李燕丽，罗琼仙，杨雪梅，占 琪，李家华,*
（1.云南农业大学龙润普洱茶学院，云南 昆明 650201；2.湄潭县茶产业发展中心，贵州 湄潭 564100；3.云南省农业科学院茶叶研究所，云南 勐海 666201）
‘紫娟’茶花色苷的分离鉴定
李燕丽1,2，罗琼仙3，杨雪梅1，占 琪1，李家华1,*
（1.云南农业大学龙润普洱茶学院，云南 昆明 650201；2.湄潭县茶产业发展中心，贵州 湄潭 564100；3.云南省农业科学院茶叶研究所，云南 勐海 666201）
依次以MCI gel CPH 20P（75～150 μm）树脂和SephadexTMLH-20葡聚糖凝胶为层析柱填料，对‘紫娟’茶花色苷进行分离纯化，采用5%乙酸-甲醇溶液和5%乙酸溶液对花色苷提取液梯度洗 脱，得到6 种花色苷组分。采用薄层层析、高效液相色谱及高效液相色谱-电喷雾-串联质谱对‘紫娟’茶花色苷组成成分进行研究。结果表明：从‘紫娟’茶鲜叶中分离出的花色苷为飞燕草素-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-半乳糖苷、飞燕草素-3-O-（6-（Z）对香豆酸）吡喃半乳糖苷、矢车菊素-3-O-（6-（Z）对香豆酸）吡喃半乳糖苷、飞燕草素-3-O-（6-（E）对香豆酸）吡喃半乳糖苷、矢车菊素-3-O-（6-（E）对香豆酸）吡喃半乳糖苷。
‘紫娟’茶；花色苷；分离纯化；高效液相色谱-电喷雾-串联质谱法；结构鉴定
近年来，随着研究的不断深入，天然色素花色苷所具有的功能逐渐明晰，使得天然色素花色苷获得了广阔的市场前景。花色苷具有抗氧化[1-5]、抗突变[6-8]、抗肿瘤[1,9-10]、预防心血管疾病[11-12]及改善人眼机能[1,6]等作用，广泛存在于羊齿类植物以上的高等植物中。‘紫娟’茶（Camellia sinensis var. assamica）是云南省农业科学院茶叶研究所培育的茶树特异新品种，该茶树变异于云南大叶种群体，2005年被国家林业局授予新品种保护权，品种权号为2005031，因其新梢及加工而成的绿茶干茶和茶汤色皆为紫色，故命名为‘紫娟’[13-18]。‘紫娟’中除含有儿茶素、茶氨酸和咖啡碱等生化成分外，花色苷含量高是其特有的品种特征之一，亦是其呈紫色的原因[19-21]。费旭元[22]认为，由‘紫娟’鲜叶加工的绿茶比其他普通茶树品种鲜叶加工的绿茶中花色苷含量高出10 倍左右。研究表明，‘紫娟’茶中的花色苷种类丰富，与其他紫芽茶中所含花色苷成分并非完全一致[23-26]。‘紫娟’茶在花色苷的开发与研究方面存在潜在利用价值。本实验通过柱层析法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、薄层层析（thin layer chromatography，TLC）法及HPLC-电喷雾-串联质谱（HPLC-electrospray ionization-tandem mass spectrometry，HPLC-ESI-MS/MS）法对‘紫娟’茶一芽二叶新梢鲜叶中的花色苷进行分离鉴定，为‘紫娟’茶花色苷的研究开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
茶样采自云南省农科院茶叶研究所（勐海），采制标准为一芽二叶鲜叶。
MCI gel CHP 20P（75～150 µm）树脂 日本三菱公司；SephadexTMLH-20葡聚糖凝胶 美国GE Healthcare公司；TLC Silica gel 60 F254（25 Aluminium sheets 20 cm×20 cm） 德国Merck公司；冰乙酸、乙酸乙酯（均为分析纯） 天津市风船化学试剂科技有限公司；三氯甲烷（分析纯） 重庆川东化工（集团）有限公司；甲醇（色谱纯） 美国Tedia公司；超纯水为实验室自制。
1.2 仪器与设备
EPED-E2-20TH实验室超纯水器 南京易普易达科技发展有限公司；RV8旋转蒸发仪、HB10恒温水浴锅 德国IKA公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市予华仪器公司；Acquity Xevo TQ-S LC-MS联用仪 美国沃特世公司；HPLC分析仪（1200VWD G1314B UV检测器、1100/1200 G1316A柱温箱、1100/1200 G1329A温控自动进样器、1100/1200G1322A脱气机、1100/1200G1311A四元溶剂输送泵）、Zorbax SB-C18色谱分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美国Agilent公司；TSK gel ODS-80TS QA色谱分析柱（4.6 mm×150 mm）日本Tosoh公司。
1.3 方法
1.3.1 花色苷的提取分离
鲜叶采后用冰壶保鲜，快速带回实验室用乙酸-甲醇（1∶1，V/V）溶剂浸提24 h过滤，重复2 次，合并浸提液。提取液35 ℃真空旋转蒸发至膏状，用少量超纯水将其溶解，分别用三氯甲烷、乙酸乙酯依次萃取，取水溶液层作为分析液。分析液依次过填料为MCI gel CHP 20P（75～150 µm）树脂和SephadexTMLH-20树 脂的层析柱，以5%乙酸溶液和5%乙酸-甲醇溶液为洗脱液进行洗脱。洗脱梯度：5%乙酸溶液依次为90%、70%、50%、30%和10%，按颜色带收集。
1.3.2 HPLC分析条件
待测液分别经0.45 μm有机膜过滤后待检测。色谱条件：TSK gel ODS-80TS QA色谱柱（4.6 mm×150 mm）；流动相：A相为1.5%磷酸-98.5%水（V/V），B相为1.5%磷酸-20%甲酸-25%乙腈-5%四氢呋喃-48.5%水（V/V），洗脱梯度为0 min，88% A；35 min，30% A；流速1.0 mL/ min，35 min内完成；检测波长525 nm；柱温40 ℃；进样量10 μL；系统平衡10 min后再次进样。
1.3.3 花色苷的薄层分析
展开剂：展开剂为A、B两种溶剂的混合液，比例为3∶1（V/V）。其中A溶剂为苯-甲酸乙酯-甲酸（1∶7∶1，V/ V）溶液；B溶剂为甲酸乙酯-甲酸-水（3∶1∶1，V/V）溶液。比移值按下式计算[27]：
1.3.4 花色苷的HPLC-ESI-MS/MS分析
分析条件：A g i l e n t Z o r b a x S B-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈；洗脱梯度：0 min，92.0% A、8.0% B；10 min，85.0% A、15.0% B；40 min，75.0% A、25.0% B；50 min，0% A、100% B。柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；检测波长525 nm。
HPLC-MS/MS（ESI+）扫描条件：毛细管电压2.0 kV；锥孔电压30 V；脱溶剂温度350 ℃，脱溶剂气流量800 L/Hr；锥孔气流量150 L/Hr。
2 结果与分析
2.1 ‘紫娟’茶鲜叶中花色苷的分离
图1 ‘紫娟’茶鲜叶提取液中花色苷的HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of anthocyanins extracted from fresh leaves of ‘Zijuan’ fresh tea leaves
从图1可以看出，‘紫娟’茶花色苷化合物中主要有11 种花色苷单体，其色谱峰集中分布在保留时间12～31 min的 区段内。花色苷提取液依次上MCI gel CHP 20P（75～150 µm）树脂柱和SephadexTMLH-20柱，经不同梯度溶剂洗脱后收集到6 个组分。
如图2所示，组分1（图2A）的保留时间为12.9 min，相对含量为96.75%；组分2（图2B）的保留时间为14.5 min，相对含量为88.69%；组分3（图2C）的保留时间为24.1 min，相对含量为91.07%；组分4（图2D）的保留时间为26.0 min，相对含量为71.85%；组分5（图2E）的保留时间为27.4 min，相对含量为95.97%；组分6（图2F）的保留时间为29.5 min，相对含量为85.69%。
图2 花色苷提取液洗脱后不同组分的HPLC图Fig.2 HPLC chromatograms of differe nt components of anthocyanin extract
图3 分离纯化后花色苷组分的TLC色谱图Fig.3 TLC chromatogram of purified anthocyanin components
如图3所示，分离纯化出的6 个‘紫娟’茶花色苷组分中还含有非花色苷物质。其中组分3最为明显，组分3中箭头所指物质，推测其可能为茶叶中的黄酮类物质。
2.2 花色苷的结构鉴定
2.2.1 组分1的HPLC-ESI-MS/MS分析结果
图4 ‘紫娟’茶花色苷组分1的一级质谱图（A）和二级质谱图（B）Fig.4 Mass spectrum (A) and tandem mass spectrum (B) of Fr 1
从图4可以看出，组分1的母离子为M+（m/z）465，子离子为MS2（m/z）303，相当于丢失了一个己糖分子，主要碎片离子的质荷比为303，这表明丢失的部分是连接在飞燕草色素（C15H11O7+）的糖苷配基上，相同分子质量的己糖有可能是葡萄糖或半乳糖。而根据文献[24,26,28-29]，可以推断其为飞燕草素-3-O-半乳糖苷。
2.2.2 组分2的HPLC-ESI-MS/MS分析结果
图5 ‘紫娟’茶花色苷组分2的一级质谱图（A）和二级质谱图（B）Fig.5 Mass spectrum (A) and tandem mass spectrum (B) of Fr 2
如图5所示，组分2的母离子为M+（m/z）449，子离子为MS2（m/z）287，相当于丢失了一个己糖分子，主要碎片离子的质荷比为287，表明丢失的己糖分子是连接在矢车菊色素的糖苷配基上，相同分子质量的己糖有可能是葡萄糖或半乳糖。根据相关文献[24,26,28-29]综合分析，可以确定‘紫娟’茶花色苷组分2为矢车菊素-3-O-半乳糖苷。
2.2.3 组分3的HPLC-ESI-MS/MS分析结果
图6 ‘紫娟’茶花色苷组分3的一级质谱图（A）和二级质谱图（B）Fig.6 Mass spectrum (A) and tandem mass spectrum (B) of Fr 3
如图6所示，组分3的母离子为M+（m/z）611，子离子为MS2（m/z）303，而C30H27O14+的质荷比为611。组分3与组分4的保留时间差约为1.7 min，和组分5、6之间的保留时间差相近，并且组分3与组分5的分子质量相同，可推断组分3与组分5为同分异构体，根据文献[26,30]，可推断组分3为飞燕草素-3-O-（6-（Z）对香豆酸）吡喃半乳糖苷。
2.2.4 组分4的HPLC-ESI-MS/MS分析结果
图7 ‘紫娟’茶花色苷组分4的一级质谱图（A）和二级质谱图（B）Fig.7 Mass spectrum (A) and tandem mass spectrum (B) of Fr 4
如图7所示，组分4的母离子为M+（m/z）595，子离子为MS2（m/z）287。而C30H27的质荷比为595。并且组分4与组分6的分子质量相同，可推断组分4与组分6为同分异构体，并且组分6与组分4的保留时间差为3.5 min，和文献[30]中矢车菊素-3-O-（6-（E）对香豆酸）吡喃半乳糖苷与矢车菊素-3-O-（6-（Z）对香豆酸）吡喃半乳糖苷的保留时间差接近，由此可推断组分4为矢车菊素-3-O-（6-（Z）对香豆酸）吡喃半乳糖苷。
2.2.5 组分5的HPLC-ESI-MS/MS分析结果
如图8所示，组分5的母离子为M+（m/z）611，子离子为MS2（m/z）303，而C30H27的质荷比为611。组分2与组分5的保留时间差约为13 min，与文献[26]中矢车菊素-3-O-半乳糖苷和飞燕草素-3-O-（6-（E）对香豆酸）吡喃半乳糖苷的保留时间差相近，根据文献[28]，则判定组分5为飞燕草素-3-O-（6-（E）对香豆酸）吡喃半乳糖苷。
图8 ‘紫娟’茶花色苷组分5的一级质谱图（A）和二级质谱图（B）Fig.8 Mass spectrum (A) and tandem mass spectrum (B) of Fr 5
2.2.6 组分6的HPLC-ESI-MS/MS分析结果
图9 ‘紫娟’茶花色苷组分6的一级质谱图（A）和二级质谱图（B）Fig.9 Mass spectrum (A) and tandem mass spectrum (B) of Fr 6
如图9所示，组分6的母离子为M+（m/z）595，子离子为MS2（m/z）287。而C30H27O13+的质荷比为595。组分2与组分6的保留时间差约为16 min，与文献[26]中矢车菊素-3-O-半乳糖苷与矢车菊素-3-O-（6-（E）对香豆酸）吡喃半乳糖苷的保留时间相接近，根据文献[26,28]，则判定组分6为矢车菊素-3-O-（6-（E）对香豆酸）吡喃半乳糖苷。
2.2.7 ‘紫娟’茶各组分鉴定结果
表1 ‘紫娟’茶花色苷各成分鉴定结果Table1 Identification of6 anthocyanin components from ‘Zijuan’ tea leaves
‘紫娟’茶花色苷各分离成分经上述综合分析，得出各组分的分子结构结果见表1，结构式如图10、表2所示。
图10 ‘紫娟’茶鲜叶中花色苷的化学结构Fig.10 Structures of anthocyanins purified from ‘Zijuan’ fresh tea leaves
表2 ‘紫娟’茶鲜叶中分离出的6 种花色苷Table2 Six anthocyanins separated from ‘Zijuan’ fresh tea leaves
3 结 论
采用MCI gel CHP 20P（75～150 µm）树脂和SephadexTMLH-20葡聚糖凝胶柱对‘紫娟’茶花色苷分离纯化后，经HPLC和TLC分析，得到6 种主要的‘紫娟’茶花色苷成分，其HPLC相对含量分别达到96.75%、88.69%、91.07%、71.85%、95.97%、85.69%。将6 种‘紫娟’茶花色苷成分经HPLC-ESI-MS/MS分析，推断出这6 种‘紫娟’茶花色苷为飞燕草素-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-半乳糖苷、飞燕草素-3-O-（6-（Z）对香豆酸）吡喃半乳糖苷、矢车菊素-3-O-（6-（Z）对香豆酸）吡喃半乳糖苷、飞燕草素-3-O-（6-（E）对香豆酸）吡喃半乳糖苷、矢车菊素-3-O-（6-（E）对香豆酸）吡喃半乳糖苷。
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Separation and Identification of Anthocyanins from ‘Zijuan’ Tea Leaves
LI Yanli1,2, LUO Qiongxian3, YANG Xuemei1, ZHAN Qi1, LI Jiahua1,*
(1. College of Longrun Pu-erh Tea, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. Tea Industry Development Center of Meitan, Meitan 564100, China; 3. Tea Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Menghai 666201, China)
The anthocyanins from leaves of the tea cultivar ‘Zijuan’ were separated and purified by sequential column chromatography using MCI gel CHP 20P resin (75-150 µm) and SephadexTMLH-20, through gradient elution with 5% acidmethanol and 5% acid-water. A total of6 anthocyanins were separated from the purified extract, which were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC), thin layer chromatography (TLC) and HPLC-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). The results showed that the anthocyanins were identified a s delphinidin 3-O-β-D-galactoside, cyanidin 3-O-β-D-galactoside, delphinidin 3-O-β-D-(6-(Z)-p-coumaroyl)galactopyranoside, cyanidin 3-O-β-D-(6-(Z)-p-coumaroyl)galactopyranoside, delphinidin 3-O-β-D-(6-(E)-p-cou maroyl)galactopyranoside and cyanidin 3-O-β-D-(6-(E)-p-coumaroyl)galactopyranoside.
‘Zijuan’ tea; anthocyanin; separation and purification; high performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS); structure identification
10.7506/spkx1002-6630-201712019
TS272.2；Q946.8
A
1002-6630（2017）12-0125-06
李燕丽, 罗琼仙, 杨雪梅, 等. ‘紫娟’茶花色苷的分离鉴定[J]. 食品科学, 2017, 38(12)： 125-130.
10.7506/spkx1002-6630-201712019. http：//www.spkx.net.cn
LI Yanli, LUO Qiongxian, YANG Xuemei, et al. Separation and identification of anthocyanins from ‘Zijuan’ tea leaves[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 125-130. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712019. http：//www.spkx.net.cn
2016-05-20
国家自然科学基金地区科学基金项目（31360196）
李燕丽（1990—），女，硕士，研究方向为茶叶生物化学。E-mail：395352616@qq.com
*通信作者：李家华（1970—），男，教授，博士，研究方向为茶叶生物化学与功效。E-mail：1136475074@qq.com
