李娟娟，张丽珍,*，吕国涛，赵宇瑛，张劲松，王 楚，牛 宇
樱桃，作为落叶果树中成熟较早的水果，享有“早春第一果”的美誉。樱桃果酒营养丰富，含有酚类、花色苷、黄酮等多种营养成分，具有促进血液循环、抗氧化、健脑益气、抗病毒等多种生理功效[1-3]。酚类化合物对于樱桃酒的涩味和苦味的强弱具有很大的影响，可能会影响樱桃酒的感官品质和稳定性，花青素是天然色素，主要影响酒体的色泽[4-8]。樱桃果酒在其加工、运输和贮藏过程中常常引发浑浊、褐变和沉淀等问题，这对樱桃酒的感官品质具有重大的影响[9]。有研究证明红葡萄酒的浑浊主要是由于单宁酸和蛋白质结合形成了大分子聚合物，对葡萄酒的澄清度、感官品质有着重大的影响[10]。
目前在果酒加工中常用的下胶原料主要有皂土、壳聚糖、明胶、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP）和羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose sodium，CMC）等，但它们都存在一些缺点[11]。比如：当皂土用量超过一定范围后，澄清效果好但酒体明显淡薄[12]；壳聚糖对酚类物质的吸附作用和对金属离子的螯合作用，造成酒液涩味较轻、色泽较浅[13-14]；明胶、蛋清等动物蛋白对于人类的身体健康存在安全风险[15]。Granato等[16]研究结果表明小麦、豌豆、大豆等植物源蛋白应用于葡萄酒的澄清中不仅可以降低酒体的浊度、保持酒体的稳定性，而且具有安全、无毒、成本低等优点。
小麦蛋白中含谷蛋白、盐溶蛋白和醇溶蛋白，其中醇溶蛋白不溶于水，但溶于一定比例的乙醇溶液。为避免发生醇溶蛋白在酒体中析出而产生沉淀的现象，本研究将小麦蛋白经脱醇溶蛋白后制备小麦澄清蛋白，通过添加小麦澄清蛋白的方法澄清樱桃酒。测定樱桃酒澄清前后理化性质和稳定性的变化，并进一步与明胶、PVPP、CMC 3 种澄清剂的澄清效果相比，来分析小麦澄清蛋白的澄清效果。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
樱桃（品种‘红玛瑙’）采收于2016年6月15日，山西省农业科学院果树研究所提供；酿酒酵母 天津科技大学；小麦面粉 平陆县晴岚制粉有限公司；槲皮素（标准品，纯度≥98%） 北京世纪奥科生物技术有限公司；没食子酸（标准品） 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；福林-酚试剂 北京索莱宝科技有限公司；单宁酸、明胶、醋酸钠、KCl、盐酸、四氢呋喃（99%）、乙醇（95%）、硼氢化钠、AlCl3、Na2CO3、氯醌、乙酸、香草醛、甲醇、NaOH、正丙醇、2-巯基乙醇均为分析纯；实验中所用的水均为超纯水。
1.2 仪器与设备
ME 204电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；Infinite M200 PRO全波长多功能微孔板检测仪 帝肯（上海）贸易有限公司；SGZ-B系列便携式浊度计 上海悦丰仪器仪表有限公司；PAL-1手持糖度计 北京阳光亿事达贸易有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 江苏省金坛市环宇科学仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 实验指标的测定
浊度采用浊度仪测定；总糖质量分数采用手持糖度计检测；总酸质量浓度采用指示剂法测定，以酒石酸表示；pH值采用酸度计检测；总酚质量浓度采用福林-酚法[17-18]测定；色价值采用分光光度计测定；花色苷质量浓度采用pH示差法[19]测定；黄酮质量浓度采用硼氢化钠/氯醌法[20-21]测定；乙醇体积分数采用酒精计测定；单宁酸质量浓度采用Folin-Denis分光光度法测定。
1.3.2 小麦澄清蛋白和樱桃酒的制备
1.3.2.1 小麦澄清蛋白的制备
选择优质小麦面粉按料液比1∶5（m/V，下同）加正己烷进行脱脂脱色，室温振荡10 min，在4℃条件下7 000 r/min离心10 min，弃掉上清液，重复2 次。再按料液比1∶5加入0.5 mol/L NaCl溶液，摇匀后在4℃条件下5 000 r/min离心10 min，弃掉上清液。然后按料液比1∶7加入醇溶蛋白提取液，摇匀，4 ℃、9 000 r/min离心12 min，弃掉上清液。将所得沉淀于-35 ℃冰箱中预冷2 h后置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥8 h，所得白色固体粉末即为小麦澄清蛋白。准确称取2.0 g小麦澄清蛋白溶于100 mL超纯水中，备用。
1.3.2.2 樱桃酒的制备
采用酿酒酵母 AS2399进行发酵，参照吕国涛等[22]的方法进行制备。
1.3.3 浑浊成因分析
将单宁酸用0.02 mol/L（pH 3.7）磷酸盐缓冲液配成20 mg/L单宁酸溶液，与5～125 mg/L小麦澄清蛋白溶液建立蛋白质-多酚模拟体系[23-24]。将不同质量浓度的小麦澄清蛋白溶液与单宁酸溶液混合，在涡漩混合器上混合1 min，25 ℃恒温水浴保温1、4、14、24、36、60、128、168 h，分别测其浊度，3 次重复并求平均值。用樱桃酒代替单宁酸溶液，分别加入5、10、20、40、50、60、80、100、125 mg/L小麦澄清蛋白，在涡漩混合器上混合1 min，25℃水浴保温168 h，并检测樱桃酒澄清前、后的单宁酸质量浓度。
1.3.4 小麦澄清蛋白用量对樱桃酒浊度的影响
添加小麦澄清蛋白至樱桃酒中使其质量浓度分别为0、20、30、40、50、60、70 mg/L，混匀静置180 min后测其浊度。
1.3.5 搅拌速率对樱桃酒浊度的影响
樱桃酒中添加一定量的小麦澄清蛋白后，分别用700、800、900、1 000、1 100、1 200 r/min的速率搅拌，搅拌时间均为150 min，搅拌结束静置180 min后测定樱桃酒的浊度。
1.3.6 搅拌时间对樱桃酒浊度的影响
樱桃酒中添加一定量的小麦澄清蛋白后，分别搅拌45、60、90、120、150、180 min，搅拌速率均为800 r/min，搅拌结束静置180 min后测定樱桃酒的浊度。
1.3.7 不同澄清剂澄清效果的比较
添加小麦澄清蛋白、明胶、PVPP、CMC至樱桃酒中使其终质量浓度分别为50、300、300、200 mg/L， 混匀后分别在静置3、8、17、29、77、101、139、168 h后测其浊度，以不添加澄清剂作为空白组。
1.3.8 不同澄清剂对樱桃酒品质的影响
添加小麦澄清蛋白、明胶、PVPP、CMC至樱桃酒中使其终质量浓度分别为50、300、300、200 mg/L，混匀后分别再静置168 h后测其总糖质量分数、总酸质量浓度、pH值、色价值（樱桃酒在420、520、620 nm波长处的吸光度之和）、总酚质量浓度、花色苷质量浓度、黄酮质量浓度和乙醇体积分数，以不添加澄清剂作为空白组。
1.4 数据统计分析
所有处理均设置至少3 次重复，数据经SPSS 17.0软件进行方差分析，并用Duncan法进行两两比较分析，P＜0.05为差异显着。
2 结果与分析
2.1 小麦澄清蛋白的制备
小麦澄清蛋白得率为8 0%，其中总酚含量为21.12 mg/g，总黄酮含量为13.49 μg/g。
2.2 浑浊成因分析
图1 单宁酸与不同质量浓度的小麦澄清蛋白在不同时间下的浊度Fig. 1 Temporal change in turbidity of wheat proteins at different concentrations with tannic acid
由图1可知，随着小麦澄清蛋白质量浓度的增加，模拟体系的浊度呈先增加后减少的趋势，在小麦蛋白质量浓度为80 mg/L时，即小麦蛋白和单宁酸溶液浓度比为4∶1，浊度最大。说明当蛋白质和单宁酸溶液以一定的比例结合时，二者结合的聚合物最大，浊度最大；相反，当二者比例失调时，二者形成的聚合物减少，浊度下降，沉淀也减少。由此可知，蛋白质和酚类物质的比例对樱桃酒浑浊的形成具有重要的影响。
图2 樱桃酒在不同质量浓度小麦澄清蛋白处理后单宁酸的质量浓度Fig. 2 Effect of GFWPI concentration on tannin concentration of cherry wine
由图2可知，樱桃酒中单宁酸质量浓度随着小麦澄清蛋白质量浓度的变化而变化。未用小麦澄清蛋白处理的樱桃酒中，单宁酸质量浓度最高为4.31 mg/mL。加入60 mg/L的小麦澄清蛋白后酒体中单宁酸质量浓度最低，为3.25 mg/mL，这是因为在小麦澄清蛋白质量浓度为60 mg/L时，单宁酸与小麦澄清蛋白形成的大分子聚合物最多，致使酒体浊度最大，酒体中游离的单宁酸最少。说明用小麦澄清蛋白处理樱桃酒后，酒体中的单宁酸与小麦澄清蛋白以一定的比例结合，形成大量沉淀使酒体浑浊，单宁酸质量浓度降低。
2.3 小麦澄清蛋白用量对樱桃酒澄清效果的影响
图3 不同质量浓度的小麦澄清蛋白对澄清效果的影响Fig. 3 Effect of GFWPI concentration on turbidity of cherry wine
樱桃酒在添加不同质量浓度的小麦澄清蛋白，静置180 min后，其澄清效果见图3。与未添加小麦澄清蛋白相比，添加不同质量浓度小麦澄清蛋白均可以降低樱桃酒的浊度，说明小麦澄清蛋白是一种有效的澄清剂。添加小麦澄清蛋白质量浓度在0～40 mg/L时，樱桃酒的浊度缓慢降低，在50 mg/L时樱桃酒浊度显着下降，而在50～70 mg/L内其浊度又缓慢升高，说明随着小麦澄清蛋白质量浓度的变化，樱桃酒的浊度也随之变化。当小麦澄清蛋白质量浓度为50 mg/L时，樱桃酒的浊度最低。因此，小麦澄清蛋白的最佳用量为50 mg/L。
2.4 搅拌速率对樱桃酒澄清效果的影响
图4 搅拌速率对澄清效果的影响Fig. 4 Effect of stirring rate on turbidity of cherry wine
由图4可知，当搅拌速率在700～800 r/min变化时，浊度急剧降低，当搅拌速率为900 r/min时，浊度最低，而当搅拌速率在900～1 200 r/min间变化时，浊度缓慢上升。这是因为搅拌速率为900 r/min时，酚酸和蛋白质分子间的碰撞机会增加，使二者结合成大分子物质而沉降，此时樱桃酒的浊度最低，澄清效果最好。而当搅拌速率分别为800、900 r/min时，其浊度变化不大。因此，在保证节约能源和良好澄清效果的前提下，最佳搅拌速率可选择800 r/min。
2.5 搅拌时间对樱桃酒澄清效果的影响
图5 搅拌时间对樱桃酒浊度的影响Fig. 5 Effect of stirring time on turbidity of cherry wine
由图5可知，搅拌时间在40～60 min，浊度缓慢降低，在60～120 min浊度急剧下降，当搅拌时间为120 min时，其浊度最低，而搅拌时间在120～180 min时，浊度又缓慢升高。说明搅拌120 min后，可以增大酚酸和蛋白质分子间碰撞结合的几率，使大分子物质结合形成混合物，使酒体浑浊，浊度升高，此时澄清效果最好；而当超过一定时间时，分子间碰撞的几率减少使结合的大分子物质减少，浊度升高。因此，最佳搅拌时间为120 min。
2.6 不同澄清剂澄清效果的比较
由图6可知，在0～29 h，4 种澄清剂的澄清速率均非常快，且4 种澄清剂的澄清速率：小麦澄清蛋白＞PVPP＞明胶＞CMC。在29～168 h，4 种澄清剂的澄清速率均下降，其浊度在缓慢降低最终达到稳定。在同一时间内，经过小麦澄清蛋白处理的樱桃酒的浊度均低于其他3 种澄清剂处理后的浊度。此外，在29 h时，经过小麦蛋白处理的樱桃酒的浊度先于其他3 种澄清剂达到10 NTU，在139 h时率先达到最低浊度2.07 NTU。Simonato等[25]研究了玉米蛋白和明胶对红酒的澄清效果的影响，其测定的玉米蛋白的澄清效果比明胶好，与本实验中小麦澄清蛋白的澄清效果优于明胶保持一致。因此，与PVPP、明胶、CMC 3 种澄清剂相比，小麦澄清蛋白有着澄清速率快、时间短、澄清效果好的明显优势。
图6 不同澄清剂处理后的樱桃酒在不同静置时间内浊度的变化Fig. 6 Temporal change in turbidity of ベned cherry wine
2.7 不同澄清剂对樱桃酒品质的比较
表1 不同澄清剂处理后樱桃果酒指标的变化Table 1 Comparison of physicochemical properties of cherry wine treated with different clarifying agents
用小麦澄清蛋白、PVPP、明胶、CMC 4 种澄清剂处理樱桃酒，静置168 h后理化和稳定性相关指标见表1。樱桃酒用4 种澄清剂处理后，乙醇体积分数差异不显着（P＞0.05），花色苷质量浓度差异显着；用CMC处理樱桃酒后的pH值与用小麦澄清蛋白和空白组差异不显着，与PVPP、明胶处理之间差异显着；用明胶、PVPP作澄清剂，二者总酸质量浓度差异不显着，但与用CMC、小麦澄清蛋白、空白组差异显着；小麦澄清蛋白处理樱桃酒后总酚质量浓度与空白组差异不显着，但与明胶、CMC、PVPP作澄清剂相比差异显着；明胶处理樱桃酒后的色价值与空白组差异不显着，但与小麦澄清蛋白、CMC、PVPP作澄清剂相比差异显着；用PVPP作澄清剂，与空白组和小麦澄清蛋白、明胶、CMC作澄清剂相比，黄酮质量浓度存在显着差异。由表1还可得出，乙醇体积分数与pH值均无显着变化；总糖质量分数和总酸质量浓度与空白组相比，差异显着。用明胶作澄清剂，樱桃酒中总酚减少量最多，减少35.37 mg/L；用PVPP作澄清剂，色价值降低最高，降低0.30；用CMC作澄清剂，花色苷质量浓度减少最多，减少0.49 mg/L。用50 mg/L的小麦澄清蛋白处理樱桃酒后，其总酚质量浓度与澄清前相比，不存在显着性差异（P＞0.05），主要是因为小麦澄清蛋白与单宁酸相互作用形成沉淀使总酚质量浓度减少，而加入的小麦澄清蛋白中含有少量酚酸物质，使得酒体中总酚质量浓度变化无显着差异（P＞0.05）。用50 mg/L的小麦澄清蛋白处理的樱桃酒中，黄酮质量浓度略微增加，这是由于樱桃酒在贮存期间黄酮类物质会发生辅色作用、氧化、聚合等多种复杂反应[26]，而加入的小麦澄清蛋白中含有少量黄酮，最终导致黄酮质量浓度小幅度增加。
3 讨 论
本实验通过建立小麦澄清蛋白-单宁酸模拟体系的致浊成因实验，发现当二者以浓度比4∶1存在时可形成大分子聚合物，形成沉淀使酒体浊度降低从而达到澄清樱桃酒的目的。这与黄惠华等[27]提出啤酒、白酒、果汁浑浊的主要原因是蛋白质与多酚的相互作用一致；乔翠红等[28]研究发现蛋白与多酚以一定比例存在时可导致酒体浑浊；Siebert等[29]研究的啤酒浑浊的主要原因是由于酚类物质与蛋白质结合成大分子物质，导致酒体浑浊的结论保持一致。樱桃酒浑浊主要是由于酒体中多酚类化合物和蛋白质按一定比例结合成大分子物质，形成了沉淀。
本实验对樱桃酒进行澄清处理后，发现当小麦澄清蛋白质量浓度为50 mg/L时，酒体的浊度最低，为2.07 NTU，浊度降低了71.64%（空白组处理后浊度为7.30 NTU），澄清效果较优。Granato等[16]分别利用扁豆蛋白、豌豆蛋白、大豆蛋白、谷朊蛋白处理葡萄酒，其酒体的浊度分别降低了16%、18%、26%、28%。小麦澄清蛋白处理樱桃酒后，对其pH值、乙醇体积分数的影响较小。用50 mg/L的小麦澄清蛋白处理樱桃酒后，其总酚质量浓度与澄清前相比，减少了0.79 mg/L，主要是因为小麦澄清蛋白与单宁酸相互作用形成沉淀使总酚质量浓度减少，而加入的小麦澄清蛋白中也含有酚酸物质，最终导致总酚质量浓度变化不大。屈慧鸽[30]研究了小麦谷朊蛋白对霞多丽葡萄汁的澄清效果，其测定的葡萄汁总酚含量在澄清后降低了18.2%。本实验中总酚质量浓度降低不足1%，原因可能是葡萄汁和樱桃酒中酚类物质的种类不同。
小麦澄清蛋白处理樱桃酒的最佳条件为：小麦澄清蛋白的用量为50 mg/L，搅拌速率为800 r/min，搅拌时间为120 min。与明胶、PVPP、CMC 3 种澄清剂相比，发现樱桃酒在29 h时经过小麦澄清蛋白处理后，浊度先于其他3 种澄清剂达到10 NTU，在139 h率先达到最低浊度2.07 NTU。Guerrero等[10]用从葡萄皮和苹果皮提取的纤维素处理红酒，静置17 d后，其浊度在0～3 NTU变动，与本实验中相比，小麦澄清蛋白的澄清效果较优，澄清速率较快，所用时间较短。
综上所述，将制备的小麦澄清蛋白作为一种果酒澄清剂，不仅安全、无毒、成本低、来源广，而且澄清速率快、效果好、时间短，且可最大程度地保持樱桃酒的品质和营养物质，可广泛用于樱桃酒的工业生产和贮藏中。
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