高 琳，杨安树，高金燕，陈红兵,
(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大学生命科学与食品工程学院，江西 南昌 330047）
食物过敏（食物超敏反应）是由食物引起机体免疫系统的异常反应。更确切地说，是由食物中的过敏原所引起的变态反应。食物过敏已成为一个全球性公共卫生问题。据报道显示，成年人的过敏反应发生率约3%～4%，儿童发生率高达6%[1]。目前，已确定的过敏性食物有180种以上，据联合国粮农组织报告表明，90%以上食物过敏原存在于牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类水产品、花生、大豆、坚果类及小麦八大类食物中[2]。食物过敏反应对机体的危害很大，可影响呼吸系统、胃肠系统、中枢神经系统、皮肤、肌肉和骨骼等，甚至可能产生过敏性休克危及生命。目前，国内外的研究着重于食物过敏原的致敏性检测，而关于食物过敏原致敏性强弱的评价及其判断标准研究较少。鉴于每个个体对过敏原免疫应答的灵敏度不同，食物过敏原的致敏性评价具有重要的意义。
食物过敏反应的物质基础包括食物过敏原和特异性IgE。根据评价对象不同，食物过敏原的致敏性评价方法分为血清学方法和细胞学方法两大类。血清学方法主要是根据蛋白与阳性血清中IgE的结合能力大小，对其致敏性进行评价。细胞学方法则是根据蛋白刺激免疫细胞产生炎症介质的情况对其致敏性进行评价的。根据评价方法进行场所的不同，又可以分为体内法、体外法和生物信息学比对法。体内法包括双盲安慰剂对照的食物激发实验（double-blind placebo-controlled food challenges，DBPCFC）、皮肤实验(skin testing，ST)和动物模型，体外实验包括过敏原吸附实验、免疫印迹法（immunoblotting）、酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、组胺释放实验和模拟肠胃消化等。
1 体内法
体内法是使用极微量的食物过敏原刺激机体，然后根据机体有无过敏反应的症状或检测机体内IgE的水平来评价食物过敏原的致敏性。
1.1 双盲安慰剂对照的食物激发实验
双盲安慰剂对照的食物激发实验（double-blind,placebo-controlled food challenge，DBPCFC）是使用可疑食物刺激患者，再根据患者的症状确定该食物是否具有致敏性。该法被认为是诊断食物过敏的金标准，同时也可用于测定致敏性食物的阈值[3]。在缺乏过敏反应的情况下，仅根据血清学方法检测IgE的结果来决定排除饮食是不充分的[4]，而使用DBPCFC确定食物过敏原可以有效停止多数儿童不必要的饮食排除[5]。DBPCFC一般需要在医院或门诊部进行，要求有能够处理严重过敏反应的医护人员和设备，由经验丰富的护理人员进行操作检测[6]。实验中最关键的是控制双盲、实验剂量和安慰剂。控制双盲要求尽可能消除被检食物与安慰剂的差别，即媒介物能掩盖被检食物的味道、质地及气味，这样就限制了实验剂量，但可以尽量减少受试者的主观因素对实验结果的影响[7-8]。对多数食物、患者和临床情况，每隔20 min，分别使用3、10、30、100、300、1 000、3 000 mg的攻击剂比较合适[9]。对于液态和糊状食物，使用剂量不能超过250 mL；对于固态食物，使用剂量不得超过125 g[10]。Vlieg-Boerstra等[10]验证了几种分别适用于幼儿、大龄儿童以及成人DBPCFC实验的含有不同食物过敏原的食谱，有助于该检测方法的推广应用。Gushken等[11]将DBPCFC实验应用于儿童牛乳过敏的临床诊断，并认为，当实验的执行参数设置适当且有医师监护时，此法是可行且安全的。
DBPCFC评价食物过敏原的致敏性，主要是根据激发剂量与过敏反应的强弱程度来评价过敏原的致敏性。产生过敏反应需要的激发剂量小、过敏反应强烈，则过敏原的致敏性强，反之则致敏性弱。由于DBPCFC的实验结果受多种因素的影响，该方法还需要进一步标准化。口试期间由于使用药物或短期特异性口服耐受导致的临床耐受现象，会造成DBPCFC实验结果呈假阴性；口试期间未能做到严格的饮食控制，其他孩子和访客提供被试者可疑食物，或患有异位性湿疹的小孩在饮食排除时没有排除与湿疹症状相关的食物，都会造成假阳性结果[12]。van der Zee等[13]发现，随着年龄及特异性IgE水平的增加，不患异位性皮炎的人接受DBPCFC实验的灵敏度越高（激发剂量越低）。由于DBPCFC实验具有一定风险，且目前我国医患关系紧张，DBPCFC实验在我国极少使用。
1.2 皮肤实验
皮肤实验是借助抗原、抗体在皮肤内或皮肤上的反应进行免疫学检测。皮肤实验有两种，一种是皮肤点刺实验（skin prick testing，SPT），另一种是皮内实验（intradermal testing，IDST）。SPT灵敏度与临床结果高度一致，且特异性好，但不如皮内实验灵敏[14]。SPT一般选择前臂内侧或后背上健康完整的皮肤，研究表明，后背比前臂内侧更适宜于进行SPT[15]。不是所有患者都适合进行SPT，如严重的荨麻疹患者[16]。Kamdar等[17]研究嗜酸性粒细胞性食管炎患者时，发现SPT对气源性致敏原的预测比对食物过敏原的预测更准确。SPT实验要结合血清学实验分析，以确保实验结果的准确性。SPT阴性结果对排除食物过敏反应有较好的准确性（可信度大于95%），而阳性结果可能与临床过敏反应相关。值得一提的是，使用新鲜食物进行该实验的结果可信度一般超过90%，甚至可以达到100%，高于使用市售提取物进行该实验的结果可信度[18]。IDST不如SPT应用广泛，主要是由于IDST对受试者存在较大的安全隐患[19]。Peters等[20]研究发现，SPT的临界值受样品、统计方法、实验设备、过敏原等因素的影响。因此，不能推广到其他临床情况，但使用标准化的SPT能够克服这些局限。STP的标准化包括改善患者的健康状况和护理条件，减少导致结果可变的因素，从而使结果有可比性[21]。Mehl等[22]对牛乳和鸡蛋过敏患者研究表明，SPT与血清IgE的结果一致性很低。因此，这两种方法不能替换使用，对于SPT或血清学检测呈阴性结果的受试者，应该使用其中另一种方法验证。SPT受试者皮肤上的风团大小，能够反映过敏原的致敏性强弱，风团数量多、直径大则致敏性强，反之则致敏性弱。
1.3 动物模型
该法的目标是提供一个模型，在与其他相关数据联用时可以提供有用且可靠的信息，来帮助做出合理的评价[23]。但目前还没有一种动物能够满足理想动物模型的所有要求[3]。常用的动物模型有鼠、狗和猪，在选择时需要明确操作特点、局限性和不同环境下的可靠性。常用的鼠的品种有BALB/c近交系小鼠和棕色挪威鼠。鼠模型的优点是体积小、繁殖周期短，与人的免疫机制很相似，有丰富的相关免疫学信息；其缺点是过敏反应复杂，很难找到可靠的反应标志物来反映蛋白的潜在致敏性[24]。因此需要检测相关的血清学指标。Gizzarelli等[25]通过给BALB/c小鼠口服转基因大豆提取物，检测小鼠体内细胞因子和IgE的变化，证明BALB/c小鼠在食物过敏原评估中能够提供一些有价值的信息，但是BALB/c小鼠血液量少，不便于大规模的分析。棕色挪威鼠通过口服免疫可以产生很高的IgE水平，但是容易受环境、年龄以及亚临床感染的影响，甚至可能产生口服耐受。以狗和猪建立动物模型不太常见，主要局限原因是体积较大，饲养不便且管理费用昂贵[26]。狗实验模型优点是内脏的解剖生理学和营养学求与人类相似，可以做胃肠道的内镜分析，IgE的反应水平高，血液量多方便分析。猪的生理特征可以模拟新生婴儿，因此猪实验模型主要用于研究黏膜的免疫力，是一种有发展前景的动物模型[27]。
动物模型模拟人体的过敏反应，根据动物体内的特异性抗体和细胞因子的变化情况或过敏反应临床症状的强弱，来评价食物过敏原的致敏性强弱。Stagg等[28]在第51届毒理学协会年会上报告，已经有证据表明动物实验的结果与人体的免疫反应不一致，并且在动物中也只是局部反应。尽管如此，动物模型在评价食物过敏原的致敏性方面，仍有很大的参考价值。
2 体外法
利用体外检测方法来评价食物过敏原的潜在致敏性，比体内实验检测更安全可行。在目前的研究和实践中，体外检测方法主要从血清学和细胞学的角度来评价食物过敏原的潜在致敏性。
2.1 血清学方法
过敏患者的血清中含有能与过敏原特异性结合的IgE抗体，可以根据被检蛋白与人血清中IgE的结合能力评价该蛋白的潜在致敏性。为了克 服对人血清的依赖，一些依赖鼠、兔子等动物的抗血清的免疫分析方法逐渐发展起来。目前常用的血清学方法主 要包括放射过敏原吸附抑制实验 (radio-allergosorbe nt test inhibition，RAST抑制实验)、酶标记过敏原吸附抑制实验(enzyme allergosorbent test inhibition，EAST抑制实验)、免疫印迹法（immunoblotting）和酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。
2.1.1 RAST和EAST抑制实验
RAST和EAST是目前国际上研究过敏反应使用较广泛的方法，其灵敏度和准确性高，同时解决了不同食物过敏原间交叉反应的问题。因此，它们是评价过敏原总致敏性的关键技术。但由于RAST和EAST抑制实验严重依赖人血清，而血清难以保证一致， RAST与EAST难以标准化；而且RAST实验过程中的放射性危害严重，有损工作人员的健康。因此，在2001年修订的FAO/WHO推荐的检测食物过敏原的方法中，并没有推荐上述两种方法。目前，国外大医院和主要过敏原生产企业基本都使用原法玛西亚公司开发的UniCAP系统进行RAST抑制实验，该系统还可以进行荧光酶联免疫分析。
2.1.2 免疫印迹法（immunoblotting）
免疫印迹法是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术，此法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，但是操作复杂费时，常与ELISA联用检测过敏食物的致敏性。
2.1.3 酶联免疫吸附实验（ELISA）
ELISA是20世纪90年代末期发展起来的一门新技术，该法灵敏度高、特异性好且操作方便。但ELISA仅能确定抗原与抗体特异性结合，并不能判定食物过敏原致敏性的强弱，还需要联合其他方法进一步检测才能确定食物过敏原的致敏性。根据操作不同，ELISA主要分为双抗体夹心法、间接法、捕获法和竞争法，其中应用最广泛的是双抗夹心ELISA和竞争ELISA。ELISA不仅可以进行定性分析，还可进行定量分析。Patrick等[29]使用间接ELISA定量检测了白酒中的酪蛋白，并通过免疫印迹法进行了验证。近年来，ELISA技术发展较快，其灵敏度和特异性都有所提高。竞争ELISA也可用于定量检测食物过敏原。Ma Xi等[30]使用单抗进行竞争ELISA，能够很灵敏地检测出大豆球蛋白，检测限为0.3 ng/mL，IC50值为1.7 ng/mL，线性范围为0.3～11.2 ng/mL。ELISA反应中，IC50值越小，食物过敏原的致敏性越强，反之越弱。同时检测多种食物过敏原时，可能发生交叉反应从而影响结果的准确性，但是，夹心ELISA可以克服食物过敏原间的交叉反应。如，Redl等[31]使用夹心ELISA检测食物中的芝麻过敏原时发现，芝麻过敏原不与其他19种过敏食物发生交叉反应。另外，Ecker等[32]使用夹心ELISA检测食物中的羽扇豆过敏原，也得到类似的结论。
2.2 细胞学方法
食物过敏反应中，免疫细胞会发生一系列的变化，其中包括细胞因子的释放和T细胞增殖等，可以通过检测免疫 细胞的一系列变化来评价食物过敏原的致敏性。一般而言，细胞因子释放量越多，T细胞增殖剧烈，食物过敏原的致敏性越强，反之致敏性较弱。
2.2.1 组胺释放实验(histamine releasing test，HRT)
IgE介导的过敏反应会引起体内组胺的大量释放，组胺的释放量可以用荧光RAST测定。但是由于组胺测定必须在抽血后一天之内完成，并且过敏患者的血清来源不足，以及该实验易受环境和操作条件的影响，该法在实际应用中受到很大限制。
Church等[33]研究发现，肥大细胞的组胺释放实验受细胞分散方式的影响，酶促分散的细胞释放的组胺量多于机械力分散的细胞的组胺释放量。鼠RBL-2H3细胞株是常用于肥大细胞介质释放实验的模型[34]，研究表明RBL-2H3细胞株进行细胞介质释放实验，结果与人的嗜碱性粒细胞结果吻合，使用该细胞株可以减少患者反复抽血的痛苦，也更便于开展研究[35]。
2.2.2 嗜碱性粒细胞活性测试与脱颗粒实验
嗜碱性粒细胞的活性和脱颗粒的量与过敏原的致敏性密切相关，过敏原的致敏性越强，则嗜碱性粒细胞的活性越强，脱颗粒的量越大。CD63与CD203c常被用作过敏原与IgE交联引发嗜碱性细胞激活的标记，研究表明，通过试剂盒检测CD63与CD203c可以有效诊断儿童鸡蛋过敏和牛乳过敏[36-37]。de Weck等[38]认为，嗜碱性粒细胞的活性测试能够可靠地用于诊断过敏患者。使用嗜碱性粒细胞活性测试技术检测食物过敏原特异性好、灵敏度高，而且对接受抗组胺药物治疗的患者的检测结果仍然可靠[39]，是传统定量测定IgE水平和皮肤实验的补充。目前的挑战是如何将该法进行标准化，使其成为检测食物过敏原致敏性的主流方法[40]，并应用于食物过敏原致敏性评价中。
2.2.3 T细胞反应分析
IgE介导的食物过敏反应的一个重要阶段是T细胞增殖和细胞因子（IL-10、IL-13、IFN-γ和TNF-α）的产生。过敏患者的外周血单核细胞中含有少量的特异性T细胞，可用作T细胞克隆的来源，通过测定T细胞的增殖情况及细胞因子释放的情况，可以研究蛋白的潜在致敏性的强弱及确认T细胞的表位。Flinterman等[41]研究表明，T细胞受花生提取物刺激时会产生Th1和Th2两类细胞因子，但是再次受到花生过敏原刺激时，过敏个体仅会加强Th2应答。因此，T细胞的反应情况可用于评价食物过敏原的致敏性。该法与动物实验联用可以解释决定蛋白致敏性的结构，但是T细胞反应分析操作困难、耗时，研究中较少使用。
2.3 其他体外评价技术
2.3.1 消化稳定性
消化稳定性是指蛋白质在人体或模拟人体的胃肠消化体系中的降解程度。许多重要的食物过敏原对胃蛋白酶的消化稳定较好。虽然胃蛋白酶消化的预测价值存在争论，但是有研究表明，标准化的条件（pH 1.2或pH 2.0），通过固定胃蛋白酶的活性比例来检测蛋白可以较准确地评估蛋白的致敏性，部分高度稳定的蛋白不会引起食物过敏[42]。因此，一般情况下可以认为，过敏原的消化稳定性越好，其致敏性越强，反之致敏性越弱。
2.3.2 生物传感器
生物传感器是近十几年兴起的一 种检测食物过敏原的新技术。生物传感器将传统的免疫测试结果通过传感器转换为可选择的半定量和定量信息，还能实时监测到表面的抗原抗体反应，根据过敏原与特异性抗体反应的程度，可以评价食物过敏原的致敏性强弱。生物传感器技术具有方便、省时、精度高、便于计算机收集和处理数据等优点，又不会或很少损伤样品和造成污染，易于推广普及[43]。但是，生物传感器检测食物过敏原时，食物中的基质可能使检测结果呈假阳性。因此，还需要进一步的研究以解决此难题[44]。近些年，随着材料科学、微电子学和光电子学的快速发展，生物传感器也得到了较好发展。单抗、RNA、DNA和纳米材料在生物传感器中的应用，提高了生物传感器的灵敏度和特异性[45]。目前，市场上已有可检测牛奶、鸡蛋、花生、榛子、芝麻和贝类中过敏原的生物传感器[46]。Pollet等[47]使用纳米磁珠增强光纤等离子共振体生物传感器的信号，并以Ara h 1为实例进行检测验证，结果显示其动态线性范围为0.1～2 μg/mL，比ELISA的灵敏度更高、动态线性范围更广。
3 生物信息学比对法
食物过敏性安全评估越来越多地使用生物信息学工具来评价未知蛋白的致敏性。生物信息学比对法一般用于转基因食物中过敏原的致敏性评价。生物信息学方法不是预测分析，它不能判断一种蛋白是否会成为过敏原，但可以判断该蛋白是否是与已知过敏原或者是否能与已知过敏原发生交叉反应[48]。蛋白质中氨基酸序列的同源性包括线性序列和构象序列的同源性[49]。常用的致敏性蛋白数据库主要是Allergen Online，其他可用的数据库大多不如该数据库更新频繁或者没有列出明确的筛选条件[42]。当待查询的序列信息在数据库中无相关数据时，该法的使用就受到了限制。此法常用的比对程序为FAST与BLAST。一个蛋白与已知过敏原总体序列有大于70%的相似度可发生交叉反应，低于50%则不会发生IgE交叉反应[42]，且在软件中使用80个氨基酸滑动窗口检测时，有35%的序列相同或者至少有6个连续的氨基酸相同，则认为该蛋白有相似的致敏性[3]。当生物信息学检测结果的相似性超过上述标准时，并不能证明该蛋白一定具有潜在的致敏性，还需要更严格的血清学方法或其他方法的验证[48]。在检测可能的IgE表位（如短的连续氨基酸序列）时，容易产生假阳性结果。因此，不推荐该项检测作为常规检测项目[48,50]。
此外，“基于调整的过滤长度检测过敏原多肽（DFLAP）”是近几年发展起来的评估蛋白致敏性的新算法。DFLAP评估蛋白的致敏性的灵敏度高，特异性好，EVALLER为基于此算法的网络服务器[51]。Zou Zehong等[52]用EVALLER分析鉴定出5种过敏原基因。Goodman等[53]使用生物信息学方法与胃蛋白酶消化相结合的方法，研究牛乳碱性蛋白(MBP)，结果显示MBP中的蛋白几乎不会增加牛乳过敏症患者的过敏风险或与其他过敏原交叉反应的几率。通过生物信息学方法预测后，仍需要进一步用血清学或细胞学的方法检测目标蛋白是否能够结合特异性IgE，从而评价其致敏性。
4 结 语
目前还没有关于食物过敏原致敏性强弱评价的标准。如果制定了标准化的评价流程，利用现有的技术，可以用于评价食物过敏原致敏性强弱。不同评价技术各有其优缺点，通常需要同时使用多种方法才能有效评价一种过敏原的致敏性。DBPCFC和SPT能很直观地反映食物过敏原的致敏性强弱，但是会给受试者带来痛苦，而且容易产生假阳性结果。因此，需要进一步研究以将这两种方法标准化，并在实验过程中严格控制被试者的饮食。动物模型能够提供极具参考价值的信息，但是动物实验的结果是否与人体过敏反应一致还有待研究。因此需要建立一种与人体过敏反应极为相似的动物模型。血清学方法安全可行，但是检测结果不够直观，仅能反映免疫球蛋白与过敏原的结合能力，并不能真实反映过敏原的致敏性，需要结合其他方法进一步分析。细胞学方法结果可靠，但是分析操作复杂、耗时，有待于标准化使其成为检测过敏原致敏性强弱的主流方法。生物传感器技术灵敏度高特异性好，但是实际推广应用还有待时日。生物信息学方法多用于转基因食物的致敏性分析，对过敏原数据库的依赖较大，需要建立实时更新的过敏原数据库。近年来发展起来的检测过敏原的新技术，如过敏原芯片技术、实时定量PCR技术等，能用于检测食物过敏原的存在性，但不能评价过敏原的致敏性强弱，要将这些技术应用于食物过敏原的致敏性评价，还需要进一步的研究和完善。综上所述，还需要更进一步地研究，以建立快速、高效、精准的食物过敏原致敏性的评估方法。
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