吕淑霞，高 明，马 镝，于晓丹，张忠泽，陈宏权
(1.沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110866；2.中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁 沈阳 110016；3.东北制药总厂VC公司，辽宁 沈阳 110028)
VC是含有6个碳原子的酸性多羟基化合物，又名L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)。参与体内多种羟化及氧化还原反应，具有抗氧化性、提高机体免疫力、解毒、抗癌等作用[1]，被广泛应用于医药、食品、化妆品、饲料等行业。VC二步发酵法[2]是由我国自主研发的生物发酵法，主要由醇糖转化以及糖酸转化两步组成，其中第二步转化反应由两种细菌混合发酵完成，产酸菌为氧化葡萄糖酸杆菌，单独培养生长缓慢，传代困难，且产酸能力很弱；伴生菌为芽孢杆菌，易培养，不产酸，但与产酸菌混合培养可促进产酸菌生长及产酸[3]，已经发现多种菌种均可以作为伴生菌，例如：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、条纹假单胞菌(Pseudomonas striaia)、掷孢酵母(Sporoblomyces roseu)等[4-5]。但目前VC生产菌系较单一、生产菌种的转化率难以大幅度提升、原料利用率偏低，因此国内外学者不断进行技术革新，并致力于筛选转化率高、发酵速率快的优良菌系用于提高VC产量，进而提高设备利用率、降低生产成本[6]。本实验室筛选到一株枯草芽孢杆菌具有很好的伴生能力，可以有效提高产酸量并且使发酵终点提前，糖酸转化率可达94%左右，既降低成本又提高生产效率，具有很好的应用前景。常规优化发酵培养基多为其他因素固定，每次只研究—个变化因素[7]，这种研究方法效率低，且容易忽略因素间的交互作用而得出错误的结论，不能实现真正的最优化。响应面法是多变量系统寻优的试验策略，已成功应用于许多生物过程培养基和操作条件的优化[8-9]。本实验采用响应面设计法[10-13]的中心组合试验设计(central composite design，CCD)优化VC二步发酵培养基，最终得到较好的培养基配比，以提高2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KGA)产量。
1 材料与方法
1.1 菌种与培养基
氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)与巨大芽孢杆菌2980(Bacillus megaterium2980)均由东北制药总厂提供。枯草芽孢杆菌A9(Bacillus subtilisA9)，由本实验室筛选并保藏。
基础发酵培养基(g/L)：L-山梨糖80、玉米浆10、尿素 12、KH2PO41、MgSO40.2、CaCO35，pH 6.7～7.0。
1.2 仪器与设备
万分之一电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；LDZX型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；数显恒温水浴锅 江苏国华电器有限公司；HZP-250型全温振荡培养箱 上海精宏实验设备有限公司；超净工作台 苏州苏净集团安泰公司；UB-7型pH计 北京丹佛仪器有限公司。
1.3 培养方法
1.3.1 种子培养
分别挑取大小菌到无菌水中，然后挑一环大菌悬液于小菌悬液中，摇匀制成大小菌混悬液。用灭菌的接种环蘸取一环大小菌混悬液于空白培养过的试管斜面上划线，如此反复15～20次，直至斜面表面湿润，倒置培养2～3d(29℃)。将混菌斜面接种于种子培养基中，于29℃、180r/min培养24h。
1.3.2 发酵培养
将培养好的种液以10%的接种量转接至发酵培养基中，于29℃、180r/min培养48h。
1.4 分析方法
1.4.1 2-酮基-L-古龙酸测定
采用碘量法[14]测定。
1.4.2 响应面试验设计
单因素试验：通过固定其他成分而改变发酵培养基中一个组分(碳源、氮源、无机离子)的质量浓度，从而得出优化的发酵培养基，以上试验均采用的发酵条件为29℃、180r/min摇床培养48h。
在单因素试验的基础上，借助Design Expert软件，采用中心组合试验设计原理，选取L-山梨糖、尿素、玉米浆、CaCO3、MgSO4添加量为试验因素，以2-KGA产量为指标，进行响应面分析，试验因素水平设计见表1。
表1 试验因素水平及编码Table 1 Factors, levels and codes of response surface tests
表1自变量编码方程为：xi=(Χi－Χ0)/ΔX，式中：xi为自变量的编码值；Χi为自变量的实际试验水平值；Χ0为试验水平中心点的实际值；ΔΧ为单变量增量。因此，编码值与真实值之间的关系为：x1=(Χ1－80)/10；x2=(Χ2－12)/2；x3=(Χ3－14)/2；x4=Χ4－4；x5=(Χ5－0.2)×10。根据中心组合试验设计方案进行试验，用统计软件Design Expert 7.0对试验数据进行回归分析，可推测出最佳培养基添加量组合。
2 结果与分析
2.1 不同伴生菌伴生能力比较
表2 不同伴生菌与产酸菌混合搭配摇瓶发酵产2-KGA能力比较Table 2 Comparison of 2- KGA-producing ability of G.oxydans companying with different companion strains
由表2可知，伴生菌B.subtilisA9的促产酸能力明显高于生产用伴生菌B.megaterium2980。
2.2 单因素试验结果
2.2.1L-山梨糖添加量对发酵的影响
图1 不同L-山梨糖添加量对新菌系G.oxydans+B.subtilis A9产酸及转化率的影响Fig.1 Effect of L-sorbose concentration on 2-KGA production and conversion rate by strains of G.oxydans+B.subtilis A9
由图1可知，当L-山梨糖起始质量浓度为70g/L时，转化率高达99.42%，但是在大生产中投糖量过低会造成其他资源的浪费，降低设备的有效利用率，提高发酵成本。当L-山梨糖的起始质量浓度为90g/L时产酸量最高，但是糖酸转化率较低，而当糖质量浓度大于90g/L时，产酸量开始略微下降，这可能是因为过高的糖质量浓度会抑制菌体产酸，导致发酵时间延长。经比较发现起始糖质量浓度80g/L与90g/L产酸量相差较小，并且80g/L糖酸转化率较高，因而采用80g/L的起始糖质量浓度最为合适。
2.2.2 尿素添加量对发酵的影响
图2 不同尿素添加量对新菌系G.oxydans+B.subtilis A9产酸的影响Fig.2 Effect of urea addition amount on 2-KGA production and conversion rate by strains of G.oxydans+B.subtilis A9
在微生物生长过程中尿素不仅作为氮源，而且也作为一种生理碱调节微生物生长的pH值环境[15]。本实验通过梯度分析尿素质量浓度对混合菌发酵的影响，由图2可知，2-酮基-L-古龙酸的产量随着尿素质量浓度的增加呈现先升高后降低的趋势，其中在尿素质量浓度为12g/L，产酸量最高，当质量浓度低于12g/L时，反应未到终点尿素已消耗完，不能对小菌产酸发挥很好的作用，而高于12g/L会抑制菌体的生长，致使产酸量下降。因此选择的最优尿素质量浓度为12g/L。
2.2.3 玉米浆添加量对发酵的影响
图3 不同玉米浆添加量对新菌系G.oxydans+B.subtilis A9产酸的影响Fig.3 Effect of corn liquor amount on 2-KGA production and conversion rate by strains of G.oxydans+B.subtilis A9
由图3可知，随着玉米浆质量浓度的上升，2-KGA产量呈现上升趋势。当玉米浆质量浓度为14g/L时产酸量基本达到最高值，之后随着玉米浆质量浓度的增加，产酸量基本相同。即玉米浆质量浓度在14g/L时已可满足大菌生长和小菌产酸的营养需求，因此选择的最优玉米浆含量为14g/L。
2.2.4 不同CaCO3添加量对发酵的影响
图4 不同CaCO3添加量对新菌系G.oxydans+B.subtilis A9产酸的影响Fig.4 Effect of CaCO3 amount on 2-KGA production and conversion rate by strains of G.oxydans+B.subtilis A9
由图4可知，随着CaCO3质量浓度的增加，2-KGA产量呈现先上升后下降的趋势。当CaCO3质量浓度为5g/L时混合菌系产酸量最高，低于或高于该质量浓度菌系产酸量都稍低，这是由于过低的CaCO3质量浓度不利于缓冲发酵液中的酸，造成酸的反馈抑制作用，不利于大菌的生长；而较高的CaCO3质量浓度又会抑制菌体生长，降低菌系产酸量。因此选择的最优CaCO3质量浓度为5g/L。
2.2.5 不同MgSO4添加量对发酵的影响
图5 不同MgSO4添加量对新菌系G.oxydans+B.subtilis A9产酸的影响Fig.5 Effect of MgSO4 amount on 2-KGA production and conversion rate by strains of G.oxydans+B.subtilis A9
由图5可知，随着MgSO4质量浓度的增加，2-KGA产量呈现先上升后下降的趋势。当MgSO4质量浓度为0.2g/L时，菌系的产酸量最高，而当质量浓度高于0.2g/L时2-KGA产量降低，产生抑制作用。据报道[16]，2-KGA在还原酶作用下生成L-艾杜糖酸，推测高质量浓度MgSO4激活了2-KGA还原酶，使2-KGA进一步还原成L-艾杜糖酸，使得2-KGA的得率下降。与本结果一致。
2.3 响应面法优化VC二步混合菌发酵培养基
按照中心组合试验方案进行五因素五水平试验，试验结果见表3。
利用Design Expert对表3中试验数据进行多元回归设计及分析，获得2-KGA产量对5个编码自变量L-山梨糖(x1)、尿素(x2)、玉米浆(x3)、CaCO3(x4)、MgSO4(x5)的二次多项回归方程(模型1)：
表3 中心组合试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface central composite tests
2.3.1 回归方程方差分析
对模型方程回归系数进行显着性检验分析见表4。对模型方差分析结果表明，相关系数R2=0.9892，校正系数=0.9696，本试验所选用模型(1)具有高度的显着性(P＜0.0001)，说明该方程与实际情况拟合良好，可以用该方程代替真实实验点进行分析。对回归方程系数进行显着性检验(表4)，表明x1、x3、、、x32、、对2-KGA产量有极显着影响((P＜0.0001)；x2、x1x3对2-KGA产量影响显着(P＜0.05)，其他项系数均不显着。依据系数估计值x1=3.03、x2=0.32、x3=0.86、x4=0.27、x5=0.024可知因素的主效应关系为L-山梨糖＞玉米浆＞尿素＞碳酸钙＞硫酸镁。在α=0.05显着水平下剔除不显着项后，对模型(1)进行优化可得模型(2)：
表4 回归方程方差分析Table 4 Analysis of variance for the fitted regression equation with 2-KGA yield as a function
2.3.2 响应面分析与优化
根据CCD模型建立的二次回归方程，固定3个因素在编码值0的水平，分析另外两因素对2-KGA产量的影响，利用Design Expert软件进行响应面曲线图分析，探讨各因素及其交互作用对响应值的影响。
选取显着性影响因素L-山梨糖、玉米浆、尿素为主要研究对象，结果分析可知，低水平和高水平的影响因素都不利于2-KGA产量的提高。比较图3的曲面图可知，L-山梨糖对2-KGA产量影响最为显着，表现为曲线较陡，随着L-山梨糖含量的提高产酸量逐渐增加，但当L-山梨糖添加量大于87g/L时响应值提高缓慢。因此，从成本考虑选择的L-山梨糖添加量为85～90g/L；尿素和玉米浆均随其添加量的提高，产酸量呈现先升高后降低的趋势，从变化速率来看，玉米浆组分的主效应大于尿素。由此可知，在试验水平内，适当的增加L-山梨糖添加量有利于2-KGA产量的提高。在各因素中L-山梨糖与玉米浆的交互作用显着(图6B)。采用Design Expert软件完成优化，得到的优化结果为：L-山梨糖90g/L、尿素12.2g/L、玉米浆14.2g/L、CaCO34.1g/L、MgSO40.2g/L，在此条件下2-KGA产量为70.33g/L。
图6 两因素交互作用对2-KGA产量的影响Fig.6 Effect of cross-interaction between two factors on 2-KGA production
2.3.3 验证实验
为了检验模型预测的准确性，利用优化后的营养条件(L-山梨糖90g/L、尿素12.2g/L、玉米浆14.2g/L、CaCO34.1g/L、MgSO40.2g/L)进行发酵实验，3次重复，所测得的2-KGA产量分别是69.22、68.84、71.15g/L，3次重复的平均值为69.74g/L。实际实验值与模型预测值基本一致，可见该模型能较好地预测实际发酵产酸的情况。
3 结 论
用响应面分析法(RSM)建立了VC二步混合菌发酵培养基的数学模型。响应面法的试验统计方法能快速、有效地对影响发酵的设定因素实现条件优化，得到最佳发酵培养基条件。其中L-山梨糖对小菌的生长和产酸至关重要；玉米浆中含有多种氨基酸，可提供多种营养物质供菌体生长，是影响2-KGA产量的另一重要因素[17]；而尿素作为氮源是促进菌体生长的必需营养元素，并且有利于中和发酵周期中的酸性环境；无机盐类是微生物生命活动不可缺少的物质，其主要功能是参与构成菌体成分、作为酶的组成部分或维持酶的活性、调节渗透压等，本研究中选取碳酸钙和硫酸镁为主要研究的无机盐类物质。响应面法获得的VC二步混合菌发酵优化培养基为：L-山梨糖90g/L、尿素12.2g/L、玉米浆14.2g/L、CaCO34.1g/L、MgSO40.2g/L。经软件分析得到2-KGA产量验证值为70.33g/L；通过新菌系经发酵培养基优化后，其48h产酸量为69.74g/L，明显高于优化前产酸量59.42g/L，平均提高17.4%。二步发酵法研究初期，从L-山梨糖到2-酮基-L-古龙酸的转化率仅为39.7%(糖质量浓度70g/L)[18]，经多方面改进，目前现用生产菌系转化率可达85%(糖质量浓度80～100g/L)左右；郭礼强等[19]利用紫外线(UV)、亚硝基胍(NTG)及两者的复合诱变方法选育得到一株苏云金芽孢杆菌UN-366，转化率达到89.2%；仲崇斌等[20]以掷孢酵母作为伴生菌与氧化葡萄糖酸杆菌组成新混菌体系，转化率达66.81%。本实验室新菌系经优化后发酵终点糖酸转化率可达到94%左右(糖质量浓度90g/L)，明显优于现用生产菌系。实验经检验证明，该摇瓶发酵生产2-KGA的工艺参数合理可靠。
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