申婷婷，马 娜,2，黄 杰,2，花尔并，薛文琛，王 浩*
（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）
山楂对果蝇抗氧化相关调控基因表达的影响
申婷婷1，马 娜1,2，黄 杰1,2，花尔并1，薛文琛1，王 浩2,*
（1.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）
以果蝇为动物模型，研究给予不同剂量山楂提取物（0、0.8、4 mg/mL）对果蝇寿命、抗氧化酶活力及抗氧化相关调控基因表达的影响。结果表明：添加山楂提取物可以延长果蝇寿命；体内抗氧化 酶活力测定结果显示，添加0.8 mg/mL山楂提取物可以显着升高铜锌超氧化物歧化酶（CuZn-superoxide dismutase，CuZn-SOD）酶活力（P＜0.05），给予4 mg/mL山楂提取物可以极显着升高CuZn-SOD酶活力（P＜0.01）和显着升高过氧化氢酶（catalase，CAT）酶活力（P＜0.05），且降低丙二醛（malondialdehy de，MDA）水平。实时定量PCR（real timepolymerase chain reaction，real time-PCR），结果显示，给予4 mg/mL山楂提取物显着上调CuZn-SOD、CAT mRNA表达水平（P＜0.05）；给予0.8 mg/mL山楂提取物磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase，PHGSH-Px） mRNA表达水平显着升高（P＜0.05），4 mg/mL组表达水平极显着升高（P＜0.01）。综上，山楂在机体内抗氧化活性可能是通过上调内源性抗氧化酶来实现的。
果蝇；山楂提取物；寿命；酶活力；基因表达
山楂是一种传统的药食同源植物，富含黄酮类、花青素、熊果酸、皂苷和胡萝卜素等多种活性成分[1]。毒理学研究证明长期食用山楂有益身体健康，且几乎无副作用[2]。药理学研究亦显示，山楂活性成分具有增加血液抗氧化活性及降低低密度脂蛋白胆固醇的作用[3-5]。
果蝇作为比较成熟的抗衰老模式动物，与人类衰老基因高度相似[6-7]。本实验以果蝇为动物模型，研究山楂提取物对果蝇寿命、果蝇体内抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性和氧化产物丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量的影响。并从分子水平研究山楂对抗氧化相关调控基因SOD、CAT、磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase，PHGSH-Px）及Regulatory particle non-ATPase 11（Rpn11）mRNA表达水平的影响，为山楂提取物在食品中的应用提供基础研究。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
山楂果提取物购自尖峰天然产物公司。具体提取工艺为山楂鲜果洗净、切片、去核，冷冻干燥，80%乙醇提取，经乙酸乙酯萃取，树脂（AB-8）纯化后冻干成粉。
超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒 南京建成生物工程研究所；Trizol试剂、cDNA合成试剂盒、SYBR Green 日本TaKaRa公司。
1.2 仪器与设备
LC-20 高效液相色谱仪 日本岛津公司；冷冻离心机 美国Thermo公司；My Cycler反转录PCR、MyiQ2实时定量PCR仪 美国Bio-Rad公司。
1.3 方法
1.3.1 高效液相色谱分析山楂提取物活性成分
色谱条件[8]：色谱柱：H y p e r s i l O D S-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：5%乙腈（25 μmol/L NaH2PO4），流动相B：25%乙腈（25 mmol/L NaH2PO4）；梯度洗脱：0 min 10% B、20 min 80% B、55 min 80% B、60 min 10% B；流速1.0 mL/min；检测波长：280 nm和360 nm；进样量：20 μL；柱温：30 ℃。
1.3.2 果蝇寿命实验
收集2 d龄的果蝇成虫，取雄性果 蝇600 只，随机分为3 组（对照组（0 mg/mL），不同剂量山楂提取物组：0.8 mg/mL和4 mg/mL），每组10 管，每管20 只，在25 ℃、相对湿度50%的恒温恒湿培养箱中培养。实验过程中，每3 d更换新鲜培养基，进行寿命统计，直至果蝇全部死亡，并重复实验。果蝇基础培养基[9]为：酵母10 g、蒸馏水750 mL、琼脂6 g、葡萄糖72 g、玉米面72 g、防腐剂40 mL（1 g/100 mL对羟基苯甲酸乙酯）；山楂实验组分别在基础培养基中添加0.8 mg/mL和4 mg/mL山楂果提取物。
1.3.3 果蝇抗氧化酶活力测定
收集2 d龄雄性果蝇成虫600 只，随机分为3 组（对照组，0.8 mg/mL、4 mg/mL山楂果提物组）每组10 管，每管20 只。饲养30 d后，CO2麻醉后－80 ℃备用。取果蝇，按1∶49（m/V）加生理盐水，冰上匀浆，4 ℃、2 500 r/min 离心20 min，取上清测酶活力。
1.3.4 Real time-PCR分析抗氧化基因mRNA表达
取－80 ℃保存的果蝇，每组5管每管20 只，Trizol法提取mRNA，反转录得cDNA，－80 ℃备用。Real time-PCR法检测抗氧化相关基因mRNA表达水平。基因引物信息具体见表1。
表1 果蝇抗氧化基因实时定量PCR引物Table 1 Real-time PCR primers used to determine mRNA expression of Drosophila melanogaster antioxidant genes
2 结果与分析
2.1 山楂中活性成分分析
图1 山楂提取物HPLC分析结果Fig.1 HPLC analysis of hawthorn fruit ext ract
由图1液相色谱分析显示山楂提取物中含有原花青素B219.86%，表儿茶素15.27%，绿原酸3.10%，金丝桃苷2.91%，异槲皮素1.34%。
2.2 山楂提取物对果蝇寿命的影响
图2 不同剂量山楂果提取物对果蝇寿命的影响Fig.2 Effect of consumption of hawthorn fruit extract at various doses on Drosophila melanogaster life span
氧化应激导致损伤是衰老的重要原因之一。果蝇寿命是评价抗氧化 和抗衰老效果的重要指标，由图2可知，山楂提取物可以延长果蝇寿命，且效果与山楂果提取物添加量呈正相关。
2.3 山楂提取物对果蝇体内Mn-SOD、CuZn-SOD、CAT酶活性及氧化产物MDA含量的影响
图3 山楂提取物对果蝇体内CuZn-SOD、Mn-SOD、CAT酶活性和MDA生成量的影响Fig.3 Effect of hawthorn fruit extract on CuZn-SOD, Mn-SOD and CAT activities, and MDA level in Drosophila melanogaster
由图3可知，给予果蝇山楂提取物30 d后，0.8 mg/mL组果蝇体内CuZn-SOD酶活性显着升高（P＜0.05），4 mg/mL组CuZn-SOD酶活力极显着升高（P＜0.01）；添加山楂提取物对果蝇体内Mn-SOD酶活性无显着影响（P＞0.05）。4 mg/mL山楂提取物可以显着升高果蝇体内CAT酶活性（P＜0.05）。果蝇体内MDA水平随山楂提取物添加量增加呈逐渐降低的趋势。
2.4 Real time-PCR检测抗氧化基因CuZn-SOD、Mn-SOD、CAT、PHGSH-Px、Rpn11 mRNA表达水平
图4 山楂提取物对果蝇体内抗氧化基因CuZn-SOD、Mn-SOD、CAT、PHGSH-Px、Rpn11 mRNA表达水平的影响Fig.4 Effect of hawthorn fruit extract on mRNA expression of CuZn-SOD, Mn-SOD, CAT, PHGSH-Px and Rpn11 in Drosophila melanogaster
由图4可知，果蝇在摄食山楂果提取物后，与对照组相比4 mg/mL组CuZn-SOD、CAT mRNA表达水平显着升高（P＜0.05）；山楂提取物对Mn-SOD基因mRNA表达水平无显着影响（P＞0.05）。Rpn11过表达可以抑制与衰老相关的26S蛋白酶体活性，从而延长果蝇寿命[9]。实验结果显示Rpn11表达水平呈上升趋势，这与Cheng Peng等[10]报道的蓝莓提取物延长果蝇寿命结果中Rpn11表达水平上调一致。PHGSH-Px可抑制膜磷脂过氧化，给予0.8 mg/mL山楂果提取物，果蝇体内磷脂谷胱甘肽过氧化物酶mRNA表达水平显着升高（P＜0.05），4 mg/mL组表达水平极显着升高（P＜0.01）。
3 讨 论
衰老自由基理论认为，在有氧环境中生存的生物产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）是不可避免的，机体存在自由基清除体系。在生物体内，抗氧化物质及内源性抗氧化酶可以清除体内自由基维持内环境动态平衡，其中SOD能催化O2－·转化为H2O2，CAT和GSH-Px等能将H2O2转化成H2O。但是，过多的自由基（OH－、O2－·、H2O2）超出了机体清除能力，就会攻击细胞内的蛋白质、脂质及DNA等，最终导致氧化损伤[11-14]。MDA是自由基作用于脂质发生过氧化反应后的终产物，会引起蛋白质、核酸等大分子交联聚合，具有细胞毒性。目前虽然氧化损伤与衰老（寿命）的关系还尚未明确，但是多数研究显示不同物种组织中氧化物的过多积累会导致衰老[15-16]。
山楂作为传统的药食同源植物，富含黄酮类等天然抗氧化物。有研究表明山楂提取物能清除超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢，且无论是在体内还是体外都具有较高的抗氧化活性[17-19]，Wang Hao等[8]研究证明山楂提取物对SAM模型鼠Cu2+介导LDL氧化损伤具有保护作用。
果蝇作为典型的抗氧化、抗衰老动物模型，结果显示给予山楂提取物能够延长果蝇寿命；酶活力测定结果显示果蝇体内CuZn-SOD、CAT、PHGSH-Px酶活性显着升高，MDA含量降低，这与Shanthi等[20]报道的摄食山楂可以阻止抗氧化物如谷胱甘肽、VE水平下降，并保持肝、主动脉和心脏抗氧化酶的活性等结果相一致。Real time-PCR结果显示SOD、CAT、Rpn11、PHGSH-Px等抗氧化基因表达水平上调。因此，山楂提取物体内抗氧化活性很可能是通过上调内源性抗氧化酶的基因表达实现的。
[1] SALEHI S, LONG S R, PROTEAU P J, et al. Hawthorn (Crataegus monogyna Jacq.) extract exhibits atropine-sensitive activity in a cultured cardiomyocyte assay[J]. Journal of Natural Medicines, 2009, 63(1): 1-8.
[2] ZHANG Z S, CHANG Q, ZHU M, et al. Characterization of antioxidants present in hawthorn fruits[J]. Nutrition Biochemistry, 2001, 12: 144-152.
[3] ZHANG Z S, WALTER K H, HUANG Y, et al. Hawthorn fruits is hypolipidemic in rabbits fed a high cholesterol diet[J]. Nutrition, 2002, 132: 5-10.
[4] KIRAKOSYAN A, SEYMOUR E, KAUFMAN P B, et al. Antioxidant capacity of polyphenolic extracts from leaves of Crataegus laevigata and Crataegus monogyna (Hawthorn) subjected to drought and cold stress[J]. Agriculturl and Food Chemistry, 2003, 51: 3973-3976.
[5] BAHORUN T, AUMJAUD E, RAMPHUL H, et al. Phenolic constituents and antioxidant capacities of Crataegus monogyna (Hawthorn) callus extracts[J]. Molecular Nutrition, 2003, 47: 191-198.
[6] HELFAND S L, ROGINA B. Genetics of aging in the fruit fly, Drosophila melanogaster[J]. Annual Review of Genomics and Human Genetic, 2003, 37: 329-348.
[7] JI L L. Antioxidant enzyme response to exercise and aging[J]. Medicine and Science in Sports and Exercise, 1993, 25(2): 225-231.
[8] WANG Hao, ZHANG Z S, ZUO Y B, et al. Hawthorn fruit increases the antioxidant capacity and reduces lipid peroxidation in senescenceaccelerated mice[J]. European Food Research Technology, 2011, 232: 743-751.
[9] TONOKI A, KURANAGA E, TOMIOKA T, et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process[J]. Molecular Cell Biology, 2009, 29: 1095-1106.
[10] CHENG Peng, ZUO Yuanyuan, CHEN Zhenyu, et al. Blueberry extract prolongs lifespan of Drosophila melanogaster[J]. Experimental Gerontology, 2012, 47: 170-178.
[11] PALACINO J J, SAGI D, GOLDBERG M S, et al. Mitochondrial dysfunction and oxidative damage in parkin-deficient mice[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279: 18614-18622.
[12] REVERTER-BRANCHAT G, CABISCOL E, TAMARIT J, et al. Oxidative damage to specifi c proteins in replicative and chronologicalaged Saccharomyces cerevisiae[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279: 31983-31989.
[13] MINOTTI G. Metals and membrane lipid damage by oxyradicals[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 1988, 551: 34-44.
[14] L EE W J, OU H C, WU C M, et al. Sesamin mitigates inflammation and oxidative stress in endothelial cells exposed to oxidazed lowdensity lipoprotein[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57: 11406-11417.
[15] KONO Y, FRIDOVICH I. Superoxide radical inhibits catalase[J]. Journal of Biological Chemistry, 1982, 257: 5751-5754.
[16] STADTMAN E R. Protein oxidation in aging and age-related diseases[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2001, 928: 22-38.
[17] BAHORUN T, TROTIN F, POMMERY J, et al. Antioxidant activities of Crataegus monogyna extracts[J]. Planta Medicine, 1994, 60: 323-328.
[18] BAHORUN T, GRESSIER B, TROTIN F, et al. Oxygen species scavenging activity of phenolic extracts from hawthorn fresh plant organs and pharmaceutical preparations[J]. Arzneim-Forsch, 1996, 46: 1086-1089.
[19] 李刚, 梁新红, 葛晓红. 山楂化学成分及其保健功能特性[J]. 江苏调味副食品, 2009, 26(6): 25-27.
[20] SHANTHI R, PARASAKTHY K, DEEPALAKSHIMI P D, et al. Hypolipidemic activity of tincture of Crataegus in rats[J]. Indian Journal of Biochemistry & Biophysics, 1994, 31: 143-146.
Effect of Hawthorn on the Expression of Antioxidant Defense-Related Genes in Drosophila melanogaster
SHEN Ting-ting1, MA Na1,2, HUANG Jie1,2, HUA Er-bing1, XUE Wen-chen1, WANG Hao2,*
(1. College of Biological Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2. College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)
Hawthorn fruits contain flavonoids, which can play roles in antioxidant capacity. The present research was focused on the effect of dietary supplementation of a hawthorn fruit extract rich in flavonoids at various doses (0, 0.8 and 4 mg/mL) on Drosophila melanogaster life span, antioxidant enzymes activities and related gene expression. The results showed that the life span of Drosophila melanogaster could be prolonged by consumption of the hawthorn fruit extract. Moreover, CuZn-SOD ac tivity was increased significantly (0.8 mg/m L, P ＜ 0.05 and 4 mg/mL, P ＜ 0.01); CAT activity was enhanced significantly at the dose of 4 mg/mL (P ＜ 0.05) while the content of MDA was decreased. Real time-PCR showed that the mRNA expression of CuZn-SOD, CAT (4 mg/mL, P ＜ 0.05), and PHGSH-Px (0.8 mg/mL, P ＜ 0.05; 4 mg/mL, P ＜ 0.01) were increased. Taken together, the hawthorn fruit extract can exert antioxidant activity in vivo via up-regulation of endogenous antioxidant enzymes.
Drosophila melanogaster; hawthorn fruit extract; lifespan; enzyme activity; gene expression
TS201.4
A
1002-6630（2014）13-0199-04
10.7506/spkx1002-6630-201413038
2013-07-01
国家自然科学基金青年科学基金项目（31201322）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD33B05）；天津市高等学校科技发展基金计划项目（20100609）
申婷婷（1988—），女，硕士研究生，主要从事食品营养学研究。E-mail：shenting890101@163.com
*通信作者：王浩（1979—），男，副教授，博士，主要从事食品营养学研究。E-mail：wanghao@tust.edu.cn
