张 坤，吴 皓,*，王令充，葛 莹，曹 杨
(1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210029；2.江苏省海洋药物研究开发中心，江苏 南京 210029)
四角蛤蜊多糖脱蛋白方法比较
张 坤1,2，吴 皓1,2,*，王令充1,2，葛 莹1，曹 杨1
(1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210029；2.江苏省海洋药物研究开发中心，江苏 南京 210029)
目的：优选出四角蛤蜊粗多糖脱蛋白的方法，并对脱蛋白后的产物进行含量测定和活性验证。方法：通过离子交换法、三氯乙酸(TCA)法、絮凝法及盐析法分别对四角蛤蜊粗多糖进行脱蛋白，比较各种方法的脱蛋白效果。结果：离子交换法、TCA法、盐析法脱蛋白效果都较理想，所得除蛋白多糖总糖含量分别为85%、90.96%、83%，絮凝法不适合对四角蛤蜊粗多糖中蛋白质的去除，活性实验表明TCA法和离子交换法所得样品降血糖活性较好，其中TCA法所得样品与模型对照组比较有显着性差异，P＜0.05。结论：优选方法合理可行。
四角蛤蜊粗多糖；脱蛋白；活性
随着多糖研究领域不断出现新的多糖和发现已知多糖的新功效，海洋多糖也越来越受到重视，这是由于海洋多糖具有来源丰富性、种类多样性和结构特殊性等特点。有专家指出：海洋多糖可能成为克服某些疑难病症的突破点，并且具有开发成为保健食品应用在食品卫生领域的潜力。四角蛤蜊(Mactra veneriformis)属于软体动物门(Mollusca)，瓣鳃纲(Lamellibranchia)，真瓣鳃目(Eulamellibranchia)，蛤蜊科(Mactridae)[1]，其肉质鲜美、营养丰富，是沿海地区常见的食用贝类。传统中医理论认为蛤蜊肉味咸、性寒，归胃、肝、膀胱经，滋阴、利水、化痰、软坚，主治消渴、酒毒、水肿、痰积、瘿瘤等[2]；现代研究报道，四角蛤蜊具有降血糖的功用[3]，其主要功效成分为多糖，可采用水提醇沉的工艺制备四角蛤蜊多糖，但水提醇沉物为多糖和蛋白的混合物，且不同年份、不同季节的四角蛤蜊多糖含量有所不同，有些年份和季节所产多糖含量较低，需要对其进行脱蛋白的操作，以提高其多糖含量。本实验在前期实验基础上，采用不同工艺对四角蛤蜊粗多糖进行脱蛋白处理，得到较精多糖进行肾上腺素诱发高血糖模型小鼠血糖影响的活性验证和比较，以期得到活性较好的四角蛤蜊多糖提取物，并优选出脱蛋白的最佳方法，从而更好的用于保健品的研究开发。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
四角蛤蜊粗多糖 江苏省海洋水产研究所；732阳离子交换树脂(批号：20080918)、三氯乙酸(批号：F20081104)、α-萘酚(批号：T20050930) 国药集团化学试剂有限公司；硫酸铵(批号：09092960578) 南京化学试剂有限公司；透析袋(截留相对分子质量为8000～10000) 美国Millipore公司；盐酸二甲双胍片(批号：0708212) 深圳市中联制药有限公司；盐酸肾上腺素注射液(批号：100106) 上海禾丰制药有限公司；PEG-6000(批号：71208) 成都市科龙化工试剂厂；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
752-型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；FA1104型电子分析天平 上海精密科学仪器有限公司；202型电热恒温干燥箱 上海索谱仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；Rotavapor R114薄膜旋转蒸发仪 瑞士Buchi公司；J-25型高效冷冻离心机 美国Beckman公司；Glucocard G meter GT1810型血糖仪(附加血糖试纸条) 日本Arkray公司。
1.3 脱蛋白实验
1.3.1 离子交换法[4]
称取一定量的732阳离子交换树脂，浸泡于水中，漂去异物，反复数次，待浸泡充分后装柱，以酸碱酸法处理后，蒸馏水冲洗至中性。称取0.8g四角蛤蜊粗多糖，用5mL蒸馏水溶解，缓缓沿壁均匀上样。以蒸馏水洗脱，流速1.0mL/min，每10min收集一管，逐管检测A580nm(多糖的硫酸蒽酮衍生物的吸收峰)、A280nm(蛋白质吸收峰)处峰。收集含糖部分，调节洗脱液pH值至7.0，70℃减压薄膜旋转浓缩。浓缩液中加入95%乙醇至含醇量达80%，边加边搅拌，冷藏静置12h。将醇沉物减压抽滤，滤饼以无水乙醇洗涤，60℃减压干燥，即得去除大部分蛋白的较精多糖。
1.3.2 TCA法[5-7]
取一定量的四角蛤蜊粗多糖粉末，用蒸馏水分别配制成20、33、50mg/mL的多糖溶液，逐滴加入等体积的质量分数5%三氯乙酸溶液，边加边摇匀，充分震荡，置于4℃静置4h以上，6000r/min离心20min，取上清液，用1mol/L NaOH溶液调至pH7，加入95%乙醇至含醇量达80%，边加边搅拌，冷藏静置12h；将醇沉物减压抽滤，滤饼以无水乙醇洗涤，60℃减压干燥，所得较精多糖用硫酸蒽酮法检测其总糖含量。将所得较精多糖用50倍水溶解，自来水透析24h，蒸馏水透析24h，透析液加入95%乙醇至含醇量达80%，边加边搅拌，冷藏静置12h；将醇沉物减压抽滤，滤饼以无水乙醇洗涤，60℃减压干燥，用硫酸蒽酮法检测其总糖含量。
1.3.3 絮凝法[8-10]
取一定量的四角蛤蜊粗多糖粉末，用蒸馏水分别配制成25mg/mL多糖溶液，离心取上清液，分别加入等体积质量分数10%、20%、40% PEG-6000溶液，边加边摇匀，搅拌10min，静置4h以上。6000r/min离心20min，沉淀利用Molish反应检测是否含有糖类成分，上清液加入95%乙醇至含醇量达80%，边加边搅拌，冷藏静置12h。将醇沉物减压抽滤，上清液用Molish反应检测是否含糖类成分，滤饼以无水乙醇洗涤，60℃减压干燥，用硫酸蒽酮法检测其总糖含量。
1.3.4 盐析法[11-13]
取一定量的四角蛤蜊粗多糖粉末，用蒸馏水分别配制成20mg/mL多糖溶液，离心取上清液，分别缓缓加入不同量研细的的硫酸铵细粉，至硫酸铵饱和度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，边加边摇匀，搅拌，4℃静置过夜，6000r/min离心20min，上清液透析72h。透析液加入95%乙醇至含醇量达80%，边加边搅拌，冷藏静置12h。将醇沉物减压抽滤，滤饼以无水乙醇洗涤，60℃减压干燥，用硫酸蒽酮法检测其总糖含量。
1.4 四角蛤蜊粗多糖对肾上腺素诱发高血糖模型小鼠血糖的影响[14-15]
取正常小鼠60只，按体质量随机分为6组，每组10只，分别为空白对照组、模型对照组 (250mg/kg)、1号样品组(400mg/kg)、2号样品组(400mg/kg)和3号样品组(400mg/kg)。二甲双胍可直接作用于动物离体灌注肝脏或肝细胞，使其利用多种底物进行糖异生作用减少，从而降低动物体内的血糖值。各组药物临用前用蒸馏水配制成所需浓度，再按上述剂量灌胃给药，空白组给予溶剂。每天1次，共10d。末次给药后禁食3h(不禁水)，正常对照组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水，其余5组均腹腔注射盐酸肾上腺素250μg/kg，注射30min后，各组小鼠取尾静脉血用血糖仪测定血糖值。
2 结果与分析
2.1 离子交换法
图1 离子交换法洗脱曲线Fig.1 Elution curve of crude polysaccharide from Mactra veneriformis on type 732 cation exchange resin
初步纯化的四角蛤蜊多糖，通过732阳离子交换树脂柱进一步分离，蒸馏水洗脱，自动收集馏分，逐管检测，如图1所示，多糖和蛋白质最高吸收峰重合，推测四角蛤蜊粗多糖可能含有多糖、蛋白质及多糖蛋白复合物；所得较精多糖用硫酸-蒽酮法检测总糖含量为85%，得率为27.16%，糖转移率为81.97%，效果较为理想，编号为1号样品。
表1 TCA法脱蛋白结果表Table 1 Effect of substrate concentration and operation number on deproteinization of crude polysaccharide from Mactra veneriformis by TAC method
2.2 TCA法
如表1所示，随着粗多糖底物质量浓度的降低和脱蛋白次数的增加，多糖的总糖含量不断增加，当底物质量浓度为33mg/mL，脱蛋白3次后，总糖含量可达68.00%，糖转移率达93.37%；当底物质量浓度为20mg/mL，脱蛋白1次，总糖含量可达64.48%，糖转移率达91.37%，将此多糖复溶透析48h后所得多糖总糖含量可高达90.96%，效果较为理想，编号为2号样品。
表2 PEG法脱蛋白现象表Table 2 Effect of PEG-6000 on Molish reaction phenomena
表3 PEG法脱蛋白结果表Table 3 Effects of PEG-6000 and substrate concentration on protein removal
2.3 絮凝法
由表2可知，10% PEG-6000溶液能使大部分蛋白质和部分多糖沉淀，20%和40% PEG-6000能使大部分蛋白质和大部分多糖都沉淀，由表3结果可知PEG-6000不适用于四角蛤蜊粗多糖中蛋白质的沉降，原因可能是其能同时使大分子的多糖和蛋白质同时沉降下来，而难以分离。
表4 盐析法脱蛋白结果表Table 4 Effects of substrate concentration and degree of saturation of ammonium sulphate on protein removal
2.4 盐析法
由表4可知，随着硫酸铵饱和度的增加，四角蛤蜊多糖的总糖含量随之增加，但多糖得率和转移率下降；当饱和度达到90%以上时，四角蛤蜊粗多糖中的多糖和蛋白质几乎全部沉降下来；当底物质量浓度为20mg/mL，硫酸铵饱和度为60%时，所得多糖总糖含量为83%，糖转移率为58.61%，效果较为理想，编号为3号样品。
2.5 四角蛤蜊粗多糖对肾上腺素诱发高血糖模型小鼠血糖的影响
表5 四角蛤蜊粗多糖对肾上腺素诱发高血糖模型小鼠血糖的影响(x±s, n=10)Table 5 Effect of deproteinized products of crude Mactra veneriformis polysaccharide by different methods on blood glucose level in diabetic mice with adrenaline-induced hyperglycemia
由表5可知，腹腔注射肾上腺素30min后，小鼠血糖显着升高(与空白组比较P＜0.01)，二甲双胍和四角蛤蜊多糖在30min时均具有对抗肾上腺素升血糖的作用。二甲双胍组和模型组比较有极显着性差异(P＜0.01)，2号样品组和模型组比较有显着性差异(P＜0.05)。
3 结 论
综上推测，四角蛤蜊粗多糖中含有游离的多糖、蛋白质以及多糖蛋白复合物质共同存在；除絮凝法，其他脱蛋白方法均可行，其中优选出的离子交换法、三氯乙酸(TCA)法及盐析法所得除蛋白多糖总糖含量分别为85%、90.96%、83%，效果均较理想。四角蛤蜊多糖具有降低肾上腺素高血糖小鼠血糖的作用，与空白对照组比较，均具有极显着性差异，P＜0.01；其中2号样品组与模型对照组比较具有显着性差异，P＜0.05。盐析后的多糖活性弱，原因可能是多糖在高盐环境下发生了构象变化，以致活性改变。因此，TCA法得到的脱蛋白多糖含量和活性效果都较理想，可用于四角蛤蜊保健品的研究与开发。
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Comparative Study on Deproteinization Methods for Polysaccharide from Mactra veneriformis
ZHANG Kun1,2，WU Hao1,2,*，WANG Ling-chong1,2，GE Ying1，CAO Yang2
(1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China；2. Jiangsu Provincial Centre for Research and Development of Marine Drugs, Nanjing 210029, China)
Objective: To screen the optimum method for deproteinizing crude polysaccharide from Mactra veneriformis and to determine the polysaccharide content and biological activity of purified product. Methods: The deproteinization of crude polysaccharide from Mactra veneriformis was comparatively studied using ion exchange, trichloroacetic acid (TAC) method, PEG flocculation and salt fractionation. Results: Ion exchange, trichloroacetic acid (TAC) method and salt fractionation had good deproteinizing effect on crude polysaccharide from Mactra veneriformis, and the polysaccharide contents in the resulting purified products were 85%,90.96% and 83%, respectively. PEG flocculation was unsuitable for the removal of protein impurities from crude polysaccharide from Mactra veneriformis. Ion exchange and TAC method provided highly effective hypoglycemic products, and the product derived from TAC method displayed a significant difference compared to the model control (P ＜ 0.05). Conclusion: The screened methods are feasible in practice.
crude Mactra veneriformis polysaccharide；deproteinnization；activity
R282.7
A
1002-6630(2011)08-0050-04
2010-07-04
国家海洋局公益性行业科研专项(200705009)；国家自然科学基金项目(30900293)
张坤(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为海洋药物及功能性保健品。E-mail：zkunsky@sina.com
*通信作者：吴皓(1957—)，女，教授，博士，研究方向为中药炮制学及海洋药物学。E-mail：whao5795@vip.sina.com
