张 玉，李洪军，窦华亭，贺稚非
（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715；3.西南大学柑桔研究所，重庆 400712）
川皮苷体外抗氧化活性及对肿瘤细胞生长抑制作用
张 玉1,2，李洪军1,*，窦华亭3，贺稚非1
（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715；3.西南大学柑桔研究所，重庆 400712）
目的：研究川皮苷的抗氧化活性及对肿瘤细胞生长抑制作用。方法：在体外测定川皮苷对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羟自由基（·OH）和超氧阴离子自由基的清除能力；通过四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法筛选对川皮苷作用敏感的肿瘤细胞株，并用倒置显微镜和透射电镜观察敏感细胞株在川皮苷作用之后细胞结构的变化。结果：川皮苷在体外对DPPH自由基、·OH和O2－·都具有清除能力，其中对·OH的清除能力突出。同时，人胰腺癌细胞株PANC-1对川皮苷作用敏感，即川皮苷可抑制PANC-1细胞的生长；透射电镜观察发现川皮苷可使PANC-1细胞的细胞核膜破裂，胞质溶出，形成凋亡小体。结论：川皮苷具有显着的体外抗氧化活性，并且可以抑制PANC-1细胞的增殖，在功能食品等领域具有良好的应用前景。
川皮苷；抗氧化；细胞增殖
自由基是人体进行生命活动时所产生的一种活性分子，可以调节细胞间的信号传导和细胞生长[1-3]。但自由基的过度氧化会引起蛋白质、核酸等生命物质的损坏，对机体造成损伤，细胞癌变的过程中就有自由基的参与[4-10]。因此，清除机体内过多的自由基对癌症的发生和发展有着至关重要的作用[11-15]。川皮苷（nobiletin，NOB）是柑橘属植物中的特征黄酮，是一种多甲氧基黄酮类化合物[16-23]。有研究表明，多甲氧基黄酮中甲氧基的数量和取代基位置决定了其抗氧化能力的强弱，其中NOB是具有强抗氧化活性的多甲氧基黄酮[11]。
本实验以NOB为材料，比较不同浓度的NOB对不同种类自由基的清除能力，并采用VC作为对照来考察NOB抗氧化能力的强弱。同时通过研究NOB对人乳腺癌细胞株MCF-7、人肺癌细胞株A549、人胰腺癌细胞株PANC-1生长活力的影响，筛选对NOB敏感的细胞株。通过NOB与敏感细胞株的时-效、量-效关系确定最适培养时间和最适NOB添加量，并将NOB作用于敏感细胞株，对细胞形态、抑制效果等指标进行考察，探讨NOB对敏感细胞株的生长抑制作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
川皮苷（NOB）从甜橙皮渣中分离得到（甜橙皮渣由重庆市三峡果业有限公司提供），精制后经高效液相色谱检测纯度为98%；MCF-7、A549、PANC-1细胞株上海中科院细胞库。
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、VC、四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、RPMI-1640培养基、MEM培养基 美国Gibco公司；胎牛血清 天津TBD公司；双抗（青霉素、链霉素）、胰酶 北京赛驰生物公司；其他常规试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DFM-20C荧光倒置显微镜 日本Olympus公司；TECNAI-10透射电子显微镜 荷兰Philips公司；DG3022酶标仪 美国Bio-Tek公司；TU-1901双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；UV-7504紫外分光光度计 上海欣茂有限公司。
1.3 方法
1.3.1 川皮苷体外抗氧化能力的测定
1.3.1.1 DPPH自由基清除能力的测定
将2 mL浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmol/L的NOB溶液（以VC溶液作为阳性对照）与2 mL 2×10−4mol/L DPPH溶液混合后摇匀，避光放置30 min，测定吸光度A1；对照组以无水乙醇替代样品，其他操作相同，测定吸光度A0；空白组为2 mL样品与2 mL无水乙醇（替代DPPH溶液）混合，其他操作相同，测定吸光度A2。按照公式（1）计算不同浓度的NOB溶液和VC溶液对DPPH自由基的清除率。
1.3.1.2 羟自由基（·OH）清除能力的测定
取0.75 mL 5 mmol/L的邻二氮菲无水乙醇溶液，加入2 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（0.75 mol/L，pH 7.4），混合均匀后，加入0.5 mL 7.5 mmol/L FeSO4溶液和2.5 mL浓度分别为0.125、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 μmol/L NOB溶液（以VC溶液作为阳性对照），混合均匀，再加入0.5 mL体积分数1%的H2O2，于37 ℃水浴60 min，在536 nm波长处测定吸光度AS。对照组以2.5 mL蒸馏水代替样品，其他操作相同，测定吸光度AP。空白组以2.5 mL蒸馏水代替样品，0.5 mL蒸馏水代替0.5 mL H2O2，其他操作相同，测定吸光度AB。按照公式（2）计算不同浓度的NOB溶液和VC溶液对·OH的清除率。
1.3.1.3 超氧阴离子自由基（O2－·）清除能力的测定
在试管中加入5 mL Tris-HCl（0.05 mol/L，pH 8.2）缓冲溶液，再缓慢加入1 mL浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmol/L NOB溶液（以VC溶液作为阳性对照），混合均匀后置于25 ℃条件下放置20 min。然后加入0.2 mL 2 mmol/L邻苯三酚溶液，混合均匀，反应4 min后，置于325 nm波长处测定其吸光度A1。空白组以1 mL蒸馏水代替样品溶液，其他操作相同，测定吸光度A0。按照公式（3）计算不同浓度的NOB溶液和VC溶液对O2－·的清除率。
1.3.2 细胞培养
MCF-7细胞：含10%（体积分数，下同）胎牛血清的MEM培养基，添加1%双抗；A549细胞：含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，添加1%双抗；PANC-1细胞：含10%胎牛血清的RPMI-1640培基，添加1%双抗。3 种细胞株同时置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，在倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，确定稀释倍数，用PBS反复清洗，以0.25%胰酶消化，进行传代培养。
1.3.3 细胞生长活力测定
细胞生长活力测定方法参照文献[24]。取对数生长期的细胞，以103～105个/孔接种于96 孔板。置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞生长达到60%～70%，加入NOB终浓度分别0、2.5、5、10、20、40、60 μmol/L的新培养基，分别培养至24、48 h后，每孔加MTT溶液20 μL；继续孵育4 h，每孔加二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL，将96 孔板在脱色摇床上振荡10 min，测定490 nm波长处的吸光度，按照公式（4）计算细胞活力。以NOB浓度为横坐标，细胞活力为纵坐标作图，筛选敏感细胞株。
式中：A0为空白孔（只加培养基）吸光度；A1为正常孔（正常细胞，不加药物处理）吸光度；A2为加药组吸光度。
1.3.4 透射电镜下细胞形态观察
取对数生长期的PANC-1细胞，将细胞密度调整为1×105个/mL，接种到6 孔板，2 mL/孔。待细胞生长达到60%～70%，加入NOB终浓度为100 μmol/L的新培养基，继续培养48 h。然后用胰酶消化并收集细胞，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加PBS混匀，1 000 r/min离心10 min，弃去PBS，加1 mL质量分数2.5%的丙二醛，4 ℃条件下保存，待检。
1.4 数据统计分析
实验数据采用SPSS 16.0分析，实验结果用 ±s表示。
2 结果与分析
2.1 NOB的DPPH自由基清除能力
图1 NOB与VC对DPPH自由基的清除能力（n=3）Fig.1 Scavenging effects of NOB and VC on DPPH free radicals (n = 3)
如图1所示，NOB和VC都具有清除DPPH自由基的能力。在浓度≤1.60 mmol/L范围内，随着浓度的增加，NOB和VC两者对DPPH的清除能力都逐渐增强。当浓度高于0.8 mmol/L时，NOB对DPPH自由基的清除能力无显着性变化（P＞0.05）；同时VC对DPPH自由基的清除能力增强也不显着（P＞0.05）。总体看来，NOB对DPPH自由基清除能力强于VC。
2.2 NOB的·OH清除能力
图2 NOB和VC对·OH的清除能力（n=3）Fig.2 Scavenging effects of NOB and VC on hydroxyl free radicals (n = 3)
如图2所示，随着NOB浓度的增加，NOB对·OH的清除能力显着增强，当浓度低于0.750 μmol/L时，NOB 对·OH的清除能力呈线性增长趋势；而当NOB浓度高于1.250 μmol/L后，其对·OH的清除能力接近100%。而VC在本实验所选浓度范围内对·OH无清除能力。由此可见，在实验所选浓度范围内，NOB对·OH的清除效果更好。
图3 NOB和VCC 对OO－2·的清除能力（n==33）Fig.3 Scavenging effects of NOB and VC on superoxide anion radicals (n = 3)
如图3所示，在0.05～1.60 mmol/L浓度范围内，随着NOB浓度的增加，其对O2－·的清除能力逐渐增强，尤其是在0.05～0.80 mmol/L浓度范围内，其对O2－·的清除能力呈线性增长趋势。而在0.05～0.20 mmol/L浓度范围内，VC 对O2－·的清除能力为0；当浓度在0.80～1.60 mmol/L范围内时，VC对O2－·的清除能力略高于NOB。
2.4 对川皮苷敏感的肿瘤细胞筛选结果
图4 NOB对不同肿瘤细胞株的影响（n=6）Fig.4 Inhibitory effect of NOB on the growth of different tumor cells (n=6)
如图4所示，不同浓度的NOB作用于PANC-1、A549、MCF-7这3 种肿瘤细胞株后，会对细胞活力产生不同的影响。NOB作用PANC-1细胞24 h后，细胞活力下降至（71.22±6.80）%；继续培养至48 h时，PANC-1细胞活力变化较24 h时无显着变化（P＞0.05）。由此可见，NOB对PANC-1细胞的增殖有一定抑制作用。NOB作用于A549细胞24 h后，细胞活力下降至（82.35±7.50）%，继续培养至48 h时，在所选浓度范围内，A549细胞活力仍维持在90%左右，说明A549细胞对NOB不敏感。NOB作用于MCF-7细胞24 h后，细胞活力已经下降至（67.04±4.80）%，继续培养至48 h时，MCF-7细胞活力继续下降至（57.17±1.40）%。由此可见，MCF-7细胞对NOB非常敏感，细胞活力在低浓度条件下下降显着（P＜0.05），此结果与文献[8]报道一致。由于NOB对MCF-7细胞株的作用已有报道，且与本实验结果一致，故本实验不再对MCF-7做进一步的研究。
2.4 PANC-1细胞的形态变化
图5 NOB浓度和处理时间对PANC-1细胞形态的影响（20×）Fig.5 Morphology of PANC-1 cells treated with NOB (20 ×)
如图5所示，在倒置显微镜下观察经NOB处理的PANC-1细胞，对照组细胞呈近圆形，细胞间结构紧密，细胞生长旺盛（图5a）；而经NOB处理后，PANC-1细胞形状发生变化，呈现无规则状态，轮廓感增强，反差增大，细胞浮起，细胞间距离增大，细胞数量有所减少，并且随着NOB浓度的增加，其变化程度加剧（图5b～5d）。并且在NOB浓度相同（100 μmol/L）的条件下，随着培养时间的延长，PANC-1细胞形态变化明显，细胞拉长，细胞质分布不均匀，细胞间联系松散，大量细胞浮起，细胞数量也明显减少（图5e、5c、5f）。
图6 扫描电镜下NOB处理前后PANC-1细胞的形态Fig.6 Morphology of PANC-1 cells treated with NOB
如图6所示，通过透射电镜观察发现，对照组PANC-1细胞表面微绒毛丰富，使相邻细胞被微绒毛所连接；细胞质均匀，向四周伸展；细胞器区分明显，核膜、核仁清晰可见。而100 μmol/L NOB组PANC-1细胞表面微绒毛稀少；细胞间分离，轮廓感增强；细胞质减少，细胞器萎缩；核膜破裂，胞质溶出，逐渐形成凋亡小体。
3 讨 论
本研究将NOB和VC对不同自由基的清除能力作比较，以评价NOB对自由基清除作用的有无与强弱。实验结果表明，NOB对DPPH自由基、·OH和O2－·都有较强的清除能力，尤其是在实验所选浓度范围内，对·OH的清除能力比VC高数10 倍。同时，NOB对PANC-1和MCF-7两种细胞敏感，由于NOB对MCF-7细胞株的作用已另有文献[8]报道，且与本实验结果一致，故本实验不再对MCF-7做进一步的研究。因此本研究以PANC-1细胞作为研究对象，探讨NOB对其形态学的影响。结果显示，经不同浓度NOB处理后的PANC-1细胞均出现不同程度的变形、细胞分离、数量减少。通过透射电镜观察发现，用100 μmol/L的NOB处理48 h，PANC-1细胞形态变化明显，细胞微绒毛明显减少、细胞质分布不均匀，细胞呈现凋亡趋势。
[1] GHOSH K, RAY M, ADAK A, et al. Microbial, saccharifying and antioxidant properties of an Indian rice based fermented beverage[J]. Food Chemistry, 2014, 168: 196-202.
[2] VILLA-RODRIGUEZ J A, PALAFOX-CARLOS H, YAHIA E M, et al. Maintaining antioxidant potential of fresh fruits and vegetables after harvest[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2015, 55(6): 806-822.
[3] ZHAO Pan, DUAN Li, GUO Long, et al. Chemical and biological comparison of the fruit extracts of Citrus wilsonii Tanaka and Citrus medica L.[J]. Food Chemistry, 2015, 173: 54-60.
[4] LONDONO-LONDONO J, de LIMA V, LARA O, et al. Clean recovery of antioxidant flavonoids from citrus peel: optimizing anaqueous ultrasoundassisted extraction method[J]. Food Chemistry, 2010, 119: 81-87.
[5] LESGARDS J F, BALDOVINI N, VIDAL N, et al. Anticancer activities of essential oils constituents and synergy with conventional therapies: a review[J]. Transplantation Proceedings, 2014, 28: 1423-1446.
[6] PRADEEP P M, SREERAMA Y N. Impact of processing on the phenolic profi les of small millets: evaluation of their antioxidant and enzyme inhibitory properties associated with hyperglycemia[J]. Food Chemistry, 2014, 116: 455-463.
[7] MA Gaoxing, YANG Wenjian, MARRIGA A M, et al. Purifi cation, characterization and antitumor activity of polysaccharides from Pleurotus eryngii residue[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 114: 297-305.
[8] ANDROUTSOPOULOS V, SURICHAN S, ARROO R, et al. Citrus flavonoid nobiletin induces CVP1-enzyme activity and CYP1-mediated oxidative metabolism in MCF-7 breast adenocarcinoma cells[J]. International Journal of Molecular Medicine, 2010, 26: 52.
[9] MIYATA Y, SATO T, IMADA K, et al. A citrus polymethoxyflavonoid, nobiletin, is a novel MEK inhibitor that exhibits antitumor metastasis in human fi brosarcoma HT-1080 cells[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, 366: 168-173.
[10] HAGENLOCHER Y, BISCHOFF S C, LORENTZ A. Citrus fl avonoid nobiletin acts anti-infl ammatory on mast cells activated via different stimuli[J]. Allergy, 2014, 69: 206.
[11] LEE Y C, CHENG T H, LEE J S, et al. Nobiletin, a citrus fl avonoid, suppresses invasion and migration involving FAK/PI3K/Akt and small GTPase signals in human gastric adenocarcinoma AGS cells[J]. Molecular and Cellular Biochemistry, 2011, 347: 103-115.
[12] DING Chuan, KHAN M, ZHENG Bin, et al. Casticin induces apoptosis and mitotic arrest in pancreatic carcinoma PANC-1 cells[J]. African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2012, 6: 412-418.
[13] AKAO Y, OHGUCHI K, IINUMA M, et al. Interactive effects of polymethoxy fl avones from citrus on cell growth inhibition in human neuroblastoma SH-SY5Y cells[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 16: 2803-2810.
[14] SHEN J K, DU H P, YANG M, et al. Casticin induces leukemic cell death through apoptosis and mitotic catastrophe[J]. Annals of Hematology, 2009, 88: 743-752.
[15] QI Xiaoli, ZHANG Dianrui, XU Xia, et al. Oridonin nanosuspension was more effective than free oridonin on G2/M cell cycle arrest and apoptosis in the human pancreatic cancer PANC-1 cell line[J]. International Journal of Nanomedicine, 2012, 7: 1793-1804.
[16] ZHANG Yu, LI Hongjun, DOU Huating, et al. Optimization of nobiletin extraction assisted by microwave from orange byproduct using response surface methodology[J]. Food Science and Biotechnology, 2013, 22: 153-159.
[17] SHIMADA T, ENDO T, FUJII H, et al. Characterization of three linalool synthase genes from Citrus unshiu Marc. and analysis of linalool-mediated resistance against Xanthomonas citri subsp. citri and Penicilium italicum in citrus leaves and fruits[J]. Plant Science, 2014, 299: 154-166.
[18] KHOSHBAKHT D, GHORBANI A, BANINASAB B, et al. Effects of supplementary potassium nitrate on growth and gas-exchange characteristics of salt-stressed citrus seedlings[J]. Photosynthetica, 2014, 52(4): 589-596.
[19] HIASA S, IWAMOTO S, ENDO T, et al. Isolation of cellulose nanofibrils from mandarin (Citrus unshiu) peel waste[J]. Industrial Crops and Products, 2014, 62: 280-285.
[20] ARROO R R J, BERESFORD K, BHAMBRA A S, et al. Phytoestrogens as natural prodrugs in cancer prevention: towards a mechanistic model[J]. Phytochemistry Reviews, 2014, 13(4): 853-866.
[21] ZHANG Han, YANAGIHARA N, TOYOHIRA Y, et al. Stimulatory effect of nobiletin, a citrus polymethoxy flavone, on catecholamine synthesis through Ser(19) and Ser(40) phosphorylation of tyrosine hydroxylase in cultured bovine adrenal medullary cells[J]. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology, 2014, 387(1): 15-22.
[22] YANAGIHARA N, ZHANG Han, TOYOHIRA Y, et al. New insights into the pharmacological potential of plant fl avonoids in the catecholamine system[J]. Journal of Pharmacolgical Science, 2014, 124(2): 123-128.
[23] NAKAJIMA V M, MACEDO G A, MACEDO J A. Citrus bioactive phenolics: role in the obesity treatment[J]. LWT-food Science and Technology, 2014, 59(2): 1205-1212.
[24] ZHANG Yu, DOU Huating, LI Hongjun, et al. The citrus fl avonoid nobiletin inhibits proliferation and induces apoptosis in human pancreatic cancer cells in vitro[J]. Food Science and Biotechnology, 2014, 23: 225-229.
Antioxidant Activity in vitro of Nobiletin and Its Inhibitory Effect on the Proliferation of Tumor Cells
ZHANG Yu1,2, LI Hongjun1,*, DOU Huating3, HE Zhifei1
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Engineering Research Center of Regional Food, Chongqing 400715, China; 3. Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712, China)
Objective: To investigate the antioxidant activity of nobiletin and its inhibitory capacity on the proliferation of cancer cells in vitro. Methods: The scavenging activities of nobiletin on DPPH, hydroxyl and superoxide anion radicals were detected. MTT assay was utilized to evaluate the effect of nobiletin on the growth of different tumor cells. The changes in organelles and cell morphology were observed through inverted microscope and transmission electron microscope. Results: Nobiletin had a strong ability to scavenge DPPH, hydroxyl and superoxide anion radicals, especially to remove hydroxyl radical. Nobiletin had a signifi cant inhibitory effect on the growth of PANC-1 cells. The viability and proliferation of PANC-1 cells were decreased in culture medium with nobiletin. As observed under inverted microscope and transmission electron microscope, nobiletin could result in disruption of the nuclear membrane, release of cytoplasmic contents and generation of apoptotic bodies. Conclusion: Nobiletin has excellent capability to scavenge free radicals and inhibit the proliferation of human PANC-1 cells.
nobiletin; antioxidant activity; cell prol iferation
R151
A
1002-6630（2015）19-0233-05
10.7506/spkx1002-6630-201519042
2014-11-12
中央高校基本科研业务费专项资金项目（XDJK2014C071）；西南大学教育教学改革研究项目（2013JY062）；
重庆市北碚区集成示范计划项目（2014-68）；重庆市特色食品工程技术研究中心能力提升项目（cstc2014pt-gc8001）
张玉（1984-），女，实验师，博士，研究方向为食品科学。E-mail：zhangyu_512@sina.cn
*通信作者：李洪军（1961-），男，教授，博士，研究方向为农产加工及贮藏工程。E-mail：983362225@qq.com
