杨 英，姜绍通，刘 模
(1.安徽建筑工业学院环境工程系，安徽 合肥 230022；2.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)
响应面法优化雄烯二酮生物转化法工艺
杨 英1,2，姜绍通2，刘 模2
(1.安徽建筑工业学院环境工程系，安徽 合肥 230022；2.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)
在已有的雄烯二酮(AD)微生物转化法单因素试验最适条件基础上，采用均匀试验设计在多项影响植物甾醇转化制备AD的因素中，有效筛选出主效因素：底物浓度、植物油、废糖蜜。再利用响应面分析法(RSM)对以上3个显着因子的最佳水平范围进行研究，并建立响应面及等高曲线图，比较分析了各主要因子间交互规律。通过对二次多项回归方程求解，得到生物转化法最适条件为废糖蜜58.49mL/L、葵花油211.63mL/L、甾醇6.01g/L，结合均匀试验最适条件：硝酸氨3.2g/L、磷酸二氢氨0.8g/L、氯化汞0.055g/L进行生物转化实验，得到AD产量达到2.55g/L，且重复性实验结果较好。
雄烯二酮；生物转化；均匀设计；响应面分析法；优化
甾体化合物是一类含有环戊烷多氢菲核的化合物，对机体起着非常重要的作用，被誉为“生命的钥匙”[1-2]。雄烯二酮(AD)是甾体激素类药物不可替代的中间体，几乎所有甾体激素类药物都是以其作为起始原料进行生产的[3]。目前我国生产AD主要是从野生中药材“穿地龙”等植物中提取薯蓣皂甙元经化学合成而成，不仅工艺十分复杂，消耗成本很高，而且污染环境。微生物转化技术，原材料采用生产VE或豆油的副产品甾醇，糖蜜和其他常规的发酵用化工产品，利用生物降解甾醇侧链，转化得到甾体药物的这一关键中间体[4-5]。我国是油料生产大国，油脂工业副产物中蕴藏着极为丰富的植物甾醇资源。长期以来，这些下脚料没有得到很好的利用，有些甚至被当作废物丢弃，这无疑是对自然资源的极大浪费。由此可见，在我国建立以甾醇为原料的新甾体医药工业，从长远来看，不仅可促进制药工业的发展，也会带动其他工业的发展；不仅具有重要的经济效益，也具有明显的社会效益。
雄烯二酮生物转化法与一般的抗生素和氨基酸的转化过程不同，这一过程的产物并不是微生物的初级或者次级代谢产物，而只是通过多酶体系的作用，将植物甾醇的侧链切除后转化而成的。因此，其转化培养基的成分除了维持其生长之外，还必须能够促进微生物产生将植物甾醇转化为AD的酶或酶系。本实验转化菌分枝杆菌属于化能异养型微生物，其营养要求复杂，除了需要可转化碳水化合物外，还必须提供维生素、氨基酸等多种生长因子才能正常生长。而且所用菌株是经过60Co诱变的突变株，要想其转化性能得到充分的发挥，必须创造一个适合突变株充分表达的环境[6-8]。因此，了解转化工艺条件对转化过程的影响，掌握菌种的生理代谢和过程变化规律，可以更有效地控制微生物的生长和产物的生成。在转化条件优化方面，通常用于优化转化条件的统计方法如逐因子试验、全因子试验等，由于因子较多需要海量次数试验[9]。均匀试验是只考虑试验点在试验范围内均匀分布的一种多因素、多水平的试验方法，试验次数只要等于因素的水平数，既可从众多的影响因素中快速、有效地获得期望的结果供进一步研究。响应面分析法(response surfacemethodology，RSM)系采用多元二次回归方法建立连续变量曲面模型，快速有效地确定多因子系统的最佳条件[10]。将多因子试验中因素与指标的相互关系用多项式近似拟合，依此可对函数的响应面和等高线进行分析，研究因子与响应面之间、因子与因子之间的相互关系[11]，具有试验周期短，求得的回归方程精度高，能研究几种因素间交互作用等优点[12-13]。本研究在雄烯二酮微生物法单因素试验最适条件的基础上，采用均匀试验设计在6项影响植物甾醇转化制备AD的因素中，有效筛选出主要因素：底物浓度、植物油、废糖蜜。再利用响应面分析法对以上3个条件进行优化，拟合出生物转化法最适条件，并建立响应面及等高曲线图描述各因子间交互规律，最后通过实验验证获得最佳优化条件。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
菌种来源：Mycobacterium sp-UV-8 合肥工业大学生物与食品学院保藏。
雄甾-4-烯-3,17-二酮(色谱纯) Sigma公司；其余试剂均为分析纯。
YJ601型电子天平 上海民桥精密仪器有限公司；YJ型超净工作台 苏州市百神科技有限公司；GC-MSQP2010W/ORP230型气象色谱仪 日本岛津公司。
1.2 方法
1.2.1 发酵产物雄烯二酮的测定
采用气相色谱定量检测AD含量。色谱条件：色谱柱为AC-5(30m×0.25mm，0.25μm)；载气为N2，载气流速1mL/min，柱温280℃，进样口温度280℃，FID检测器温度300℃。
样品处理：以乙酸乙酯:发酵液=1:1(V/V)比例提取发酵液。振荡10min，至充分溶解后，静置分层。5000r/ min离心10min，取上层清液，稀释100倍，作为待测样品。进样量为1μL。标准曲线方程：采用外标法进行AD含量测算。回归方程为y=1×106x-1948.9(y为峰面积，x为AD质量浓度/(g/L)，线性范围为0.003～0.300g/L，其相关系数R2=0.9996。
1.2.2 培养基优化均匀试验设计
在预实验基础上，安排均匀试验设计筛选影响AD转化的主要因素，共6个因素11个试验点。
1.2.3 响应面分析法优化培养基
根据Plackett-Burman中心组合设计原理(central composite design，CCD)，采用二次回归旋转组合设计，由均匀试验设计确定的3个重要因素各取3水平，设计了3因素3水平23个试验点的响应面分析并验证方程的可行性。
2 结果与分析
2.1 均匀试验设计优化转化培养基
在单因素试验基础上，选取葵花油X1、废糖蜜X2、甾醇X3、磷酸二氢氨X4、氯化汞X5、硝酸氨X6为考察因素，以AD含量作为考察指标，安排均匀试验设计筛选影响AD转化的主要因素。共有11个试验点，11个水平，6个因素，试验设计见表1。
表1 均匀试验设计U11(1116)Table 1 Factors and levels of uniform design
使用逐步回归方法(stepwise)进行分析，显着性水平α＝0.15，引入变量的临界值Fa＝2.723，剔除变量的临界值Fe＝2.613。
拟建立回归方程：
逐步回归变量筛选结果如下：
表2 残差分析Table 2 Analysis of remnant difference
表3 优化试验条件Table 3 Optimization of experimental conditions
残差分析见表2。优化的试验条件见表3。根据以上分析结果，最优条件为葵花油200mL/L、甾醇6.0g/L、硝酸氨3.2g/L，根据均匀试验设计表1的结果确定，废糖蜜X2、磷酸二氢氨X4、氯化汞X5分别限定为54mL/L、0.8g/L、0.055g/L。
2.2 响应面法优化
在均匀分析结果基础上，将考虑采用二次回归旋转中心组合设计，按照表4设计进行试验，三因素五水平的响应面分析共有23个试验点，见表5。
表4 中心组合试验设计Table 4 Central composite design
表5 响应面分析试验方案及结果Table 5 Design and results of response surface experiments
2.3 回归模型的建立与检验
表6 二次响应面回归模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model for quadratic response surface
使用SASORSystemfor Windows 9.0(简体中文)试验版软件，自编程序。响应面分析由RSREG Procedure完成，二次多项式回归优化和分析由GLM Procedure完成，响应曲面图由G3D Procedure完成，等高线图由Gcontour Procedure完成。数学模型的优化中，对复相关系数R＞0.75、P＜0.25的各项予以保留[14]。该响应面法分析是基于考虑一次相、平方相、及交互相进行多元线性回归，方程如下：
响应面分析试验方案及结果见表5，其中1～14为二次旋转试验设计，15～23为重复试验点，用于失拟检验。利用SAS RSREG Procedure对试验数据(表6)进行分析，得到回归模型(式2)如下：
模型方差分析表明，响应面回归模型达到极显着水平(P＜0.0001)，逐项显着性检验结果表明，除Z、WZ、XW的F＜F0.01(9,13)=4.19以外，一次项、交互项、二次项对试验结果均有显着性影响，达到极显着性水平。影响生物转化甾醇的影响因素按影响大小分别为W＞X＞Z，其中W极显着，X影响显着，Z影响不显着。
2.4 失拟性检验
重复试验的平方和：SSLf=∑yi02-(∑yi)2/9=0.038422，自由度：8。
拟平方和：SSel=0.064266；自由度：5。
图1 废糖蜜与甾醇交互作用对雄烯二酮产量影响的响应面图Fig.1 Response surface plot for the effect of cross-interaction between molasses and phytosterol on the bioconversion rate at sunflower level of 200 mL/L
图2 甾醇与葵花油交互作用对雄烯二酮产量影响的响应面图Fig. 2 Response surface plot for the effect of cross-interaction between phytosterol and sunflower oil on the bioconversion rate at molasses level of 54 mL/L
图3 废糖蜜与葵花油交互作用对雄烯二酮产量影响响的应面图Fig.3 Response surface plot for the effect of cross-interaction between molasses and sunflower oil on the bioconversion rate at phytosterol level of 6 g/L
模型失拟FLf=2.676208＜F0.1(5,8)=2.73不显着，说明该二次模型能够拟合真实的试验结果[15]。
图1～3是响应面三维图及等高线图。从图1可看出，甾醇和废糖蜜交互作用对方程影响不显着，最大值均在0水平附近，图2表明甾醇与葵花油的交互作用对方程影响显着，分析原因主要为：甾醇为疏水性化合物不溶于水，如将其直接加入到水溶液培养基中很难被微生物有效利用。而添加葵花油大大提高了甾醇的溶解度，同时减小了底物对产物的抑制，因此交互作用显着。图3表明废糖蜜和葵花油的交互作用对方程有影响但不显着。因为废糖蜜与葵花油之间虽不存在直接相关性，但由于废糖蜜成分复杂，并含有部分不可溶物质，而这些不可溶物质中可能有少量是亲油性物质，溶解后可被微生物利用，或是部分有毒物质溶解于油相后减轻了这些物质对生物的毒害作用[16]。
为了确证各因素的最佳点，对已回归的非线性模型方程(2)求一阶偏导，并令其等于零，求解得：X=211.63、W=58.49、Z=6.01，在此培养条件下，AD产量达到2.55g/L。
3 结 论
通过均匀试验对培养基进行优化。使用逐步回归方法(stepwise)进行回归分析，得到最优化培养基成分及含量：硝酸氨3.2g/L、磷酸二氢氨0.8g/L、氯化汞0.055g/L。在均匀试验基础上，根据中心组合设计原理，以葵花油、废糖蜜、甾醇3个因素为自变量，通过三元二次回归正交旋转设计，建立了葵花油、废糖蜜、甾醇三因素五水平的响应面回归模型。比较分析了3个因素对转化影响大小，依次为废糖蜜＞葵花油＞甾醇；甾醇和废糖蜜交互作用对方程有影响但不显着，葵花油与甾醇之间存在显着的交互作用，废糖蜜与葵花油存在交互作用。通过计算机模拟，结合实际生产情况得出最佳转化培养条件为废糖蜜58.49mL/L、葵花油211.63mL/L、甾醇6.01g/L，在此条件下，AD产量达到2.55/L。且重复性实验结果较好。
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Optimization of Androstenedione Bioconversion by Response Surface Methodology
YANG Ying1,2，JIANG Shao-tong2，LIU Mo2
(1. Department of Environment Engineering, Anhui University of Architecture, Hefei 230022, China；2. College of Biology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)
Bioconversion processing of androstenedione (AD) is strongly affected by many factors. Uniform design has been undertaken to evaluate the effects of substrate concentration, plant oil and molasses on bioconversion rate. Through regression analysis, the amounts of sunflower oil and molasses were important factors for bioconversion processing of AD. Response surface methodology (RSM) was used to optimize the critical factors. Through the analysis of quadratic regression model equation, the optimal processing parameters for bioconversion were 211.63 mL/L sunflower oil, 58.49 mL/L molasses and 6.01 g/L phytosterol. The optimal uniform design parameters were 3.2 g/L ammonium nitrate, 0.8 g/L ammonium dihydrogen phosphate, and 0.055 g/L mercury chloride. Under the optimal conditions, the production of AD was 2.55 g/L.
androstenedione；bioconversion；uniform design；response surface methodology；optimization
Q933
A
1002-6630(2010)24-0078-05
2010-05-09
“十一五”国家科技支撑计划项目(2007BAD34B01)；国家“863”计划项目(2007AA10Z361)；安徽省自然科学基金项目(070413265X)；安徽省科技厅2009年度科技攻关项目(08020203004)；安徽高校省级自然科学研究重点项目(KJ2010A060)；安徽建筑工业学院博士基金支持项目
杨英(1963—)，女，副教授，博士，主要从事发酵工程研究。E-mail：yangying5918@163.com
