王卫东，孙月娥，李 超，王春燕，周继波
(1.徐州工程学院食品工程学院，江苏 徐州 221008；2.徐州金地杰农业发展有限公司，江苏 徐州 221116)
复合抑制剂对菊芋酶促褐变的影响
王卫东1，孙月娥1，李 超1，王春燕1，周继波2
(1.徐州工程学院食品工程学院，江苏 徐州 221008；2.徐州金地杰农业发展有限公司，江苏 徐州 221116)
采用磷酸盐缓冲液提取菊芋中的多酚氧化酶(PPO)，并对其酶学特性进行研究。结果表明，菊芋多酚氧化酶最适温度50℃、最适pH值为4.0和8.0。动力学实验表明菊芋PPO的米氏常数Km39.27mmol/L、最大反应速率Vmax 为1.369U/min。通过响应面试验设计对菊芋酶促褐变的抑制剂配方进行优化，结果表明：用质量浓度0.02g/ 100mL乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、0.02g/100mL柠檬酸亚锡二钠和0.04g/100mL的抗坏血酸复合溶液浸泡30min，能有效防止菊芋在加工期间的酶促褐变。
菊芋；多酚氧化酶；酶促褐变；柠檬酸亚锡二钠
多酚氧化酶(PPO，E.C.1.14.18.1)是一种含有铜离子的酶，广泛存在于植物、动物和一些微生物中，是引起大多数果蔬发生酶促褐变的酶。在果蔬加工过程中，多酚类物质在PPO和氧气的作用下，邻位的酚氧化为醌，醌很快聚合成为褐色素而引起组织褐变。酶促褐变不仅有损于果蔬的感官品质，还会导致其营养价值下降。因此，果蔬褐变自20世纪50年代起就成为人们研究的对象，目前的许多问题依然还是围绕酶及褐变机理本身[1]。许多学者对草莓[2]、梨[3]、桑葚[4]、枇杷[5]等水果中的PPO进行分离纯化，并对其酶学特性进行了研究。
菊芋(Helianthus tuberosus L.)别名洋姜、鬼子姜、地姜，为菊科向日葵属一年生草本植物。它的原产地为北美密西西比盆地，我国各地皆零星种植，其地下块茎细密、清脆，既可炒食，又可腌渍食用，还可晒干磨成粉代替一般植物淀粉，也可以通过分离提取菊糖、低聚果糖等成品。近年来因其营养丰富，风味独特而倍受人们青睐。菊芋在加工中很容易发生酶促褐变，有关其PPO的特性国内已有较多报道，但是并未得到比较一致的结论，而且已有的研究很少涉及到实际菊芋体系中酶促褐变的抑制。因此研究菊芋PPO的特性及其引起褐变的防止方法，可以为菊芋的开发利用提供一定的理论支持和技术指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
菊芋 徐州金地杰农业发展有限公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
TU-1810型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；TGL-20M高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机有限公司；PHS-3CA型精密酸度计 上海世义精密仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 PPO粗酶液的提取
称取新鲜菊芋50g与100mL 0～4℃预冷过的0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)混合，加入5g不溶性聚乙烯比咯烷酮(PVPP)后迅速匀浆30s。匀浆液用纱布过滤后在4℃、18000×g离心20min，上清液即为粗酶液。
1.3.2 PPO酶活的测定
在比色皿中加入2.4mL缓冲液、0.5mL 0.1mol/L邻苯二酚溶液以及0.1mL粗酶液，在420nm波长处2min内每隔5s测吸光度随时间的变化[6]。以每分钟增加吸光度0.001的酶量为一个酶活力单位U。
式中：A为每秒钟增加的吸光度；V为粗酶液的体积/mL。
1.3.3 PPO最适pH值的测定
按照1.3.2节中酶活的测定方法，反应液包括0.1mL粗酶液、2.4mL不同pH值的缓冲溶液、0.1mol/L邻苯二酚溶液0.5mL，缓冲系统为Britton-Robinson缓冲溶液。
1.3.4 PPO最适温度的测定
取2.4mL pH4.0的Britton-Robinson缓冲溶液、0.1mol/L的邻苯二酚溶液0.5mL，在30～90℃范围内，每隔10℃保温5min，加入0.1mL粗酶液，然后迅速在420nm波长处测定各温度下的吸光度，并计算PPO酶活。
1.3.5 PPO的热稳定性
酶的热稳定性在50、60、70、80℃时测定。取10mL粗酶液在相应温度下加热一定时间后，在冰浴中迅速冷却，在室温条件下测定PPO相对酶活。
1.3.6 底物浓度与PPO酶活的关系
用浓度0.05mol/L、pH7.0磷酸盐缓冲溶液配制浓度0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.11、0.13、0.15mol/L的邻苯二酚作为底物，在室温条件下测定PPO的酶活。根据Lineweaver-Burk作图法[7]得米氏常数Km(其值为酶反应速度达到最大速度一半时的底物浓度，Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈大)和最大反应速率Vmax值。
1.3.7 菊芋片褐变度的测定
用全自动测色色差仪通过反射法测定菊芋片的色泽。仪器的标准白板L* = 93.53，a* = -0.82，b* = 0.10。用L*值表示菊芋片的褐变度，L*值越小，说明褐变程度越大。
1.3.8 酶促褐变抑制剂配方的优化
在预实验基础上，选择抗坏血酸、柠檬酸亚锡二钠和EDTA作为酶促褐变的抑制剂。将菊芋片浸泡于不同浓度的抑制剂中30min，沥干水分，室温中静置48h后测定菊芋片的L*值。根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验基础上，选取柠檬酸亚锡二钠、EDTA和抗坏血酸3个影响因素，采用三因素三水平的响应曲面分析方法，试验因素与水平设计见表1。设该模型通过最小二乘法拟合的二次多项方程：
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design
式中：Y为预测响应值；Xi和Xj为自变量代码值；β0为常数项；βi为线性系数；βij为交互项系数；βii为二次项系数。
按照Box-Behnken试验设计的统计学要求，对上述方程的各项回归系数进行回归拟合。
2 结果与分析
2.1pH值对PPO酶活的影响
在室温条件下，采用邻本二酚为底物测定不同pH值对菊芋PPO酶活的影响，结果如图1所示。由图1可见，菊芋中PPO有两个最适pH值，分别为4.0和8.0，说明菊芋PPO有同工酶存在。众多研究表明，很多果蔬中的PPO存在同工酶，如葡萄[8]、蓝莓[9]、黑莓[10]等。胡建锋等[7]测得新鲜菊芋PPO最适pH值为7.4，而钱斯日古楞[11]、刘树文等[12]研究均发现菊芋PPO的最适pH值有两个，分别为pH4.6、7.8和pH5.4、8.0，与本研究结果基本一致。由图1还可看出，在极端酸性和碱性时酶的活力急剧降低，当pH＜4.0或pH＞8.0时，PPO相对活性显着下降，pH2.0、12.0时，PPO几乎失活。根据Lee等[8]的研究，在极端碱性环境下PPO的失活可能是由于酶蛋白的构像改变、或者迅速与美拉德反应、Strecker降解的产物发生反应。但是也有人认为在强碱条件下，铜会解离成氢氧化铜，从而使酶活性显着降低[9]。而在pH值低于2.0的酸性环境中，酶中的铜离子被解离出来，与酶蛋白脱离，使酶失活。
图1 pH值对菊芋PPO酶活的影响Fig.1 Effect of pH on Helianthus tuberosus L. PPO activity
2.2 温度对PPO酶活的影响
图2 温度对菊芋PPO酶活的影响Fig.2 Effect of temperature on Helianthus tuberosus L. PPO activity
由图2可见，PPO酶活先随温度升高而上升，在50℃时达到最大值，而后又随温度的升高而下降，其他温度时，PPO相对活性比较小，特别是当温度高于60℃，酶活急剧降低。这是因为随着温度升高，酶反应速度加快，当温度高于60℃时，酶蛋白发生变性失活。因此在菊芋加工中可采用低温或者高温处理来抑制其PPO酶活，延缓褐变。有报道菊芋PPO的最适温度分别为20[7]、35[11]、50℃[10]，造成如此大差异的原因可能是酶的提取方法、酶活性的测定方法以及菊芋品种的不同。
2.3PPO的热稳定性
将菊芋PPO在不同温度(50～80℃)保温后，立即冰浴冷却测定其残余酶活，由图3可见，菊芋PPO的热稳定性较差。当温度高于60℃时酶活随着保温时间的增加，残余酶活迅速下降，70℃保温3min后，残余酶活只有原始的6%。杨政水等[15]研究发现菊芋PPO在85℃处理5min或者在90℃处理1min后，酶活几乎全部丧失。因此在菊芋加工中，可采用热烫的方法来钝化PPO，抑制褐变。但是菊芋清脆的质构是其重要的特性，采用热处理的方法要注意加热对其质构的不利影响。在本研究中提取PPO时，菊芋经过去皮处理，因此PPO的热稳定性明显小于其他学者的报道，可能是菊芋皮中的PPO热稳定性更高，需要进一步加以研究。
图3 菊芋PPO的热稳定性Fig.3 Thermal stability of Helianthus tuberosus L. PPO
2.4 菊芋PPO的动力学特性
图4 底物浓度对菊芋PPO反应速度的影响Fig.4 Effect of substrate concentration on Helianthus tuberosus L. PPO activity
图4 是邻苯二酚底物浓度对菊芋PPO反应速度的影响。由图4可见，当底物浓度[S]≤0.05mol/L时，酶反应速度随底物浓度增加而增加，两者呈正比关系，表现为一级反应。随着[S]的进一步增加到0.05～0.09mol/L之间，反应速度不再呈比例增大，增加幅度逐渐下降，表现为混合级反应。当[S]≥0.09mol/L时，随着底物浓度的增大，酶的活性中心已经被底物饱和，因此反应速度V达到最大值并趋于不变，表现为零级反应。
由此得出菊芋PPO活性最适反应底物浓度为0.09mol/L，并且底物浓度与PPO活性的关系遵循Michealis-Menten的酶促动力学。根据 Lineweaver-Burk方程，以1/[S]为横坐标、1/V为纵坐标作图(图5)，求得米氏常数Km= 39.27mmol/L，最大反应速率Vmax= 1.369U/min。
图5 菊芋PPO的Lineweaer-Burk图Fig.5 Lineweaer-Burk plot for Helianthus tuberosus L. PPO
2.5 酶促褐变抑制剂的配方
2.5.1 单一抑制剂对菊芋褐变的影响
在预实验的基础上，选择抗坏血酸、柠檬酸亚锡二钠和EDTA作为酶促褐变的抑制剂。将菊芋切成3mm厚的薄片，按照菊芋:水=1:2(m/m)的比例，将菊芋片浸泡在不同浓度的抑制剂水溶液中，浸泡30min后取出，沥干表面水分，室温条件下静置48h后测定菊芋片的L*值，由图6可见，3种抑制剂对菊芋的酶促褐变都有抑制作用，当抗坏血酸浓度、柠檬酸亚锡二钠和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的质量浓度分别为0.02、0.03、0.02g/ 100mL时，菊芋片的褐变度与对照相比都有显着性差异(P＜0.05)。高于上述质量浓度，菊芋的褐变没有显着性差异。
图6 抑制剂质量浓度对菊芋褐变的影响Fig.6 Effect of inhibitor concentration on the browning of Helianthus tuberosus L.
2.5.2 复合抑制剂对菊芋褐变的影响
采用Box-Behnken试验设计对酶促褐变抑制剂的配方进行优化，试验设计与结果见表2。
表2 Box-Behnken试验设计和结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments
对试验结果进行方差分析，由表3可知，回归模型高度显着(P = 0.0216＜0.05)，失拟项不显着(P = 0.1168＞ 0.05)以及R2=0.9279和RSN=7.979，远大于4，可知回归方程拟合度和可信度均很高，能够很好地对抑制剂的抑制效果进行预测，不同组合条件下的预测L*值如表2所示。
由回归模型系数显着性检验结果可知，柠檬酸亚锡二钠、EDTA和抗坏血酸对褐变的抑制有显着影响(P值皆小于0.05)；二次项X32(P= 0.0430＜0.05)对酶促褐变的抑制有显着影响；交互项在P=0.05水平上均不显着，表明各个抑制剂之间没有相互协同的作用。
表3 响应曲面二次回归方程模型方差分析结果Table 3 ANOVA analysis for response surface quadratic model
图7 EDTA、柠檬酸亚锡二钠和抗坏血酸对菊芋L*值影响的响应面图Fig.7 Response surface plot for the effect of EDTA, distannous citrate and ascorbic acid on L*of Helianthus tuberosus L.
根据回归方程，作响应曲面图，考察所拟合的响应曲面的形状，分析3种抑制剂对褐变的影响。其响应曲面如图7所示。按照模型使用快速上升法进行优化，可得抑制剂液中柠檬酸亚锡二钠、EDTA和抗坏血酸的最佳质量浓度分别为0.02、0.02、0.04g/100mL，此条件下理论L*值为56.79。采用最佳抑制液浓度处理菊芋片，实际测得L*值为56.92，与理论值相比，其相对误差约为0.23%，表明响应面分析方法所得的最佳工艺参数准确可靠，具有实用价值。
3 结 论
由于PPO的作用，菊芋在加工过程中容易产生酶促褐变。实验结果表明，菊芋PPO酶反应遵循Michaelis-Menten动力学，最适温度50℃、最适pH4.0和pH8.0。因此要尽量避免在此温度和pH值下进行菊芋加工。柠檬酸亚锡二钠、EDTA和抗坏血酸对菊芋的酶促褐变有较好的抑制作用，将菊芋浸泡于由0.02g/100mL柠檬酸亚锡二钠、0.02g/100mL EDTA和0.04g/100mL抗坏血酸构成的复合抑制剂中30min，可以在48h内防止其发生褐变，但是3种抑制剂彼此之间并没有相互协同效应。柠檬酸亚锡二钠可以有效地防止菊芋的酶促褐变，可以作为除抗坏血酸、EDTA等传统抗褐变剂之外的新型添加剂。
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Effect of Compound Anti-browning Agents on Enzymatic Browning of Helianthus tuberosus L.
WANG Wei-dong1，SUN Yue-e1，LI Chao1，WANG Chun-yan1，ZHOU Ji-bo2
(1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China；2. Xuzhou Excellent Land Agriculture Development Co. Ltd., Xuzhou 221116, China)
Polyphenol oxidase (PPO) was extract from Helianthus tuberosus L. using sodium phosphate buffer and its enzymatic properties of PPO were characterized. Results indicated PPO from Helianthus tuberosus L. has an optimal reaction temperature of 50 ℃ and optimal pH of 4.0 or 8.0. The enzymatic kinetic parameters including Km and Vmax were 39.27 mmol/L and 1.369 U/ min, respectively. Response surface methodology was used to explore the best anti-browning formula, which were 0.02% EDTA (m/V), 0.02% distannous citrate (m/V) and 0.04% ascorbic acid (m/V) for 30 min during treatment process.
Helianthus tuberosus L.；polyphenol oxidase；enzymatic browning；distannous citrate
TS202.3
A
1002-6630(2010)24-0134-05
2010-02-26
徐州工程学院培育项目(XKY2009216)；苏北科技发展计划项目(SBN200910087)
王卫东(1971—)，男，讲师，博士，研究方向为食品资源开发与利用。E-mail：wwd.123@163.com
