程正涛，丁庆波，张 昊，任发政,*
(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.中粮集团有限公司，北京 100020)
海红果多酚提取工艺优化
程正涛1，丁庆波2，张 昊1，任发政1,*
(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.中粮集团有限公司，北京 100020)
目的：优化海红果多酚的提取工艺。方法：在单因素试验基础上，选择乙醇体积分数、提取温度、提取时间为自变量，多酚得率为响应值，采用Box-Behnken试验设计法，研究各自变量及其交互作用对海红果多酚得率的影响。利用SAS软件得到回归方程的预测模型，并进行响应面分析。结果：海红果多酚提取的最佳条件为乙醇体积分数52.4%、提取温度79℃、提取时间3.2h，海红果多酚得率9.25mg/g。结论：实际值与模型预测值偏差为0.22%，证明所选工艺条件为最佳工艺条件。
海红果；多酚；提取；响应面法
海红果(Malus micromalus Makino)是蔷薇科梨亚科苹果属楸子的果实，又名海红、海红子、子母海棠、小果海棠，学名西府海棠，主要分布在黄河中游山西、陕西、内蒙古三省交界地区[1-2]。目前植物多酚类物质逐渐成为研究热点，但大多集中在茶多酚、苹果多酚、葡萄多酚等方面[3-7]。海红果中富含多酚类物质，然而关于海红果多酚还未见报道。植物多酚是一类多羟基化合物，是良好的天然抗氧化剂，已广泛应用于食品、药品和日用品生产中[8-11]。对海红果中的多酚进行提取及应用研究将具有广阔的前景。
本实验通过对海红果多酚提取工艺中乙醇体积分数、提取温度、提取时间等因素与海红果多酚得率关系的研究，结合响应面法对海红果多酚提取工艺进行优化，旨在探求海红果多酚提取的最佳工艺条件。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
海红果，中粮集团有限公司提供，采自内蒙古呼和浩特市清水河县，于-20℃冻存；没食子酸(标准品)中国药品生物制品检定所；福林酚 Sigma公司；无水乙醇、无水碳酸钠等均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
UV-2102PC型紫外-可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司；ALC-210型万分之一电子天平 Acculab公司；DK-8B型电热恒温水槽 上海精宏试验设备有限公司；打浆机 顺德区金日电器实业有限公司；SHZ-D (Ⅲ)型循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。
1.3 方法
挑选无病虫害的海红果，去核、打成匀浆，称取匀浆5.0g，按照一定的提取条件浸提，抽滤，提取液在40℃下旋转蒸发浓缩，除去乙醇，测定并计算提取液中总多酚含量。
1.3.1 海红果多酚含量的测定
多酚含量测定采用福林酚法(Folin-Ciocalteu)[12]，以没食子酸为基准物质，计算海红果多酚含量。回归方程为y= 0.0112x＋0.0598，R2=0.9999。
1.3.2 海红果多酚得率的计算
式中：C为提取液中多酚质量浓度/(mg/mL)；V为提取液体积/mL；m为海红果果浆质量/g。
1.3.3 海红果多酚提取条件的优化
多酚提取过程中主要影响因素有乙醇体积分数、提取温度、提取时间、料液比、提取次数等。为了考察各因素对提取效果的影响，首先进行单因素试验，以乙醇体积分数(0、20%、40%、50%、60%、70%、80%、100%)、提取温度(40、50、60、70、80、90℃)、提取时间(1、2、3、4、5、6h)、料液比(1:5、1:10、1:15、1:20、1:30、1:40(g/mL))、提取次数(1、2、3次)作为试验因素，以多酚得率作为考察指标，研究各个因素对海红果多酚得率的影响规律。
在单因素试验结果的基础上，采用Box-Behnken试验设计方案，以乙醇体积分数、提取温度和提取时间为考察变量，分别以X1、X2、X3表示，以海红果多酚得率Y为响应值，以-1、0、1分别代表变量的水平，按方程X=(x-x0)/Δx对自变量进行编码，其中X为变量的编码值，x为变量的真实值，x0为试验中心点变量的真实值，Δx为变量的变化步长。试验因素与水平见表l。
表1 海红果多酚提取Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for optimizing the extraction of polyphenols from Malus micromalus Makino
2 结果与分析
2.1 乙醇体积分数对海红果多酚得率的影响
在提取温度80℃、提取时间1h、料液比1:20、提取2次的条件下，不同乙醇体积分数对海红果多酚得率的影响如图1所示。
图1 乙醇体积分数对多酚得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols from Malus micromalus Makino
由图1可知，乙醇体积分数小于50%时，随着乙醇体积分数的增加，海红果多酚的得率逐渐提高；乙醇体积分数超过50%后，多酚得率随着乙醇体积分数的增加而下降。这是因为多酚类物质在植物体内通常与蛋白质、多糖等以氢键和疏水键形成稳定的分子复合物。水断裂氢键的作用较弱，提取液中水的比例过高时，不足以破坏样品中多酚类物质与蛋白、多糖或其他物质的连接，多酚得率低，糖类等水溶性杂质浸出率也较高；乙醇体积分数过高时，脂溶性成分浸出较多，不利于多酚类物质的提取[13]。乙醇体积分数应以50%左右为宜。
2.2 提取温度对海红果多酚得率的影响
在乙醇体积分数50%、提取时间1h、料液比1:20、提取2次的条件下，不同提取温度对海红果多酚得率的影响如图2所示。
图2 提取温度对多酚得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of polyphenols from Malus micromalus Makino
由图2可知，提取温度低于80℃时，多酚得率随着温度的升高而升高；提取温度高于80℃时，多酚得率随着温度的升高而降低。这是因为提高温度，分子热运动加快，有利于多酚的浸出，但是由于多酚中含有大量的酚羟基，性质非常活泼，温度过高时不稳定，往往发生一些不可逆的化学反应，如氧化、缩合等，所以提取温度应该采用80℃左右为宜，并且时间不宜过长[14-15]。
2.3 提取时间对海红果多酚得率的影响
在乙醇体积分数50%、提取温度80℃、料液比1:20、提取2次的条件下，不同提取时间对海红果多酚得率的影响如图3所示。
图3 提取时间对多酚得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols from Malus micromalus Makino
由图3可知，适当延长提取时间有助于提高多酚得率，在3h时达到了极大值，但随着时间的延长，得率反而有所下降，其原因可能是多酚在高温下发生了降解、缩合、氧化等化学反应[16]，从而使测定值下降，所以提取时间以3h最好。
2.4 料液比对海红果多酚得率的影响
在乙醇体积分数50%、提取温度80℃、提取时间3h、提取2次的条件下，不同料液比对海红果多酚得率的影响如图4所示。
图4 料液比对多酚得率的影响Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of polyphenols from Malus micromalus Makino
由图4可知，当料液比低于1:20时，提高料液比有助于提高多酚得率；当料液比高于1:20时，提高料液比，多酚得率不再提高。这可能是由于料液比在1:20时溶剂已经能将海红果中的多酚溶解出来，继续增加溶剂用量，并不能显着提高多酚的得率。料液比过高，会导致溶剂浪费，同时醇溶性杂质浸出增多，对后处理不利。因此，从提取效果、减少溶剂用量和降低成本等方面综合考虑，料液比选用1:20比较合适[17]，正交试验中固定料液比为1:20。
2.5 提取次数对海红果多酚得率的影响
由图5可以看出，随着提取次数的增加，海红果中多酚的得率并没有显着增加，表明经一次提取后多酚已被浸提出来，这是由于该实验条件下提取剂与原料接触比较充分，一次提取已经能满足要求，因此从节省时间、溶剂和能源等方面考虑，对海红果中多酚采取一次提取。
图5 提取次数对多酚得率的影响Fig.5 Effect of extraction repeat number on extraction rate ofpolyphenols from Malus micromalus Makino
2.6Box-Behnken试验优化提取条件
海红果多酚提取Box-Behnken试验结果见表2。
表2 海红果多酚提取Box-Behnken试验方案与结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for optimizing the extraction of polyphenols from Malus micromalus Makino
2.6.1 模型的建立及其显着性检验
采用SAS v8.0软件对试验数据进行回归分析，由此可求出影响因素的一次效应、二次效应及其交互效应的关联方程，对海红果多酚提取的影响因素进行更深入的研究和条件优化，并作出响应面图。海红果多酚得率与各因素变量的二次方程模型：
对该模型进行显着性检验，结果见表3，回归模型系数显着性检验结果见表4。
表3 海红果多酚提取回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model for the extraction of polyphenols
从该模型方差分析可知，模型F=104.014＞F0.0l(9,4)= 14.66，P=0.0001＜0.01，本试验所选用的二次多项模型具有高度的显着性，失拟项在P＜0.05水平上不显着，其校正决定系数(R2Adj)为0.9851，表明此模型拟合度好，可以用此模型来分析和预测海红果多酚提取的工艺结果。
表4 海红果多酚提取回归模型系数的显着性检验结果Table 4 Significance test of regression model coefficients for the extraction of polyphenols
图6 各因素对海红果多酚得率的交互影响Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of any two factors on extraction rate of polyphenols from Malus micromalus Makino
由表4可知，乙醇体积分数的一次项达到极显着水平(P＜0.01)，表明乙醇体积分数对海红果多酚提取的线性效应显着，二次项X12对海红果多酚提取的曲面效应极显着，X22效应显着，各因素之间交互作用不显着。
响应值(Y)对各试验因子响应面分析及等高线图如图6所示。
由图6及表4中各系数项的P值可知，本试验中各因素显着程度依次为乙醇体积分数＞提取时间＞提取温度。优化后的提取工艺条件为乙醇体积分数52.4%，提取温度79℃，提取时间3.2h。在该工艺条件下，海红果多酚的得率9.27mg/g。在再重复实验3次，得出海红果多酚得率平均值为9.25mg/g，与模型预测值偏差为0.22%，证明所选工艺条件为最佳工艺条件。
3 结 论
通过Box-Behnken试验设计，对乙醇体积分数、提取温度、提取时间3个因素进行响应面优化，结果表明：乙醇体积分数对海红果多酚得率具有显着影响；优化后的提取工艺条件为乙醇体积分数52.4%、提取温度79℃、提取时间3.2h，在此工艺条件下，海红果多酚得率达到9.25mg/g。
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Extraction Processing of Polyphenols from Malus micromalus Makino
CHENG Zheng-tao1，DING Qing-bo2，ZHANG Hao1，REN Fa-zheng1,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；2. China Oil and Food Corporation, Beijing 100020, China)
Objective: To optimize the extraction processing of polyphenols from Malus micromalus Makino. Methods: Based on the single factor experimental analysis, the effects of ethanol concentration, extraction temperature, and extraction time on extraction rate of polyphenols from Malus micromalus Makino were evaluated by response surface methodology. Box-Behnken experimental design was used to explore the optimal extraction processing parameters on the basis of the effects of factors and their cross-interaction on the extraction rate of polyphenols. A regression equation prediction model was established by SAS software for the analysis of response surface values. Results: The optimal extraction conditions of polyphenols from Malus micromalus Makino were ethanol concentration of 52.4%, extraction temperature of 79 ℃ and extraction time of 3.2 h. Under these optimal extraction conditions, the extraction rate of polyphenols was up to 9.25 mg/g. The relative error between the actual extraction rate and predicted extraction rate was 0.22%. Conclusion: The achieved optimal processing conditions suitable for the extraction of polyphenols from Malus micromalus Makino.
Malus micromalus Makino；polyphenols；extraction；response surface methodology
TS255.3
A
1002-6630(2010)24-0172-05
2010-05-06
北京市教育委员会共建项目
程正涛(1985—)，男，硕士研究生，研究方向为乳品加工。E-mail：chengzhengtao@gmail.com
*通信作者：任发政(1962—)，男，教授，博士，研究方向为乳制品、畜产品、蛋品加工。E-mail：renfazheng@263.net
