陈新亮，邵启兵，王 超，何剑斌，张 燚，杨淑华，李 鹏，龙 淼*（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110866）
唾液乳杆菌的分离鉴定及生物特性研究
陈新亮，邵启兵，王 超，何剑斌，张 燚，杨淑华，李 鹏，龙 淼*
（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110866）
摘 要：从健康散养的溜达鸡小肠黏膜中分离出一株乳杆菌，通过菌落形态观察、革兰氏染色、生理生化鉴定以及16S rRNA基因序列测定和同源性分析，确定所分离的菌株为唾液乳杆菌，并命名Lactobacillus salivarius C-1-3。对该菌进行抑菌、纤维素降解、耐酸、耐胆盐、耐高温实验。结果表明：其对常见的致病菌大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌都具有良好的抑制作用，且该菌株能够降解纤维素。经过多次驯化后，该菌株表现出较好的抑菌作用及耐酸、耐高温特性。
关键词：唾液乳杆菌；分离鉴定；生物学特性
引文格式：
陈新亮， 邵启兵， 王超， 等.唾液乳杆菌的分离鉴定及生物特性研究［J］.食品科学， 2016， 37（13）: 157-161.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613028. http://www.spkx.net.cn
CHEN Xinliang， SHAO Qibing， WANG Chao， et al.Isolation and identification of Lactobacillus salivarius from chicken intestine and its biological characteristics［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 157-161.（in Chinese with English abstract）
乳酸杆菌是人和动物体肠道内正常菌群的一种，其抗病、防病及促生长的作用已有很多报道，并且有研究表明，理想的益生菌菌株来自本源动物。乳酸杆菌作为动物体内一种重要的益生菌，能够调节肠道菌群的平衡，对常见的肠道致病菌具有广谱抗菌作用，并可以增强机体的免疫力和抵抗力［1］、提高乳制品品质，改善人类的乳糖不耐受症状［2］；同时还具有提高饲料利用率、促进动物生长性能和肉品质［3-4］等许多有益的生理功能。目前抗生素的滥用带来了严重危害［5］，亟需发现新型物质来代替抗生素，目前认为乳酸杆菌是最佳的抗生素替代品。但不同来源的乳酸菌生物学特性不同，因此对乳酸杆菌菌种的分离纯化、研究其生物学特性是将其进行生产实践应用的重要环节。目前，国内外对乳酸杆菌生物特性的研究多限于乳品、植物来源的乳杆菌，动物源性的乳酸杆菌虽然也有应用，但对其生物特性的报道不够系统全面，仅见武玉香等［6］对乳杆菌分离鉴定及生物特性的研究；徐恒毅［7］对具有益生菌特性的阴道乳酸杆菌进行了筛选及生物学特性的研究；龙淼等［8］对犊牛瘤胃黏膜乳杆菌进行了分离鉴定及生物学特性研究。唾液乳杆菌作为《可用于食品的菌种名单》［9］中可食用菌种之一，具有很多重要的生理功能，使得其有望成为优良的食品添加剂及可替代抗生素添加剂的优良益生菌之一。因此，本实验从鸡小肠黏膜中分离鉴定出一株唾液乳杆菌，并对其生物学特性进行研究，为该菌应用于实际生产提供相应的理论基础。
1 材料与方法
1.1 动物、菌株与试剂
本地健康散养溜达鸡，购于沈阳周边地区散养鸡农户。
鸡源大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，均由沈阳农业大学畜牧兽医学院临床实验室保存提供。根据文献［10］方法选择MRS培养基、SL乳杆菌选择性培养基，根据文献［11-12］方法选择LB培养基、麦康凯琼脂培养基、羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）固体培养基，根据文献［13］方法选择甘露醇氯化钠琼脂培养基，进行相应的菌株培养及实验。
细菌基因组DNA抽提试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2 仪器与设备
Power Pac Basic电泳仪、Gel Doc XR+凝胶成像仪、S1000TMThermal Cycler PCR扩增仪 美国Bio-Rad公司；DHS离心机 北京鼎昊然生物科技有限公司；UVmini-1240紫外-可见分光光度计 日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株分离
剪断溜达鸡颈部血管，快速放血致死，无菌条件下迅速取出小肠，置于无菌平皿中，移至超净工作台中剖开，去掉小肠内容物［14］，无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3 次，用灭菌载破片刮取小肠黏膜黏液，然后用灭菌生理盐水进行稀释，依次稀释至10-2、10-3、10-4梯度，各稀释度均取0.1 mL，在无菌条件下用接种环划线种于SL选择性培养基，置于37 ℃摇床中培养36 h后，接种到MRS固体培养基中，37 ℃培养24 h。
1.3.2 菌种鉴定
进行多次划线培养后，挑取形态特征与《伯杰氏细菌鉴定手册》［15］对乳杆菌描述（圆形、表面光滑、乳白色等）相一致的菌落进行革兰氏染色，选取疑似菌株进行生理生化鉴定，包括生化反应管实验以及菌株16S rRNA鉴定：利用DNA快速提取试剂盒提取细菌的基因组，然后采用16S rRNA通用引物27f：5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492r： 5′-GGTTACCTTGTTACTT-3′，以提取的基因组作为模板，进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，扩增成功后进行测序，测序结果在美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）进行BLAST比对，在GenBank中得到几个与分离菌株序列同源性较高的菌株，将这些菌株作为参考菌株进行同源性分析。使用Clustal X1.81将这些参考菌株的序列对齐后，使用DNA Star建立菌株的系统发育树，分析菌株的同源性［16-17］。
1.3.3 菌株生长曲线的绘制
将菌种以1%的接种量接种到MRS培养基中，置于37 ℃摇床中培养，分别在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、18、22 h时取样，测定培养基的pH值；采用比浊法，利用分光光度计测定菌液在600 nm波长处的光密度（OD600 nm）值，然后以培养时间为横坐标，以pH值和OD600 nm值为纵坐标，绘制菌株生长曲线［18］。
1.3.4 菌株体外抑菌实验
参考刘冬梅等［19］的方法，以牛津杯法测定益生菌的抑菌活力。将过夜培养的细菌进行离心，收集上清液备用；在超净工作台内将事先准备好的鸡源大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌依次稀释至10-2、10-3、10-4梯度，并分别各吸取100 μL涂布到LB培养基、麦康凯琼脂培养基及甘露醇氯化钠琼脂培养基中，然后用镊子将无菌牛津杯轻放于涂完指示菌株的平皿中，再吸取160～180 μL上清液滴到牛津杯内，注意不要让上清液溢出牛津杯，最后将平皿放置4 ℃冰箱中24 h，进行扩散处理。然后放到37 ℃恒温箱中培养24 h，观察抑菌现象。
1.3.5 纤维素降解实验
将培养24 h的菌株梯度稀释后接种CMC-Na固体培养基上，每个接种点涂布20 μL菌液，于37 ℃的恒温箱中培养4 d，取出平板后用1 mg/mL的刚果红染色液染色20 min，倒掉多余的刚果红，分别测定菌落直径（d）和降解圈直径（D），以降解圈直径和菌落直径的比值（D/d）为指标，判定菌株降解纤维素的能力［19-20］。
1.3.6 耐酸实验
将配制好的MRS培养基用0.1 mol/L盐酸溶液及0.1 mol/L氢氧化钠溶液调整pH值分别为6.0（对照组）、5.0、4.0、3.0、2.0组［21］，将菌种以5%的接种量分别接种到灭菌后的培养基中，37 ℃摇床中培养24 h，测定菌液的OD600 nm值，计算成活率。
1.3.7 耐胆盐实验
在MRS培养基中分别加入0.05%、0.10%、0.15%、0.20%的猪胆盐，以不加猪胆盐作为对照组，每组分别做一个平行对照。将菌种按5%的接种量接种到不同胆盐含量的培养基中，37 ℃培养24 h ，平板计数，计算成活率。
1.3.8 耐高温实验
取培养24 h的菌株分别于40、45、50、55 ℃水浴中处理20 min，以不作高温处理的菌株作为对照组。然后以10的倍数进行依次递减稀释处理，最后取20 μL处理后的菌液进行涂板，在37 ℃恒温箱中培养24 h，平板计数，计算成活率。
2 结果与分析
2.1 菌株的形态学观察结果
编号为C-1-3的菌株在MRS培养基上划线培养后，生长良好，菌落大小为0.6～1.5 mm，呈乳白色、边缘整齐、较光泽并凸起于培养基表面（图1）。培养24 h的菌株革兰氏染色结果如图2所示，菌株呈蓝色直杆状，单个、成双或聚集排列一起，两端钝圆，可以判断所分离的菌株为革兰氏阳性杆菌。
2.2 生化鉴定结果
对所分离的菌株进行生化鉴定，结果见表1，将鉴定结果与《伯杰氏细菌鉴定手册》［15］对乳杆菌的生理生化鉴定描述相比较，可以初步鉴定所分离的菌株为乳杆菌属。
注：+.阳性结果；－.阴性结果。
2.3 16S rRNA测定及同源性分析结果
PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果见图3，可以看出PCR扩增后的基因大小为1 500 bp左右，分离菌株的16S rRNA基因片段测序结果为1 468 bp，与电泳结果相一致，并初步确定C-1-3菌株为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）。基因测序结果已递送至GenBank数据库中并被收录，登录号为：KP979479，进行BLAST基因序列比对，比对结果表明所分离的菌株与GenBank中收录的Lactobacillus sp.KLDS 1.0719（登录号EU600923.1）和Lactobacillus salivarius strain ZJ601（登录号JN981843.1）等数个菌株同源性达到99%，将这几个相似度较高的菌株作为参考菌株（表2），使用Clastal X1.81将C-1-3菌株碱基序列及参考菌株序列对齐后，利用MEGA软件对分离菌株进行同源分析，生成系统发育树（图4），进一步确定所分离的菌株与参考菌株中的Lactobacillus salivarius strain ZJ601属同一分支。
表 2 参考菌株信息Table 2 Reference strains菌株 登录号Lactobacillus sp.KLDS 1.0719 EU600923.1 Lactobacillus salivarius strain ZJ601 JN981843.1 Lactobacillus salivarius strain Probio-37 GU357500.1 Lactobacillus salivarius subsp.salicinius strain JCM 1046 AY137587.1 Lactobacillus salivarius strain CH-9 FJ378897.1 Lactobacillus salivarius isolate 3-1-30 AB932525.1 Uncultured bacterium clone p-4323-4Wa3 AF371497.1 Lactobacillus salivarius subsp.salicinius strain JCM 1042 AY137584.1
2.4 菌株的生长曲线
由图5可知，C-1-3菌株大约在2 h后进入对数期，5 h后稳定增长，在14 h后活菌数达到最大。在菌体进入对数期时菌液的酸度迅速降低，稳定期时pH值维持在3.0左右。
2.5 体外抑菌实验结果
如图6、7所示，C-1-3菌株对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌都具有良好的抑制效果，尤其是对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制效果最佳，抑菌圈的直径为20～22 mm，原因可能是乳杆菌在生长的过程中产生了乳酸、H2O2或细菌素，从而抑制了以上3 种细菌的生长［22］。
2.6 纤维素降解实验结果
如图8所示，所分离的乳杆菌对纤维素有一定降解能力，菌落直径（d）约为1 mm，降解圈直径（D）为3.5 mm，菌株降解纤维素指标为D/d=3.5。
2.7 耐酸性实验结果
乳酸菌要应用于实际生产中，必须具有耐受胃肠道的酸性环境的能力，菌株在不同pH值溶液中培养24 h后的成活率见表3。C-1-3菌株在pH 2.0的溶液中成活率为18.2%，在pH 4.0的溶液中成活率为126.4%，即pH 4.0为C-1-3菌株的最适pH值生长环境。
表 3 耐酸性实验结果Table 3 Results of acid tolerance test培养基pH 2.0 3.0 4.0 5.0成活率/% 18.2 98.5 126.4 109.5
2.8 耐胆盐实验结果
动物体小肠内的胆盐质量分数为0.03%～0.3%［14］，对胆盐的耐受能力在此范围内的乳杆菌才有机会在肠道内附殖生长。由表4可知，C-1-3菌株的耐胆盐能力较差，当胆盐质量分数为0.20%时，其存活率为2.52%，在胆盐质量分数为0.10%时其存活率升高至74.6%。
表 4 耐胆盐实验结果Table 4 Results of bile salt tolerance test胆盐质量分数/% 0.05 0.10 0.15 0.20成活率/% 84.3 74.6 30.2 2.52
2.9 耐高温实验结果
初次进行耐高温筛选时，C-1-3菌株表现出较差的耐高温特性，50 ℃水浴20 min后的成活率几乎为0，经过多次驯化后，C-1-3菌株对高温具有了一定的耐受性。如图9所示，经过驯化后的C-1-3菌株在40 ℃时成活率为94.3%，但当温度达到55 ℃时，成活率降低至23.8%。
3 讨 论
影响益生菌在肠道内附殖、生长主要由两大因素决定：低酸度环境及胆汁酸盐的浓度［23-24］。本研究分离的菌株对酸度有较好的耐受性，但胆盐耐受性较差，如何提高菌株的耐胆盐能力很关键，曾东等［25］在考察玉米、豆粕、麦麸提取物对4 株乳杆菌胆盐耐受力影响的研究中提到葡萄糖可以显着提高乳酸菌的耐受能力，这可以作为日后提高乳杆菌对胆盐耐受力的一个重要方法，对普通的MRS培养基进行改良，添加适量的葡萄糖以提高菌株的耐胆盐能力。另外，本研究分离的唾液乳杆菌对纤维素具有一定的降解能力，很少有文献报道乳杆菌能够降解纤维素，这是本实验的一个重要发现。菌株的纤维素降解能力对其在畜禽饲养中的应用具有重要实践意义［26］。如何进一步提高该菌株的益生性能及在生产实践中的应用效果，还有待进一步的研究及生产检验。
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辽宁省教育厅科学研究一般项目（L2014561）
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613028 10.7506/spkx1002-6630-201613028. http://www.spkx.net.cn
中图分类号：S831；Q939
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2016）13-0157-05
收稿日期：2015-09-11
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31201961；31302152）；中国博士后科学基金项目（2014M551125）；
作者简介：陈新亮（1989—），男，硕士研究生，主要从事动物微生态研究。E-mail：303467045@qq.com
*通信作者：龙淼（1978—），男，讲师，博士，主要从事动物营养代谢病与中毒病研究。E-mail：longmiao@syau.edu.cn
Isolation and Identification of Lactobacillus salivarius from Chicken Intestine and Its Biological Characteristics
CHEN Xinliang， SHAO Qibing， WANG Chao， HE Jianbin， ZHANG Yi， YANG Shuhua， LI Peng， LONG Miao*
（College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China）
Abstract:An isolate of the anaerobic bacterium Lactobacillus salivarius was obtained from the intestine of chicken and identified by colony morphology， Gram staining， physio-biochemical reactions， and 16S rRNA sequencing analysis.Results showed that the strain was Lactobacillus salivarius and named as Lactobacillus salivarius C-1-3.Then the strain was subjected to antibacterial， cellulose degradation， and acid， bile salt and high temperature tolerance tests.It turned out that the strain C-1-3 had a powerful antibacterial effect against E.coli， Salmonella and Staphylococcus aureus.And it also had cellulose degradation ability.After several generations of domestication， this strain possessed good antibacterial performance and significant tolerance to acid and high temperature.
Key words:Lactobacillus salivarius； isolation and identification； biological characteristics
