刘 杰，李雅双，包 瑛，刘春兰,3,*
（1.中央民族大学生命与环境科学学院，北京 100081；2.中国食品药品检定研究院，北京 100050；3.北京市食品环境与健康工程技术研究中心，北京 100081）
响应面试验优化新疆阿魏根多糖微波辅助提取工艺及其体外抗氧化活性
刘 杰1,2，李雅双1，包 瑛1，刘春兰1,3,*
（1.中央民族大学生命与环境科学学院，北京 100081；2.中国食品药品检定研究院，北京 100050；3.北京市食品环境与健康工程技术研究中心，北京 100081）
为了获得微波提取新疆阿魏根多糖的最佳工艺，以及新疆阿魏粗多糖的体外抗氧化活性，采用响应面法优化新疆阿魏水溶性多糖的微波提取工艺，在单因素试验的基础上选取液料比、提取温度、提取时间、微波功率进行试验设计，以所得多糖质量与苯酚硫酸法测得的多糖含量百分数的乘积作为优化指标，并检测新疆阿魏根多糖体外清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的活性。结果：最优工艺条件为液料比120∶1（mL/g）、提取时间13 min、提取温度80 ℃、微波功率600 W，多糖实际得率为6.93%，接近于理论值。新疆阿魏根多糖对DPPH自由基有很好的清除作用，当质量浓度为1 000 μg/mL时，新疆阿魏根多糖对DPPH自由基的清除率为91.67%，作用接近于VC的清除作用。
新疆阿魏；多糖；响应面法；提取工艺；抗氧化
新疆阿魏（Ferula sinkiangensis K. M. Shen）是伞形科（Umbelliferae）阿魏属（Ferula）多年生草本植物，全株和果实散发着强烈葱蒜样异臭味。新疆阿魏非常局限地分布于新疆伊犁地区（白石墩）狭小地点，生长于山前荒漠和带砾石的黏质土坡[1]，乳汁可入药，即为阿魏药材。其根也有治疗作用，常用于民族医药[2]。新疆阿魏或阜康阿魏（Ferula fukanensis）树脂俗称阿魏（胶），是我国重要传统中药材，阿魏味苦、辛，性温，归脾、胃经，有消积、散脾、杀虫的功效。用于治疗肉食积滞，瘀血痞块，虫积腹痛等症[3]，具有极高的药用价值。阿魏胶还是治疗风湿性关节炎、胃病的良药，在新疆民族药中用的较多。
多糖是一种天然高分子化合物，由醛糖或酮糖通过糖苷键聚合而成，广泛存在于动物、植物和微生物（细菌和真菌）中，最早研究的为荚膜多糖，主要应用于疫苗[4]。20世纪70年代以来，陆续发现多糖及多糖复合物参与了细胞生命的代谢和调节，中草药多糖能增强机体免疫功能，在抗肿瘤、抗肝炎、抗溃疡、调血脂、降血糖、抗衰老方面均有作用[5]，且毒副作用小、不易残留[6-7]。
微波提取是一种常用提取天然植物有效成分的技术，具有快速、高效、安全、节能、有效成分得率高等特点[8]。响应面法可以对影响过程的因素及其交互作用进行综合评价[9]。
邓卫萍等[5]采用苯酚硫酸法对新疆阿魏的总糖含量进行了测定，并未做进一步研究，其他有关新疆阿魏根多糖的研究鲜有报道。本实验采用响应面法优化微波辅助提取新疆阿魏根多糖的工艺条件，并对新疆阿魏根多糖的体外抗氧化活性进行初步探究，为新疆阿魏资源的进一步开发和利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新疆阿魏根 新疆乌鲁木齐市药材公司。
乙醇、乙醚、硫酸（分析纯）、苯酚（分析纯）国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖 上海国药集团。
1.2 仪器与设备
XH-100B电脑微波催化合成/萃取仪 北京祥鹄科技发展有限公司；QE-200克四两装高速中药粉碎机 浙江屹立工贸有限公司；ZK-2S电热真空干燥箱 天津市中环电炉有限公司；2-4LCS冻干机 德国Christ公司；LD4-8型离心机 北京医用离心机厂；BS224S电子天平德国赛多利斯科学仪器有限公司；UV-Jasco53型紫外分光光度计 日本岛津公司；Benchmark plus酶标仪 美国伯乐公司。
1.3 方法
1.3.1 新疆阿魏根多糖的提取
提取工艺流程：新疆阿魏根→60 ℃干燥24 h→粉碎，过40 目筛→脱脂→微波萃取仪中提取→抽滤→浓缩→真空冻干（-85 ℃，1.4×10-3Mbar）。
1.3.2 新疆阿魏根多糖得率的测定
1.3.2.1 标准曲线的绘制[10]
将葡萄糖标准品于105 ℃烘至恒质量，准确称取50 mg于1 000 mL容量瓶中，定容。分别取标准葡萄糖溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL于试管中，依次补水至2 mL，以水为空白对照，分别加质量分数为5%的苯酚1 mL、浓硫酸5 mL，摇匀后室温静置20 min，于490 nm波长处测吸光度，绘制标准曲线。
1.3.2.2 多糖含量及得率测定
配制50 μg/mL糖溶液，加入5%苯酚1 mL、浓硫酸5 mL，于490 nm波长处测吸光度，并根据标准曲线计算糖含量。
1.3.3 单因素试验设计
通过预实验，选取液料比、提取时间、提取温度、微波功率4 个对多糖得率影响比较明显的条件进行单因素试验，采用微波辅助水提法提取新疆阿魏根多糖，测定糖含量，并计算新疆阿魏根多糖的得率。
1.3.4 响应面试验设计[11-12]
在单因素试验的基础上采用Box-Behnken试验设计，并运用响应面软件（Design-Expert 8.0.6）进行试验分析。分别以X1、X2、X3、X4表示4 个因素，以-1、0、1表示各因素的3 个水平，试验因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素水平表Table1 Factors and their coded Levels used in RSM
1.3.5 精制多糖的体外抗氧化实验
将得到的干燥新疆阿魏根多糖复溶、醇沉、干燥，再次得到的多糖进行体外抗氧化实验。进行新疆阿魏根水溶性多糖清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基活性的测定[13-14]。
配制不同质量浓度的多糖溶液，分别取50 μL的无水乙醇和DPPH溶液于96 微孔板的不同微孔中，各加入50 μL多糖溶液，避光30 min，于525 nm波长酶标仪测得吸光度分别为Ai、Aj。以VC为阳性对照，与多糖做相同处理。50 μL DPPH和50 μL无水乙醇混合作为空白对照，测得吸光度为A0。根据式（2）计算多糖对DPPH自由基的清除率。
以上实验中每一水平均做3 次重复实验，以减小实验误差对实验结果的影响。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
以标准葡萄糖溶液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为y=0.011 1x-0.074 4，R2=0.999 3。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 液料比对新疆阿魏根多糖得率的影响
在微波功率600 W、提取温度70 ℃、提取时间10 min的条件下，设定液料比分别为30∶1、50∶1、80∶1、100∶1、130∶1（mL/g），考察液料比对新疆阿魏根多糖得率的影响。
图1 液料比对多糖得率的影响Fig.1 Effects of radio of water to material on polysaccharide yield
如图1所示，随着液料比的增加，新疆阿魏根多糖的得率呈明显的上升趋势，当液料比达到80∶1～100∶1（mL/g）之间时，多糖得率最高，继续提高液料比，多糖得率不升反降，推测是由于多糖高温分解或杂质质量浓度的升高影响了多糖的溶出和醇沉。
2.2.2 提取时间对新疆阿魏根多糖得率的影响
在微波功率600 W、提取温度70 ℃、液料比80∶1（mL/g）的条件下，设定提取时间分别为5、10、15、20、25 min，考察提取时间对新疆阿魏根多糖得率的影响。
图2 提取时间对多糖得率的影响Fig.2 Effects of extraction period on polysaccharide yield
如图2所示，在提取时间为10 min左右时，多糖得率最高，随着提取时间的延长，多糖的得率下降明显，推测是由于微波作用时间延长，多糖部分降解。
2.2.3 提取温度对新疆阿魏根多糖得率的影响
在微波功率600 W、提取时间10 min、液料比80∶1（mL/g）的条件下，设定提取温度分别为50、60、70、80、90 ℃，考察提取温度对新疆阿魏根多糖得率的影响。
图3 提取温度对多糖得率的影响Fig.3 Effects of extraction temperature on polysaccharide yield
如图3所示，随着温度的升高，多糖得率呈上升趋势，但是由于温度过高对多糖具有破坏作用，未设置更高提取温度。
2.2.4 微波功率对新疆阿魏根多糖得率的影响
在提取温度80 ℃、提取时间10 min、液料比80∶1（mL/g）的条件下，设定微波功率分别为400、500、600、700、800 W，考察微波功率对新疆阿魏根多糖得率的影响。
图4 微波功率对多糖得率的影响Fig.4 Effects of microwave power on polysaccharide yield
如图4所示，当微波功率为600 W时，多糖得率最高。推测微波功率低于600 W时，微波穿透细胞壁的作用力小，导致部分多糖未能溶出；而微波功率高于600 W时，部分多糖降解，降解生成的单糖或寡糖更容易被一些杂质吸附，离心后与杂质一起被除去，因此在微波功率600 W时多糖得率最高。
2.3 响应面试验结果
2.3.1 响应面试验设计及结果
根据单因素试验结果，选取液料比、提取时间、提取温度、微波功率进行四因素三水平试验分析（表2）。
表2 响应面分析方案及结果Table2 Process variable and levels in response surface design arrangement and experimental response values
2.3.2 回归模型有效性及显着性分析
利用Design-Expert 8.0.6软件对表2响应面方案及结果进行回归拟合分析，对回归模型进行方差分析，并检验回归方程系数的显着性（表3）。
表3 回归模型方差分析及回归方程系数显着性检验Table3 Analysis of variance of regression equation and signifi cance test for regression coeffi cients
分析得到的二元回归方程如下：
Y/%=6.74＋0.22X1＋0.13X2＋0.35X3＋0.12X4＋
剔除上述方程式中的不显着项，得到新疆阿魏根多糖得率的公式如下：
方差分析结果（表3）显示回归模型极显着（P＜0.01），失拟项不显着（P＞0.05），该回归模型的调整确定系数为0.956 6，及该模型可以解释95.66%的变化，说明用此模型对新疆阿魏根多糖得率进行的分析和预测是有效的。
由方差分析（表3）可知，液料比与提取时间之间的交互作用极显着，而其他5 种组合类型的因素交互作用不显着。各组合类型的两种因素交互作用形成的响应面如图5所示，每个组合中其他两种因素固定在0水平。
图5 各因素交互作用对多糖得率影响的响应面Fig.5 Response surfaces showing the interactive effects of independent variables on polysaccharide yield
如图5a所示，由等高线图可以看出提取时间的坐标轴所对应的等高线相对于液料比的坐标轴要密集，提取时间比液料比对多糖得率的影响大[15]；由方差分析结果（表3）已知液料比和提取时间的交互作用极显着。如图5b所示，从等高线图可以看出提取温度的坐标轴对应的等高线较液料比的坐标轴要密集，提取温度比液料比对多糖得率的影响大；从曲面图可以看出，随着提取温度和液料比水平的增加多糖得率均先增加后平稳，由于材料中多糖含量的关系，多糖得率不会随着条件的优化而无限制的提高，而且过高的温度对多糖本身也有分解破坏的不利影响[16]；液料比过大会增加浓缩的时间和成本，也会增加其他杂质的含量，杂质可能会吸附多糖，在浓缩和离心的过程中也会造成多糖的损失；液料比与提取温度的交互作用不显着（表3）。图5c中，随着微波功率的增加（500～700 W）多糖得率先增加后降低，因为微波功率过大对多糖具有分解作用；由等高线图可知，微波功率对多糖得率的影响大于液料比；液料比与微波功率的交互作用不显着（表3）。图5d中，随着提取时间的变化（5～10 min）多糖得率先升高后降低。微波作用时间过长对多糖也有一定的分解作用，故并不是提取时间越长多糖得率越高。由等高线图可知，提取温度对多糖得率的影响大于提取时间的影响；提取温度与提取时间的交互作用不显着（表3）。由图5e、f的等高线图可以直观看出，微波功率与提取时间的交互作用比微波功率与提取温度的交互作用要好，且提取温度和提取时间对多糖得率的影响均比微波功率的影响大；但从方差分析[17-19]（表3）的结果可知，微波功率与提取时间和提取温度的交互作用均不显着（P＞0.05）。
根据回归模型的分析结果[20-22]，得到理论最优工艺条件为液料比119.13∶1（mL/g）、提取时间12.96 min、提取温度83.87℃、微波功率586.72 W，该条件下多糖得率的预测值为6.97%。考虑到实际操作及仪器设置的限制，将微波提取的工艺条件稍作修正：液料比120∶1（mL/g）、提取时间13 min、提取温度80 ℃、微波功率600 W。3 次平行实验验证此条件，得到新疆阿魏根多糖实际得率的平均值为6.93%，接近于多糖得率的预测值。而采用直接水提醇沉法，3 次平行实验得到新疆阿魏根多糖实际得率为2.38%，说明采用响应面方法优化多糖微波提取工艺的参数条件是可行的。且在后续酶法结合Sevag法脱蛋白实验中，采用微波辅助水提和冻干的多糖比水提醇沉和常规干燥的多糖更容易脱去蛋白质，因此也减少有机溶剂对多糖的破坏[23-24]。
2.4 新疆阿魏根多糖的体外抗氧化活性
图6 新疆阿魏根多糖对DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of the crude polysaccharides on DPPH free radicals
如图6所示，新疆阿魏根多糖对DPPH自由基有清除作用，在质量浓度范围为100～1 000 μg/mL，新疆阿魏根多糖随质量浓度增加，对DPPH自由基的清除作用也增强。当多糖和VC的质量浓度均为100 μg/mL时，清除率分别为67.29%、85.42%；当多糖和VC的质量浓度达到1 000 μg/mL时，清除率分别为91.67%、98.75%，新疆阿魏根多糖与VC对DPPH自由基的清除作用非常接近。
3 结 论
本实验选取液料比、提取温度、提取时间、微波功率4 个因素进行响应面分析，通过回归模型的方差分析结果可知各因素对多糖得率的影响均显着，其影响顺序为提取温度＞液料比＞提取时间＞微波功率。响应面法优化微波提取新疆阿魏水溶性多糖的最佳工艺条件为：液料比120∶1（mL/g）、提取时间13 min、提取温度80 ℃、微波功率600 W。新疆阿魏根多糖实际得率为6.93%，接近于多糖得率的预测值。
体外抗氧化实验结果显示，新疆阿魏根多糖对DPPH自由基有很好的清除作用，与VC抗氧化性相当。鉴于新疆阿魏根多糖的抗氧化活性，可以尝试应用于开发相关保健品、药物及化妆品等[25]。
参考文献：
[1] 惠红, 刘启新, 刘梦华, 等. 中国伞形科前胡族阿魏亚族血清分类及亲缘关系的研究[J]. 植物分类学报, 2003, 41(4): 369-380.
[2] 敬松, 刘建. 拯救新疆阿魏[J]. 生命世界, 2005(9): 109.
[3] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京: 中国医学科学出版社, 2010: 175.
[4] JENNINGS H J. Capsular polysaccharides as human vaccines[J]. Advances in Carbohydrate Chemistry and BioChemistry, 1983, 41: 155.
[5] 邓卫萍, 解成喜, 艾尔肯·艾米尔. 光度法测定新疆阿魏中多糖的含量[J]. 理化检验: 化学分册, 2009, 45(1): 25-29.
[6] TAO Yiwen, TIAN Gengyuan. Studies on the physicochemical properties, structure and antitumor activity of polysaccharide YhPS-1 from the root of Cordalis yanhusuo Wang[J]. Chinese Journal of Chemistry, 2006, 24(2): 235-239.
[7] GE Yu, DUAN Yufeng, FANG Guozhen, et al. Study on biological activities of Physalis alkekengi var. francheti polysaccharide[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2009, 89(9): 1593-1598.
[8] 付志红, 谢明勇, 聂少平, 等. 微波技术用于车前子多糖的提取[J].食品科学, 2005, 26(3): 151-154.
[9] 金华, 马驰骁, 王建军. 响应面法优化迎春花多糖提取工艺的研究[J].分析科学学报, 2013(6): 827-830.
[10] 刘志明, 唐彦君, 吴海舟, 等. 苯酚-硫酸法测定葡萄酒中总糖含量的样品处理[J]. 中国酿造, 2011, 30(2): 158-161.
[11] YU Ping, CHAO Xiaoyin. Statistics-based optimization of the extraction process of kelp polysaccharide and its activities[J], Carbohydrate Polymers, 2013, 91: 356 -362.
[12] OZCAN S. A response surface analysis of commercial corn starch annealing[J]. Cereal Chemistry, 2003, 80(2): 241-243.
[13] XI Jun, SHEN Deji, LI Ye, et al. Comparison of in vitro antioxidant activities and bioactive components of green tea extracts by different extraction methods[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2011, 408: 97-101.
[14] SHAO Ping, CHEN Xiao, SUN Ping. In vitro antioxidant and antitumor activities of different sulfated polysaccharides isolated from three algae[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2013, 62: 155-161.
[15] 姜绍通, 汪洪普, 潘丽军. 响应面法优化微波辅助提取芋头多糖工艺研究[J]. 食品工业科技, 2013, 34(3): 215-219.
[16] 李雅双, 连路宁, 刘杰, 等. 芜菁多糖提取工艺及清除自由基活性的研究[J]. 食品与发酵工业, 2014, 40(5): 235-239.
[17] 刘军海, 黄宝旭, 蒋德超. 响应面分析法优化艾叶多糖提取工艺研究[J]. 食品科学, 2009, 30(2): 114-118.
[18] 吴雪艳, 罗鹏, 叶建方, 等. 响应面法优化竹荪菌托多糖的提取工艺[J].南方农业学报, 2015(3): 480-485.
[19] 柯春林, 李作美, 路滨宇, 等. 石榴花多糖醇提工艺的响应曲面法优化及其抗氧化活性研究[J]. 食品工业科技, 2015, 36(8): 286-289; 304.
[20] 张斯谣, 徐博, 郝鑫, 等. 响应面优化超声波辅助提取桔梗多糖工艺[J].农产品加工, 2015(7): 26-29; 32.
[21] 王润梅, 张永芳, 胡猷浩. 响应面分析法优化北芪菇多糖提取工艺研究[J]. 食品工业, 2015, 36(2): 68-71.
[22] 李文利, 宁喜斌, 熊梓伊, 等. 响应面法优化微波提取桑叶黄酮和多糖工艺研究[J]. 食品工业, 2015, 36(2): 21-25.
[23] 张曼, 韩飞, 王晶钰. 黄芪多糖微波提取工艺研究进展[J]. 陕西农业科学, 2015, 61(3): 85-88.
[24] 黎英, 尤双圳, 赖丹妮, 等. 响应面法优化超声波辅助提取状元豆多糖工艺[J]. 食品与发酵工业, 2015, 41(4): 223-229.
[25] 马艳弘, 刘晨, 张宏志, 等. 响应面法优化芦荟皮多糖的微波辅助提取工艺及抗氧化活性研究[J]. 江西农业大学学报, 2015(1): 149-156.
Extraction Optimization of Polysaccharides from the Roots of Ferula sinkiangensis K. M. Shen and Their Antioxidant Activities in Vitro
LIU Jie1,2, LI Yashuang1, BAO Ying1, LIU Chunlan1,3,*
(1. College of Life and Environmental Science, Minzu Univirsity of China, Beijing 100081, China; 2. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China; 3. Beijing Engineering Research Center of Food Environment and Public Health, Beijing 100081, China)
This study aimed to obtain the optimum microwave-assisted extraction process for polysaccharides from the roots of Ferula sinkiangensis K. M. Shen and to examine the antioxidant activity of the crude polysaccharides in vitro. The response surface methodology (RSM) was used to optimize the extraction process. Liquid/solid ratio, extraction temperature, extraction time, microwave power were selected as independent variables on the basis of single factor experiments. The yield of purifi ed polysaccharides was chosen as the response variable. The optimum conditions for microwave-assisted extraction were determined as follows: liquid/solid ratio, 120:1 (mL/g); extraction temperature, 80 ℃; extraction time, 13 min; and microwave power, 600 W. Experiments done under these conditions resulted in an extraction yield of 6.93%, agreeing with the predicted value. The crude polysaccharides extracted from the roots of Ferula sinkiangensis K. M. had a potent scavenging effect on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radicals, and could scavenge 91.67% of the free radicals at 1 000 μg/mL, which was close to that of VC.
Ferula sinkiangensis K. M. Shen; polysaccharides; response surface methodology; extraction process; antioxidant activity
Q946.3
A
1002-6630（2015）22-0057-06
10.7506/spkx1002-6630-201522010
2015-03-26
中央民族大学“985”工程项目（MUC985-9）；“111创新引智计划”工程项目（B08044）；
准格尔北部生态保育技术集成与示范项目（2014BAC15B04）
刘杰（1989—），女，硕士研究生，研究方向为植物多糖化学。E-mail：liujie19890215@163.com
*通信作者：刘春兰（1962—），女，教授，硕士，研究方向为多糖化学。E-mail：13520669416@163.com
