系见图1，回归方程为： y=0.02x－0.0569(y代表OD值，x代表腐败希瓦氏菌浓度，用lg(CFU/mL)表示)，从图1中可以看出两者有较好的相关性(R2=0.975)，灭菌鱼汁达到感官拒绝点时OD600nm=0.117，此时腐败希瓦氏菌浓度为8.56 lg(CFU/mL)。
由表1可见，OD值法测定的相对误差都小于5%。由灭菌鱼汁腐败希瓦氏菌浓度和OD值的标准曲线方程计算测定值，由平板计数法得到标准浓度，一般准确度可用相对误差表示，重复5次，测定值的相对误差小于5%可认为准确，因此可认为OD值法测定贮藏中鱼汁的腐败希瓦氏菌浓度有较高的准确度。
表1 OD值法测定的准确度Table1 Results of accuracy test for bacterial count determination by optical density method
2.2 贮藏中的感官变化
图2 接种腐败希瓦氏菌的无菌鱼块和灭菌鱼汁在5℃贮藏的感官变化Fig.2 Sensory quality change of Shewanella putrefaciens inoculated fish block and juice during (5 ± 1) ℃ storage
由图2可见，鱼块和鱼汁分别在84h和72h感官评分达到1(高品质期终点)，开始出现轻微异臭味。分别在162h和132h感官评分达到2(感官拒绝点)，鱼块表面黏稠、发亮，出现强烈的恶臭味，鱼汁浑浊，发绿，出现强烈的腥臭味。
2.3 贮藏中TVBN值的变化
图3 接种腐败希瓦氏菌的无菌鱼块和灭菌鱼汁在5℃贮藏TVBN的变化Fig.3 TVBN change of Shewanella putrefaciens inoculated fish block and juice during (5±1) ℃ storage
由图3可见，鱼块和鱼汁TVBN初始值分别为8.71mg/100g和6.29mg/100mL。在12～120h内，无菌鱼块TVBN值变化不明显，在13～16mg/100g之间波动，120h后TVBN值随贮藏时间明显增加。灭菌鱼汁TVBN值在整个贮藏过程中随贮藏时间明显增加。达到感官拒绝点时两者的TVBN值分别为32.16mg/100g和29.64mg/ 100mL。
2.4 贮藏中TMA的变化
图4 接种腐败希瓦氏菌的无菌鱼块和灭菌鱼汁在5℃贮藏TMA的变化Fig.4 TVBN change of Shewanella putrefaciens inoculated fish block and juice during (5±1) ℃ storage
由图4可见，鱼块和鱼汁TMA初始值都接近于零，随着贮藏时间的延长TMA值不断增加，在60h前，二者TMA含量增加较缓慢，60h后接种鱼块的TMA含量快速增加，而接种鱼汁的TMA含量增加不明显。到达腐败点时二者的TMA值分别为9.31mg/100g和0.99mg/ 100mL。
2.5 贮藏中腐败菌的变化
图5 接种腐败希瓦氏菌的无菌鱼块和灭菌鱼汁在5℃贮藏腐败菌数的变化Fig.5 Bacterial count change of Shewanella putrefaciens inoculated fish block and juice during (5±1)℃ storage
图5 是接种腐败菌的无菌鱼块和灭菌鱼汁贮藏中腐败菌的生长曲线，两者的回归相关系数值均较高(R2分别为0.988和0.976)。用修正Gompertz方程描述接种腐败菌的无菌鱼块生长动态是典型的S型曲线，而灭菌鱼汁的生长曲线变化较快。接种鱼块和鱼汁初始点的菌数分别为1.9×104CFU/g和3.2×102CFU/mL。鱼块中腐败菌的延滞期较长，为41h，而鱼汁中腐败菌的延滞期相对较短，仅为2 1 h。
2.6 腐败菌生长动力学参数和腐败能力定量分析
表2 无菌鱼块和灭菌鱼汁在5℃贮藏腐败菌的生长动力学参数Table2 Growth kinetic parameters of Shewanella putrefaciens in fish block and juice during (5±1) ℃ storage
表2是接种腐败希瓦氏菌的无菌鱼块和灭菌鱼汁贮藏中的腐败菌的生长动力学参数。两者的最大比生长速率(μmax)分别为0.0927/h和0.0849/h，相差不大。生长延滞期(Lag)分别为41.1h和21.3h，接种鱼块的延滞时间明显较接种鱼汁的长，这是因为鱼块是固体培养基结缔组织紧密，微生物需要较长的适应时间，而鱼汁是液体培养基更有利于微生物的生长。
表3 无菌鱼块和灭菌鱼汁在5℃贮藏腐败菌的腐败代谢产物产量因子Table3 Yield factors of microbial metabolites in fish block and juice during (5±1) ℃ storage
表3是接种腐败希瓦氏菌的无菌鱼块和灭菌鱼汁贮藏中腐败菌的腐败代谢产物产量因子YTVBN/CFU和YTMA/CFU。由表3可见，无菌鱼块的腐败代谢产物产量因子大于灭菌鱼汁的产量因子，尤其是YTMA/CFU。贮藏过程中灭菌鱼汁的TMA含量明显低于无菌鱼块，即使在腐败点时含量也很低，这可能是因为鱼汁在经过煮沸、过滤、灭菌处理后一些含氮物质损失所致。在鱼汁制作过程中为防止鱼汁中TMAO的稀释和热分解，加入了TMAO，但腐败时TMA含量仍然很低，导致产量因子YTMA/CFU很低，因此灭菌鱼汁的腐败代谢产物产量因子YTMA/CFU不能作为腐败菌腐败能力的定量指标。
以接种腐败希瓦氏菌的无菌鱼块的腐败代谢产物产量因子YTVBN/CFU值为标准，接种腐败希瓦氏菌的鱼块和鱼汁的腐败代谢产物产量因子YTVBN/CFU的相对误差为23.64%，因此灭菌鱼汁作为腐败菌腐败能力测定方法具有一定的可靠性。
3 讨论与结论
通常菌悬液浓度的测定采用显微计数，此法效率很低且因人为因素使测定结果有较大误差。用光电比色计或分光光度计等此类仪器测定菌悬液浓度，简便、快速而准确。本实验研究腐败希瓦氏菌菌悬液和光密度间的关系，在600nm波长处，测定菌液OD值，以OD值表示菌量。罗泰来等[10]对分枝杆菌计数方法进行比较研究，建立紫外分光光度计法相对于平板计数法的标准曲线。李华等[11]对酒酒球菌计数方法进行研究，分别比较了平板计数法、浊度计法、OD值法，得出酒酒球菌计数时最好用浊度计法代替平板计数法。Winter等[12]研究快速估计食品和食品加工设备微生物数量的方法。在应用比浊法研究菌悬液和光密度间的关系时，浓度测定的绝对误差依赖于制作标准曲线时显微计数的准确程度，不同的细菌应建立相对应的标准曲线。
Dalgaard等[6]用灭菌鳕鱼鱼汁研究气调包装鳕鱼片冷藏中的优势腐败菌磷发光杆菌(P h o t o b a c t e r i u m phosphoreum)和腐败希瓦氏菌的腐败能力，得出包装鳕鱼腐败主要是由磷发光杆菌引起。Gram等[13]研究尼罗河新鲜和腐败着的鲈鱼细菌学时，将细菌接种到杀菌过的鲈鱼肉汤中，通过其腐败气味，以确定其腐败能力，用氧化三甲胺培养基来测试产生三甲胺和硫化氢的能力，得出假单胞菌是冰藏鲈鱼的特定腐败菌。Truelstrup等[14]将磷发光杆菌接种到鲑鱼汁和冷熏鲑鱼块，研究了其产生醋酸的能力。Miller等[15]将荧光假单胞菌和腐败假单胞菌接种到无菌美洲平鲉鱼块中，利用GC-MS研究其产生的腐败物质。Gram等[16]研究荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌在鲈鱼鱼汁和鱼块中的相互作用，比较其腐败能力，得出高浓度的假单胞菌对腐败希瓦氏菌有一定的抑制作用。Joffraud等[17]利用辐照技术得到灭菌的冷熏鲑鱼块，用于腐败菌腐败能力的研究。郭全友等[18]对养殖大黄鱼冷藏过程菌相进行分析得出腐败希瓦氏菌和假单胞菌是其优势腐败菌。李学英等[2]利用无菌鱼块对大黄鱼腐败菌腐败能力进行了初步分析，得出腐败希瓦氏菌具有很强的腐败潜力(产生强烈异臭味)，但腐败活性较低，需要较高的浓度才能引起腐败。
无菌鱼块是天然培养基，其无菌是相对而言的，本身含有一定数量的微生物，无菌鱼块制备后菌落总数应小于102CFU/g[5]，在制作过程中严禁外源污染，无菌鱼块更接近腐败菌的生长环境，可作为腐败能力研究的基质。灭菌鱼汁是经杀菌过的，用于腐败菌腐败能力的测定快速、简便，可在短时间内获得大量数据。实验表明灭菌鱼汁作为腐败菌腐败能力测定方法具有一定的可靠性。
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Comparative Evaluation of Two Methods for Determining Spoilage Ability of Fish Spoilage Bacterium Shewanella putrefaciens
XU Zhen-wei1,2，XU Zhong1，YANG Xian-shi1,*，GUO Quan-you1，LI Xue-ying1
(1. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China；2. College of Food Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)
After inoculation with Shewanella putrefaciens, a common fish spoilage bacterium, the sterile block and juice of large yellow croaker were stored at (5 ± 1) ℃, and the changes in sensory quality, total volatile base nitrogen (TVBN), trimethylamine (TMA) and bacterial count, the growth kinetic parameters of this species of bacteria and the yield factors of microbial metabolites (YTVBN/CFUand YTMA/CFU) in sterile fish block and juice during the storage were comparatively measured in order to evaluate the two methods of determining the spoilage ability of Shewanella putrefaciens. The post-inoculation shelf-lives of sterile fish block and juice were 162 h and 132 h, respectively, the TVBNs 32.16 mg/100 mL and 29.64 mg/100 mL, the TMAs 9.31 mg/100 mL and 0.99 mg/100 mL, the bacterial counts 8.67 lg(CFU/mL) and 8.56 lg(CFU/mL), the YTVBN/CFUvalues 2.58×10-10mg TVBN/CFU and 1.98×10-10mL TVBN/CFU, and the YTMA/CFUvalues 2.12×10-10mg TMA/CFU and 1.27×10-11mL TMA/CFU at the end of shelf-life. The reliable parameter indicating the spoilage of fish juice was TVBN rather than TMA. The relative error between the YTVBN/CF values of fish block and juice was 23.64%. Thus, sterile fish juice is a promising matrix for the reliable determination of bacterial spoilage ability.
spoilage bacteria；spoilage ability；determination method；sterile fish blocks；sterilized fish juice
S983
A
1002-6630(2010)20-0355-05
2010-05-31
国家自然科学基金项目(30771675)；科技部农业科技成果转化资金项目(2007GB23260281)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2007M05)
许振伟(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为食品微生物安全与质量控制。E-mail：xuzhenweixu@163.com
*通信作者：杨宪时(1954—)，男，研究员，本科，研究方向为水产品贮藏加工与品质控制。E-mail：xianshiyang@126.com
