侯艳茹，马晓冰，苏 琳，赵雅娟，罗玉龙，赵丽华，靳 烨*
（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018）
苏尼特羊是内蒙古地区优秀的肉羊种群，其肉质具有细嫩、味美多汁、易消化等特点，受到广大消费者的喜爱[1]。饲养方式是影响肉品品质的重要因素，Fluharty等[2]的研究表明，合理的舍饲育肥能够提高动物的生长育肥性能，还可以改善肉质。本团队研究发现，放牧条件下苏尼特羊肉的色泽和嫩度都优于圈养条件，且营养成分更丰富[3-4]，这说明饲养方式对肉品品质有所影响。一磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是蛋白激酶级联的下游组件，属于代谢敏感的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其主要功能是根据机体的能量需求调节整个机体的能量平衡[5-6]。AMPK能够调节机体的糖代谢，糖酵解是引起动物宰后肌肉pH值下降的主要原因，而动物宰后的pH值变化速度与幅度可以影响肌肉的色泽、嫩度、系水力、蒸煮损失等品质指标[7-9]，所以动物宰后糖酵解的程度直接影响肉质的好坏。饲养方式会对肉品品质产生影响，而AMPK能够通过调节动物宰后糖酵解的程度而影响肉质。所以，研究饲养方式对动物宰后AMPK活性以及糖酵解指标的影响，通过调控AMPK的活性来改变糖酵解的进程进而影响肉质，无疑是改善肉品品质的新思路。
本研究以不同饲养条件下（放牧和圈养）12 月龄苏尼特羊背最长肌为实验材料，对AMPK活力、AMPK基因mRNA相对表达量以及糖酵解指标进行测定，并分析了AMPK与糖酵解指标之间的相关性，旨在为通过调控AMPK活性改善宰后肉品品质提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
选取来自内蒙古巴彦淖尔市海流图镇12 月龄苏尼特羊放牧和圈养各10 只，其中每种饲养方式公母各半，体质量（43.56±6.24）kg，胴体质量（21.29±4.69）kg。宰后1 h内取背最长肌，切成100 mg小块，立即放入无酶无菌冻存管中，投入液氮中冷冻保存，然后置于-80 ℃冰箱中，作为实验用材料。
RNAiso Plus RNA提取裂解液、PrimeScriptTMRT reagent Kit反转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM实时荧光定量试剂盒 大连宝生物工程有限公司；DNase/RNase-free无菌水 北京天根生物技术有限责任公司；绵羊磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）酶联免疫吸附检测试剂盒、己糖激酶测定试剂盒、乳酸测定试剂盒、肌/肝糖原测定试剂盒、总蛋白定量测定试剂盒（二喹啉甲酸比色法） 南京建成生物工程研究所；Tris-HCl缓冲液、D-甘露醇 美国Amresco公司；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid，EGTA） 美国Sigma公司；二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT） 德国Merck公司；氟化钠、焦磷酸钠 天津永大化学试剂厂；浓硫酸、氯化钠国药集团化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
pH-STAR型胴体pH值直测仪 德国Matthaus公司；TC-P2A全自动测色色差计 上海生物生化实验仪器公司；CL-M嫩度仪 上海精密科学仪器有限公司；5417R低温台式冷冻离心机 德国Eppendorf生物公司；CFX96TM实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、凝胶成像分析系统 美国Bio-Rad公司；BG-power 3500型稳压稳流电泳仪、水平电泳槽北京百晶生物技术有限公司；PCR扩增仪 北京北方华奥贸易有限责任公司；TU-1810紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；LRH-250生化培养箱上海一恒科学仪器有限公司；XHF-DY高速分散器宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 AMPK的活力测定
取保存于-80 ℃冰箱的样品约0.3 g，按照1∶5（m/V）的比例加入保存于4 ℃冰箱的冷冻匀浆液（0.25 mol/L的D-甘露糖、5 mmol/L的焦磷酸钠、0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）、1 mmol/L的DTT、1 mmol/L的EGTA、1 mmol/L的EDTA、50 mmol/L的氟化钠），在3 000 r/min的条件下冰浴匀浆。4 ℃、10 000 r/min冷冻离心5 min，取上清液用于AMPK活力的测定。AMPK活力的测定步骤以及计算参照绵羊p-AMPK酶联免疫检测试剂盒说明书进行。
1.3.2 AMPK基因相对表达量的测定
1.3.2.1 总RNA的提取及检测
依据RNAiso Plus试剂盒的说明书对肌肉中总RNA进行提取[10]。将提取的总RNA置于核酸蛋白分析仪上检测其质量浓度和纯度（A260nm/A280nm）。并用1%（质量分数，下同）的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的总RNA的完整性。
1.3.2.2 反转录
按照反转录试剂盒说明书进行反转录操作，将合成的cDNA质量浓度稀释至50 ng/μL。将反转录得到的产物置于-20 ℃冰箱中保存备用[11]。
1.3.2.3 引物序列来源及合成
PRKAA1、PRKAA2、PRKAG3以及GAPDH（内参基因）基因引物序列参照马晓冰的设计[12]，由华大科技基因有限公司合成（表1）。
表1 实时荧光PCR引物序列Table 1 Primers used for real-time PCR
1.3.2.4 实时荧光PCR扩增
本实验按照CFX96TM实时荧光PCR检测系统的二步法进行操作。以1.3.2.2节所合成的cDNA为模板，使用实时荧光定量试剂盒进行实时荧光PCR扩增[11]。反应体系为：SYBR Premix Ex Taq II（2×）12.5 µL；上、下游引物（10 µmol/L）各1.0 µL；DNA模板（50 ng/μL）2.0 µL；dH2O 8.5 µL；共25.0 µL。实时荧光PCR条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环；72 ℃延伸10min。产物保存于4 ℃冰箱。
1.3.2.5 实时荧光PCR产物检测
使用1%的琼脂糖凝胶电泳，在120 V的电压下进行电泳检测，使用凝胶成像仪拍照分析。
1.3.2.6 基因相对表达量的计算
本实验采用2−ΔΔCt计算法对实时荧光定量PCR数据进行处理和分析，2−ΔΔCt为相对表达量，ΔΔCt＝（处理组目的基因Ct值-处理组内参基因Ct值）-（未处理组目的基因Ct值-未处理组内参基因Ct值）[13]。
1.3.3 糖酵解指标的测定
己糖激酶活力的测定按照己糖激酶测定试剂盒的说明书进行操作；乳酸含量的测定按照乳酸测定试剂盒的说明书进行操作；肌糖原含量测定按照肝/肌糖原测定试剂盒的说明书进行操作。
1.3.4 肉品品质相关指标的测定
1.3.4.1 pH值的测定
在屠宰后45 min时，使用胴体直测式pH计测胴体初pH值，记为pH1；静置排酸24 h后测胴体最终pH值，记为pH24。
1.3.4.2 色泽的测定
使用TC-P2A全自动色差仪对肉色进行测定，L*值表示亮度，b*值为黄度，a*值表示红度。每个样品选取3 个位置，重复测定后取平均值。
1.3.4.3 嫩度的测定
沿肌肉方向取2.5 cm×3.0 cm×5.0 cm的肌肉块，用自封袋密封后水浴加热（75 ℃、45 min），冷却至室温后沿着肌纤维的方向将肉块切成3 cm×1 cm×1 cm的条状，使用CLM-3型嫩度仪对剪切力值进行测定。
1.4 数据统计分析
利用SPSS 19.0数据分析软件进行统计分析，所有数值以表示。以P＜0.05表示差异显着。
2 结果与分析
2.1 饲养方式对肉质指标的影响
表2 不同饲养方式下的肉质指标（n＝10）Table 2 Meat traits under different feeding conditions (n= 10)
由表2可知，放牧条件下苏尼特羊背最长肌的剪切力值显着大于圈养条件（P＜0.05），这可能与不同饲养方式下骨骼肌肌纤维的发育、肌肉脂肪的含量以及水分含量有关[3,14]。放牧条件下苏尼特羊背最长肌的L*值、a*值以及b*值均大于圈养条件，其中L*值和b*值差异显着（P＜0.05）。两种饲养方式的pH1值和pH24值差异不显着（P＞0.05），研究表明不同饲养方式下18 月龄卫山羊羯羊的pH24值差异不显着[15]，与本实验结果一致，这可能是因为pH值还受到其他因素的共同影响。
2.2 饲养方式对苏尼特羊AMPK活力和基因相对表达量的影响
2.2.1 饲养方式对AMPK活力的影响
本实验用AMPK磷酸化水平代表AMPK活力，不同饲养方式12 月龄苏尼特羊背最长肌的AMPK活力分别为：放牧条件（8.83±1.07）ng/mL、圈养条件（9.51±1.30）ng/mL。结果表明，放牧条件下苏尼特羊AMPK活力低于圈养条件下，但两种饲养方式差异不显着。AMPK活力会受到运动、缺氧、缺血、应激等多种因素的影响[16-18]，圈养条件下，苏尼特羊背最长肌AMPK活力高于放牧条件，推测原因可能是由于圈养的羊和放牧的羊相比，宰前应激反应比较大，导致AMPK的活力升高。但两种饲养方式AMPK活力差异不显着（P＞0.05），说明饲养方式对AMPK活力影响较小。
2.2.2 AMPK基因相对表达量测定结果
2.2.2.1 总RNA提取结果
背最长肌肌肉组织中提取的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像结果如图1所示（以其中3 个样品为例）。
图1 总RNA电泳图Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA
如图1所示，提取的总RNA 3 条条带（28S、18S、5S）完整且清晰明亮，说明所提取的总RNA并无降解。经核酸蛋白分析仪检测，A260nm/A280nm均在1.8～2.1之间，说明提取的总RNA的纯度高，并未被污染，可用于后续的反转录实验。
2.2.2.2 实时荧光PCR产物结果
图2 各基因PCR产物电泳图Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of the genes
内参基因和各目的基因经实时荧光PCR反应后，得到大量扩增产物，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，凝胶成像结果如图2所示。图中4 个基因的条带单一且清晰明亮，说明经PCR反应后得到的扩增产物单一，没有引物二聚体和非特异性产物，将目的基因的片段与DL1000 DNA Marker比较，其条带大小与所设计的引物目的产物片段大小相一致，说明所设计的引物反应性能良好，符合实时荧光PCR实验要求，经实时荧光PCR后的产物为本实验所需产物。
2.2.2.3 AMPK基因表达规律
AMPK以异源三聚体的形式存在于生物体中，由α、β、γ3 种亚基构成，其中α是催化亚基，β和γ是调节亚基[19]。每个亚基又存在不同的亚型，如α1和α2，β1和β2，γ1、γ2和γ3[20]。由于α是催化亚基，所以目前对AMPK α1和α2这两个亚基的功能等方面的相关研究比较多，因为γ3亚基在骨骼肌中具有高表达[21]，且有研究表明PRKAG3基因与糖代谢有关[22-23]，所以本实验选择分别编码α1、α2和γ3亚基的PRKAA1、PRKAA2和PRKAG3基因来分析AMPK的mRNA相对表达量。不同饲养方式下苏尼特羊的PRKAA1、PRKAA2以及PRKAG3基因相对表达量如图3所示。
图3 AMPK部分亚基基因表达水平Fig. 3 Gene expression of some subunits of AMPK
如图3所示，不同饲养条件下，苏尼特羊PRKAA1和PRKAG3基因的相对表达量均为圈养条件高于放牧条件，且差异显着（P＜0.05），而PRKAA2基因相对表达量为放牧条件显着大于圈养条件（P＜0.05）。AMPK α1亚基主要在脂肪细胞中表达[24]，由于圈养苏尼特羊比放牧苏尼特羊含有更多的脂肪组织，这可能导致编码AMPK α1亚基的PRKAA1的相对表达量增高。研究表明耐力训练会导致AMPK α2亚基蛋白和基因相对表达量显着增加[25]。较圈养羊而言，放牧的苏尼特羊处于长期运动的生长状况下，可能会导致编码AMPK α2亚基的PRKAA2基因相对表达量显着增加。放牧条件PRKAG3基因相对表达量显着小于圈养条件，可能是由于PRKAG3基因在ⅡB型肌纤维中表达量较高[26]，而圈养条件下苏尼特羊背最长肌的ⅡB型肌纤维数量要高于放牧条件[3]。以上结果表明，饲养方式对AMPK的基因相对表达量有显着影响。
2.3 饲养方式对苏尼特羊宰后糖酵解指标的影响
表3 不同饲养方式糖酵解指标（n＝10）Table 3 Glycolysis indicators under different feeding conditions (n= 10)
不同饲养条件下苏尼特羊背最长肌宰后糖酵解指标测定结果如表3所示，苏尼特羊背最长肌己糖激酶的活力为圈养条件高于放牧条件，但两种饲养方式差异不显着（P＞0.05）；乳酸含量也为圈养条件大于放牧条件，且差异显着（P＜0.05）；放牧条件下肌糖原含量高于圈养条件，但差异不显着（P＞0.05）。不同饲养方式会对AMPK的活力以及基因相对表达量有所影响，研究表明AMPK活力会进一步影响糖酵解指标[27]，这就造成了糖酵解指标在不同饲养方式下的差异。
2.4 AMPK与糖酵解指标及肉品品质的相关性
2.4.1 AMPK活力与糖酵解指标及肉品品质的相关性
表4 AMPK活力与糖酵解指标及肉品质的相关性Table 4 Correlation coefficients between relative AMPK activity and glycolysis indices and meat quality
由表4可知，AMPK活力与己糖激酶活力以及乳酸含量均呈显着正相关（P＜0.05），与肌糖原含量相关程度很低（P＞0.05），与剪切力、色泽以及pH值均呈负相关（P＜0.05）。Shen Qingwu W.等[28]向小鼠体内腹腔注射AMPK的抑制剂——复合物C，研究显示复合物C抑制了宰后小鼠背最长肌中AMPK的活力以及糖酵解进程。这说明AMPK可以调控宰后动物肌肉的糖酵解。
2.4.2 AMPK基因相对表达量与AMPK活力、糖酵解指标以及肉品品质的相关性
表5 AMPK基因相对表达量与AMPK活力、糖酵解指标及肉品质的相关性Table 5 Correlation coefficients between relative expression of AMPK gene and AMPK activity, glycolysis and meat quality
由表5可知，PRKAA1、PRKAA2和PRKAG3基因相对表达量均与AMPK活力呈正相关，其中PRKAG3基因相对表达量均与AMPK活力呈显着正相关（P＜0.05），说明这3 个基因的相对表达量与AMPK活力变化趋势相一致。PRKAA1和PRKAG3基因相对表达量与己糖激酶活力呈正相关，其中PRKAG3基因相对表达量与己糖激酶活力呈显着正相关（P＜0.05），而PRKAA2基因相对表达量与己糖激酶活力呈负相关，但相关程度较低。PRKAA1和PRKAG3基因相对表达量均与乳酸含量呈显着正相关（P＜0.05）。3 个基因的相对表达量与肌糖原含量均呈负相关，但相关程度较低。PRKAG3基因相对表达量与剪切力呈显着负相关（P＜0.05），有研究对PRKAG3基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）关联性进行分析，表明T2885C这个SNP与剪切力有密切的联系，可以作为未来肉牛选育的辅助标记[29]，这说明PRKAG3基因的相对表达量对肌肉的嫩度有所影响。
以上结果表明，PRKAA1和PRKAG3基因的相对表达量对糖酵解指标有一定的影响，而PRKAA2基因的相对表达量对糖酵解指标影响较小，即AMPK α1亚基和AMPK γ3亚基在机体内相对表达量高时，AMPK活力增加，AMPK活化后促使糖酵解的关键酶己糖激酶的活力增加，从而加速动物宰后糖酵解的进程，使得乳酸大量堆积。乳酸是影响动物宰后pH值的重要因素，pH值又是影响肉品品质的关键指标，这说明AMPK可以通过调控动物宰后糖酵解的进程从而对肉品品质产生影响。也有相关研究表明不同条件下肉质会发生改变，可能是由于AMPK对糖酵解的关键酶己糖激酶、果胶酯酶和乳酸脱氢酶活力的调节，进而改变了糖酵解的速率和程度，最终对肉品品质产生影响[30-31]。
3 结 论
通过对苏尼特羊放牧和圈养两种方式下AMPK活力、AMPK mRNA相对表达量以及糖酵解指标进行测定，发现圈养条件下PRKAA1以及PRKAG3基因表达均显着高于放牧条件，并且AMPK的活力、己糖激酶活力和乳酸含量也高于放牧条件。说明PRKAA1以及PRKAG3基因相对表达量升高会使AMPK的活力增加，AMPK被激活后直接磷酸化糖酵解通路中的关键酶己糖激酶，使己糖激酶活力增加，从而促进糖酵解进程，产生大量乳酸，导致宰后动物肌肉的pH值下降，对肉品品质产生一定影响。因此，未来可通过调控AMPK的活力以改善不同饲养方式下的肉质。
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