张 辉，张娜娜，马 丽，唐 坚，乔勇进*
（1.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093；2.上海市农业科学院农产品保鲜加工研究中心，上海 201403；3.上 海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234）
响应面法优化大麦苗叶绿素提取工艺
张 辉1,2，张娜娜3，马 丽1，唐 坚3，乔勇进2,*
（1.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093；2.上海市农业科学院农产品保鲜加工研究中心，上海 201403；3.上 海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234）
为优化大麦苗叶绿素的提取工艺，试验以乙醇-水为溶剂对大麦苗叶绿素进行浸渍提取。采用Plackett-Burman试验设计筛选影响大麦苗叶绿素提取量的显着因素，通过中心组合试验设计优化其提取工艺参数。结果表明：液料比、乙醇体积分数及提取时间是影响叶绿素提取量的显着因素。优化所得最佳提取工艺参数为液料比31∶1、乙醇体积分数92%、提取时间112 min。 在此条件下，叶绿素提取量为13.622 mg/g，与预测值13.646 mg/g较一致。故响应面法可用于优化大麦苗叶绿素的提取工艺，且其优化工艺参数可为大麦苗叶绿素工业化生产提供参考。
Plackett-Burman试验设计；中心组合试验设计；大麦苗叶绿素；提取工艺优化
大麦嫩苗因富含叶绿素、类黄酮、维生素、抗氧化酶及蛋白质等多种功能营养成分，其资源的开发、利用已逐渐受到广泛关注，如麦绿素、麦汁等相关产品的研制[1-2]。叶绿素属卟啉类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、消炎、预防癌症等多种生理功能[3]。叶绿素及其衍生物作为天然色素在食品、医药及日用化工领域已得到广泛应用[4]。此外，随着对叶绿素生理功能研究的不断深入，以叶绿素为主要原料的功能性食品种类及数量也逐渐增多[5-6]。目前，天然叶绿素主要提取原料为蚕沙[7]、菠菜[8]及生物土壤结皮[9]等。以大麦苗为原料进行叶绿素定向提取并对其提取工艺参数进行响应面法优化的研究未见报道。大麦苗因其原料具有种植周期短、成本低、产量大及易加工等优点，可作为叶绿素提取的优选原料。Castle等[10]通过研究丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亚砜对生物土壤结皮叶绿素a的提取效果，发现乙醇和二甲基亚砜的双萃取具有较好的提取效果。也有研究表明乙醇-丙酮的混合溶液因具有协萃作用，从而得到更高的叶绿素提取率[11]。但二甲基亚砜和丙酮均具有一定毒性，对人体具有危害性。Macías-Sánchez等[12]采用超临界流体和微波辅助法对盐生杜氏藻（Dunaliella salina）叶绿素a进行提取，发现二者均优于传统溶剂浸提法。但超临界流体萃取、微波辅助提取等新兴物理提取技术均存在投资成本高，难以实现规模工业化生产等缺陷。本实验以乙醇-水为提取溶剂，对大麦苗进行常温浸渍提取，采用Plackett-Burman试验设计、中心组合试验设计（central composite design，CCD），探讨了提取大麦苗叶绿素的显着影响因素及其最佳工艺条件，以期为拓宽叶绿素提取原料的来源，进一步提高大麦嫩苗资源利用率及大麦苗叶绿素规模工业化生产提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
六叶期大麦苗（品种：大中88-91），采收于上海市农业科学院试验田；无水乙醇（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Ultrospec 3300 pro紫外分光光度计 美国安玛西亚公司；D37520 Osterode 高速冷冻离心机 德国Biofuge公司；KK29E-18T1型冰箱 德国Siemens公司；BP301S型电子天平 德国赛多利斯公司；FW-400A高速粉碎机、ZHWY-2102C双层恒温摇床 上海智成分析仪器制造有限公司；Modul YOD-230真空冷冻干燥机 美国Thermo Savant公司。
1.3 方法
1.3.1 叶绿素提取工艺流程
大麦苗鲜样→挑选、清洗、沥干→真空冷冻干燥（预冻温度：－45 ℃；冷阱温度：－37 ℃；升华温度：25 ℃；真空度：170 Pa）→粉碎（100目）→浸提→过滤→减压浓缩成膏状（水浴温度：30 ℃；真空度：110 Pa）。
1.3.2 Plackett-Burman试验设计
表1 Plackett-Burman 设计因子水平及编码值Table1 Coded levels for independent variables used in Plackett-Burman experimental design
Plackett-Burman试验设计可通过较少的试验次数从多因素系统中筛选出显着的影响因素[13]。根据前期单因素试验结果，采用Plackett-Burman试验设计（表1），以乙醇体积分数、液料比、提取时间、提取温度、提取次数和摇床转速共6个因素和5个虚拟变量为试验因子，筛选影响大麦苗叶绿素提取量的显着因素。所有因子均设高（＋）、低（－）两个水平，共12次试验，每次试验进行3组平行试验。其中虚拟变量的设计用于估计试验总体偏差。
1.3.3 中心组合试验设计
根据Plackett-Burman试验结果，选择乙醇体积分数、液料比和提取时间为试验因子，采用3因素5水平，20次试验的CCD对大麦苗叶绿素提取工艺参数进行优化，试验按随机顺序进行。因子水平编码表见表2。根据试验结果，可建立二次非线性回归模型，式（1）[14]。
式中：Y为叶绿素提取量预测值；Xi、Xj为试验因素的编码值；β0、βii、βij为截距及回归常数；其中，式中Xi为无量纲的编码值，xi为变量i的实际值，xi0为变量i的零水平实际值。Δxi为变量i的步长实际值，即编码值变化一个单位所对应的实际变化值。
采用F检验考察回归模型显着性；最小二乘法估计 回归模型系数，t检验法分析模型系数显着性。因子贡献率采用式（2）计算[15]：
式中：SSj为因子平方和；SST为模型总平方和。
表2 中心组合试验设计因子及编码水平Table2 Coded levels for independent variables used in central composite experimental design
1.3.4 指标测定
将干燥后的大麦苗用高速粉碎机粉碎，过100目筛。称取样品约2.00 g置于250 mL锥形瓶中，按一定液料比加入乙醇溶液提取溶剂，用封口膜将锥形瓶密封并置于摇床中以一定转速恒温摇晃浸提，提取完成后将提取液10 ℃、10 000 r/min离心15 min，取2 mL上清液用相应体积分数的乙醇溶液定容至50 mL容量瓶中，采用紫外分光光度法测定叶绿素含量[16]；叶绿素提取量采用式（3）进行计算。
式中：Y为大麦苗叶绿素提取量/（mg/g）；m为提取液中叶绿素含量/（mg/mL）；M为提取样品质量/g。
1.4 数据处理
Plack ett-Burman试验数据处理采用Minitab 16.0，CCD试验数据处理采用Desi gn-Expert 8.0.6.1、SAS 9.2，Origin 8.0绘制主效应图。
2 结果与分析
2.1 Plackett-Burman试验结果
表3 Plackett-Burman 试验设计矩阵及响应值Table3 Plackett-Burman design matrix and responses
对PB试验结果采用Lenth[17]法识别显着效应，得到了因素标准化效应的半正态概率效应图（图1a）以及因素标准化效应的帕累托图（图1b）。由图1a可看出，因素x1、x2、x3的标准化效应点离拟合线较远，位于图右侧偏上，故其为显着影响因素（P＜0.05），即影响大麦苗叶绿素提取率的显着因素是乙醇体积分数、液料比、提取时间。其他因素标准化效应点均较小且接近零，为不显着影响因素（P＞0.05）。标准化效应的帕累托图（图1b）进一步确定了效应的量值和重要性。此外，其还表明所有因素均为正效应因素。对于影响叶绿素提取量不显着的因素，在后续试验中均维持其在低水平，以减少资源浪费。
图1 叶绿素提取量的显着影响因素Fig.1 Factors having a significant influence on chlorophyll extraction yield
2.2 CCD试验结果
2.2.1 回归模型的建立
本试验共设20次试验，其中包括8次全因子试验、6次星号点试验及6个中心点试验。所有试验均进行3组平行试验，取其平均值作为响应值。试验方案及结果见表4。
表4 CCD设计矩阵及响应值Table4 Central Composite Design matrix and responses
利用Design-Expert 8.0软件对表4结果进行统计分析，并建立三元二次回归方程式（4）：
2.2.2 回归模型的统计检验
表5 回归模型显着性检验结果Table5 Results of significance test for the fitted regression model
由表5可知，判定系数（R2）为0.993 8说明模型相关性较好，试验因子对响应值有较大影响。校正判定系数（）为0.988 1，表明98.81%的试验数据的变异性可用此回归模型来解释。变异系数（variation coefficient，CV）为0.67%，表示试验的可信度和精确度较好。精密度是有效信号与噪音的比值，其值大于4.0视为合理，本试验精密度为43.923，表明其为一个适宜的信号。模型F值为176.86，表明其达到极显着水平（P＜0.01）。即乙醇体积分数、液料比、提取时间等全部解释变量对被解释变量的共同影响具有差异极显着性，且模型一次项、二次项均达到显着水平（P＜0.05）。此外，失拟项F值为1.273 6（P＝0.398 6＞0.05），表明失拟值和纯误差没有显着性关系，即回归模型在被研究的整个回归区域不失拟。
表6 回归模型系数显着性检验结果及置信区间Table6 Significance test results and confidence interval of coefficients of the regression model
回归模型系数t检验结果（表6）表明，各一次项、二次项和交互项X2X3均对叶绿素提取量影响极显着（P＜0.01），交互项X1X2、X1X3对叶绿素提取率影响达显着水平（P＜0.05）。此外，回归模型各项系数的置信区间均较窄，说明模型系数值离真实值较近，其精确度高。综上可知，该模型能用于指导试验。
2.3 模型效应分析
2.3.1 主效应分析
由于模型存在交互效应，故不宜用回归系数的绝对值大小来直接比较二次项、交互项作用的大小。因此，本试验均采用因子贡献率来衡量各因子对叶绿素提取量的影响大小。图2表明，一次项效应＞二次项效应＞交互项效应。模型各项间乙醇体积分数的二次效应影响最显着，其次是其一次项效应，而液料比和乙醇体积分数的交互作用对叶绿素提取率影响最小。3个试验因素的效应大小依次为乙醇体积分数＞液料比＞提取时间。
图2 因子贡献率Fig.2 Percentage contributions of factors
2.3.2 单因素效应分析
将回归模型（式4）中的两个因素固定在零水平，得到液料比（X1）、乙醇体积分数（X2）、提取时间（X3）的单因素模型，分别为式（5）～（7）。在－1～＋1水平间可得到各因子的单因素轨迹图（图3）。
图3 单因素轨迹图Fig.3 Perturbation of single factors
由图3可看出，各因子对叶绿素提取量的影响趋势，并可由曲线的走向及弯曲程度看出各因子与响应值的关系。增加液料比，传质动力增加，有助于叶绿素溶出，故前期响应值增加较快。但液料比大于25∶1后，大麦苗中叶绿素已基本溶出，而呈现平稳趋势。叶绿素提取量伴随乙醇体积分数和提取时间的变化均呈下开口抛物线趋势，但二者的上升、下降幅度不同，其中乙醇体积分数变化幅度较大，说明乙醇体积分数对叶绿素提取量影响较大。
2.3.3 两因素效应分析
图4 叶绿素提取量响应面图及等高线图Fig.4 Response surface plots and contour plots for chlorophyll extraction yield
由图4a可知，叶绿素的提取量随液料比的增加呈现先快速增长而后增长缓慢的趋势。增加液料比可增加传质动力，有助于叶绿素的溶出，但当液料比达到一定程度时，已溶出大部分叶绿素，若再增加液料比，则叶绿素提取量增加缓慢。图4b表明乙醇体积分数对叶绿素提取率的影响较显着，表现为其曲线较陡。此外，由其还可看出，叶绿素提取率随着乙醇体积分数的增加呈现先增大后减小的趋势。这可能是由于乙醇极性较弱，体积分数增大减小了提取液极性，使其更接近于叶绿素的极性，从而增加了叶绿素的溶出。但由于部分叶绿素是以和蛋白质结合的形态存在于植物细胞中，故乙醇体积分数过高会减少此部分的叶绿素溶出。液料比与乙醇体积分数的等高线图为椭圆形状，表明二者交互效应显着，与方差分析结果一致。最优点较接近于液料比为30∶1和乙醇体积分数为92%处，并在这两点附近达到最大值。此外，还可看出，叶绿素提取量对液 料比的变化比对提取时间变化更为敏感。图4c表明叶绿素提取率随提取乙醇体积分数的增大和提取时间的延长呈先上升后下降的趋势，且二者有明显的交互作用。
2.4 反应条件的优化与模型验证
规范分析[18]能求出响应面的拐点并判断其类型（最大值点、最小值点、马鞍形点）。对试验结果进行规范分析（表7），得到叶绿素提取的一个稳定点，该点处理论响应值为13.646。由于特征值均为远离零值的负数，且稳定点在可试验区域内，故一般认为此稳定点为最大值点，无需进行岭脊分析。考虑到实际工作的便利，将浸提工艺修正为液料比31∶1、乙醇体积分数92%、提取时间112 min。采用修正后的工艺参数进行3次平行验证实验，测得叶绿素提取量为13.622 mg/g，与模型预测值相差不大。此外，其显着高于已报道的其他植物叶绿素提取含量，如桑叶[19]（5.376 mg/g，干质量）、蚕沙[7]（2.68 mg/g，干质量）等。范燕青等[20]以水为溶剂，采用正交试验设计，在提取温度25 ℃、时间2 h、料液质量比1∶3、提取次数2次的工艺条件下得到的大麦苗叶绿素提取量为12.80 mg/g，低于本实验工艺条件下的结果。这可能是因为叶绿素极性较弱，在水溶液中较难渗出。此外响应面试验设计能够探寻出试验因素在整个区域水平中的最佳参数组合，克服了正交试验设计只能给出试验因素在设定水平下的最佳组合的缺陷，从而得到了较高的叶绿素提取率。陈绍瑗等[19]采用响应面法试验设计得到的桑叶叶绿素提取的最佳工艺参数为提取时间5.25 h、提取温度56.5 ℃、液料比103∶1。其工艺参数值均高于本研究工艺参数值。这可能是由于桑叶原料细胞壁较为坚硬，且其原料破碎程度较小造成。
表7 规范分析结果Table7 Results of canonical analysis
3 结 论
通过Plackett-Burman设计，筛选出影响大麦苗叶绿素提取量的显着因素为乙醇体积分数、液料比、提取时间，并通过CCD 试验设计建立了显着影响因素与大麦苗叶绿素提取量之间的三元二次回归模型，确定了大麦苗叶绿素最佳提取工艺参数为液料比31∶1、乙醇体积分数92%、提取时间112 min，在此工艺条件下，叶绿素提取量为13.622 mg/g，其与预测值13.646 mg/g基本一致。故该模型能反映大麦苗叶绿素提取过程中的内部规律，可较好地预测大麦苗叶绿素的提取情况，并能为拓宽叶绿素提取原料的来源、进一步提高大麦嫩苗资源利用率及大麦苗叶绿素工业化生产提供理论参考。
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Optimization of Extraction Process for Chlorophyll from Young Barley Grasses Based on Response Surface Methodology
ZHANG Hui1,2, ZHANG Na-na3, MA Li1, TANG Jian3, QIAO Yong-jin2,*
(1. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 2. Agricultural Products Storage and Processing Research Center, Shanghai Academy of Agricultural Science, Shanghai 201403, China; 3. College of Life and Environmental Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)
The extraction of chlorophyll from young barley grasses with aqueous ethanol as extraction solvent was optimized. Significant variables that influence extraction efficiency were selected by Plackett-Burman experimen tal design and optimized by central composite experimental design. Solid-to-solvent ratio, ethanol concentration and extraction time were identified as main influencing parameters. The optimal extraction condition s were fo und to be 31:1, 92% and 112 min. Under these conditions, the observed yield of chlorophyll was 13.646 mg/g, approximating to the predicted value of 13.622 mg/g. It can be concluded that response surface methodology is applicable to optimize the parameters for extraction of chlorophyll from young barley grasses and the optimized extraction process parameters can provide a reference for industrial production of chlorophyll from young barley grasses.
Plackett-Burman design; central composite design; chlorophyll of young barley grasses; optimization of extraction process
R284.2
A
1002-6630（2014）02-0075-06
10.7506/spkx1002-6630-201402014
2013-05-09
上海市科委国际合作计划项目（073907003）
张辉（1988—），男，硕士研究生，研究方向为农产品保鲜与加工。E-mail：nd_zh@sina.com
*通信作者：乔勇进（1967—），男，研究员，博士，研究方向为农产品保鲜与加工。E-mail：yjqiao2002@126.com
